基于質(zhì)譜特征碎裂片段的巴氏殺菌乳中氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物非定向篩查方法構(gòu)建

樊成，王新，鄒力，范芳芳，賈瑋*

（1.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048）（2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）

近年來(lái)，乳及乳制品消費(fèi)量持續(xù)增長(zhǎng)，奶牛規(guī)模化養(yǎng)殖迅猛發(fā)展。乳品工業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈各環(huán)節(jié)間聯(lián)系密切，從農(nóng)田到餐桌的全過(guò)程均影響乳品品質(zhì)[1]，涵蓋飼料種植、奶牛養(yǎng)殖、乳制品加工、終端銷售[2]等多個(gè)環(huán)節(jié)。環(huán)境富集[3]與動(dòng)植物傳遞[4]是農(nóng)藥殘留污染的主要來(lái)源。氯化煙堿類藥物含有硝基亞甲基雜環(huán)結(jié)構(gòu)[5]，具有顯著的殺蟲(chóng)活性，選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)[6]，被廣泛用于動(dòng)物飼料種植培養(yǎng)中，其原藥及其代謝物最終通過(guò)生物富集作用轉(zhuǎn)移到原料乳中[7]。

動(dòng)物源性食品中氯化煙堿類藥物的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[8]等。目前，我國(guó)頒布的《GB/T 20772-2008 動(dòng)物肌肉中461種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》內(nèi)包含有氯化煙堿類藥物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)乳制品中氯化煙堿類藥物的準(zhǔn)確定量，但僅關(guān)注氯化煙堿類藥物的分析，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)其代謝產(chǎn)物的高通量定性定量分析。非定向篩查技術(shù)是基于靜電場(chǎng)高分辨質(zhì)譜可變的數(shù)據(jù)非依賴掃描（Varible data independent acquistition，vDIA）模式，根據(jù)目標(biāo)分析物所分布的質(zhì)荷比（m/z）范圍，動(dòng)態(tài)調(diào)整隔離窗口范圍，具有高選擇性、掃描速度快的特點(diǎn)[9]。非定向技術(shù)旨在鑒定及篩選分析物中未知化合物，實(shí)現(xiàn)海量數(shù)據(jù)的高通量分析，可實(shí)現(xiàn)乳制品中氯化煙堿類藥物及其代謝物分析。

本研究利用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜技術(shù)，在數(shù)據(jù)依賴掃描模式下建立12種氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)將氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物特征碎裂片段應(yīng)用于巴氏殺菌乳非定向藥物篩查技術(shù)中，使用數(shù)據(jù)非依賴掃描模式對(duì)實(shí)際分析樣品進(jìn)行非定向篩查，實(shí)現(xiàn)了巴氏殺菌乳中12種氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物殘留的高通量非定向篩查，本方法的建立為風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

LC-MS級(jí)乙酸銨、甲酸、甲酸銨、乙腈、冰醋酸均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；無(wú)水硫酸鎂（優(yōu)級(jí)純），醋酸鈉，0.45 μm PVDF濾膜；噻蟲(chóng)胺、噻蟲(chóng)嗪、吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒、五羥基吡蟲(chóng)啉、呋蟲(chóng)胺、吡蟲(chóng)啉尿素、啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-4(IM-1-4)、啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-2(IM-1-2)、呋蟲(chóng)胺-代謝物-UF(UF)、啶蟲(chóng)脒-代謝物-6-氟煙酸(6-Chloronicotinic acid)、啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-2-1(IM-2-1)共12種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于95%）購(gòu)自德國(guó)Sigma-Aldrich公司及德國(guó)Dr.Erenstofer公司。稱取12種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0.1 mg），放置于10 mL容量瓶中，依據(jù)12種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品在三種溶劑（乙腈、正己烷和丙酮）中的溶解度，選擇相應(yīng)的溶劑溶解并定容至10 mL，配制成濃度為1 mg/mL的單一化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-20 ℃下避光保存。然后移取單一化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈-水溶液（1:1，V/V）稀釋、定容至刻度，配制成濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液，于棕色密閉瓶-20 ℃避光保存。用基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，取12份牛乳空白樣品提取液各5 mL于10 mL容量瓶中，采用真空氮?dú)獯蹈蓛x吹至近干后，分別加入氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液10 μL、20 μL、40 μL、80 μL、100 μL、200 μL、400 μL、800 μL、1000 μL、2000 μL、4000 μL、5000 μL于容量瓶中，各加入乙腈5 mL后，用8 mmol/L甲酸銨水溶液定容，配制成10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L、800 μg/L、1000 μg/L、2000 μg/L、4000 μg/L、5000 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，實(shí)驗(yàn)所用所有標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜（配備有電噴霧離子源），美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Thermo Hypersil Gold C18、C8色譜柱與Accucore aQ色譜柱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Avnti J-26×PI型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；調(diào)速多用振蕩器、Vortex.Genie 2T型旋渦混合器，美國(guó)Scientific Industries公司。

1.3 樣品前處理

稱取巴氏殺菌乳10 g（精確至0.01 g），于50 mL離心管中，加入15 mL 1%乙酸乙腈（V/V）溶液，渦旋混合30 s后加入5.0 g無(wú)水硫酸鎂、1.5 g乙酸鈉，渦旋30 s后振蕩提取1 min，在3000 r/min下離心3 min（4 ℃）。取上清液至15 mL聚丙烯離心管中，加入900 mg MgSO4、300 mg PSA和150 mg C18，渦旋30 s后以3000 r/min離心10 min，取250 μL提取液以0.1 mol/L乙酸銨1:1（V/V）稀釋，經(jīng)0.45 μm PVDF濾膜過(guò)濾，運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil Gold C 18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）與UHPLC保護(hù)柱Accucore aQ（10 mm×2.1 mm，2.6 μm，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。柱溫35 ℃。流動(dòng)相為水+0.1%甲酸+4 mmol/L甲酸銨（A）與甲醇+0.1%甲酸+4 mmol/L甲酸銨（B）。梯度洗脫程序：0 min，100% A；1～7 min，100% A～0% A；12～13 min，0% A～100% A；13～15 min，100% A，流速為0.3 mL/min。碰撞氣：高純氮?dú)猓兌取?9.999%），電噴霧（ESI）離子源，化合物測(cè)定采用正模式，鞘氣流速60 arb，輔助氣流速30 arb，氣簾氣流速2 arb，噴霧電壓3.5 kV，離子源溫度50 ℃，毛細(xì)管溫度350 ℃，加熱溫度350 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜掃描方式為全掃描/數(shù)據(jù)非依賴掃描。全掃描（Full MS）模式下，分辨率為70,000 FWHM，自動(dòng)增益控制目標(biāo)值（AGC）設(shè)為3.0×106。二級(jí)掃描模式為可變的數(shù)據(jù)非依賴采集（vDIA），掃描時(shí)間為0 min～15 min，分辨率采用17,500 FWHM，最大注入時(shí)間為120 ms，自動(dòng)增益控制的目標(biāo)值設(shè)為1.0×106，信息列表分為：125.00000、175.00000、225.00000、275.00000、325.00000、375.00000、425.00000、475.00000、550.00000、650.00000、750.00000、850.00000、950.00000，其中125.00000～475.00000設(shè)定為第一個(gè)vDIA掃描，隔離窗口范圍設(shè)為52.0m/z，Loop Count設(shè)定為8（即8個(gè)掃描段），550.00000～950.00000設(shè)為第二個(gè)vDIA掃描，隔離窗口范圍設(shè)為104.0m/z，Loop Count設(shè)定為5。碰撞能量分別為15.0 eV、30.0 eV、45.0 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究考察了Hypersil Gold系列中3種不同選擇性的aQ、C8和C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），三種色譜柱都是將長(zhǎng)鏈烷基鍵合于多孔硅膠表面。實(shí)驗(yàn)中啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-4（IM-1-4）、啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-2（IM-1-2）、呋蟲(chóng)胺-代謝物-UF（UF）、啶蟲(chóng)脒-代謝物-6-氟煙酸（6-Chloronicotinic acid）、啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-2-1（IM-2-1）、啶蟲(chóng)脒（Acetamiprid）的加標(biāo)濃度為10 μg/kg，以巴氏殺菌乳為基質(zhì)，樣品按照1.3前處理后，考察目標(biāo)化合物峰面積。Hypersil Gold C 8為中等極性色譜柱，載碳量為8%，疏水性弱于C18烷基鏈鍵合相的色譜柱，對(duì)于啶蟲(chóng)脒-代謝物-6-氟煙酸、啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-2-1和啶蟲(chóng)脒等中度疏水性化合物保留能力強(qiáng)，對(duì)啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-4、啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-2和呋蟲(chóng)胺-代謝物-UF等極性較強(qiáng)的農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物保留能力較弱。aQ極性官能團(tuán)封端使得啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-4與啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-2等極性化合物具有較強(qiáng)的分離和保留能力，協(xié)同機(jī)制與次級(jí)相互作用確保了不同農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物均有較好的峰形（圖1a）。

圖1 6種農(nóng)藥經(jīng)不同色譜柱與流動(dòng)相分離的色譜峰響應(yīng)值Fig.1 Peak response values of six pesticides separated by different chromatographic columns and mobile phases (n=6)

依次以乙腈-水、甲醇-水作為流動(dòng)相考察目標(biāo)化合物的分離度、峰形及響應(yīng)值（圖1b），以啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-4、啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-2、呋蟲(chóng)胺-代謝物-UF、啶蟲(chóng)脒-代謝物-6-氟煙酸、啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-2-1、啶蟲(chóng)脒為例，加標(biāo)濃度為10 μg/kg，以巴氏殺菌乳為基質(zhì)，甲醇的介電常數(shù)及發(fā)生的電荷轉(zhuǎn)移高于乙腈，因此離子化效率較高，以甲醇-水為流動(dòng)相的離子化效率優(yōu)于乙腈-水流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)比對(duì)了六種不同流動(dòng)相緩沖體系的分離效果，分別為0.05%（V/V）甲酸量和3 mmol/L甲酸銨鹽量（pH=3.19），0.05%（V/V）甲酸量和4 mmol/L甲酸銨鹽量（pH=3.27），0.1%（V/V）甲酸量和3 mmol/L甲酸銨鹽量（pH=2.93），0.1%（V/V）甲酸量和4 mmol/L甲酸銨鹽量（pH=3.01），0.2%（V/V）甲酸量和3 mmol/L甲酸銨鹽量（pH=2.70），0.2%（V/V）甲酸量和4 mmol/L甲酸銨鹽量（pH=2.76），如圖2所示甲醇-水流動(dòng)相在0.1%（V/V）甲酸量和4 mmol/L甲酸銨鹽量時(shí)（pH=3.01）獲得最佳分離效果。確定以0.1%（V/V）甲酸-4 mmol/L甲酸銨水溶液和0.1%（V/V）甲酸-4 mmol/L甲酸銨甲醇溶液為流動(dòng)相。

圖2 12種氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物提取離子流色譜圖Fig.2 Ion flow chromatogram of 12 kinds of chloronicotinoids and their metabolites

2.2 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

逐級(jí)稀釋氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)溶液至300 μg/L，平行進(jìn)樣分析6次，以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的重現(xiàn)性與準(zhǔn)確性。首先運(yùn)用Full MS/dd-MS2數(shù)據(jù)依賴監(jiān)測(cè)模式采集氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的全掃描與二級(jí)碎裂譜圖。數(shù)據(jù)依賴掃描監(jiān)測(cè)模式下1秒內(nèi)實(shí)現(xiàn)3次掃描，信息列表中包括氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物的色譜保留時(shí)間與質(zhì)譜質(zhì)荷比，設(shè)置二級(jí)碎裂容許質(zhì)量誤差閾值范圍為10 ppm，若一級(jí)全掃描的目標(biāo)化合物提取流色譜圖離子響應(yīng)強(qiáng)度高于8.3×104閾值，或該色譜峰在3 s～6 s（Apex Trigger 3 s～6 s）內(nèi)響應(yīng)強(qiáng)度下降，即將該目標(biāo)分子離子推送至碰撞池，通過(guò)低（15 eV）、中（30 eV）、高（45 eV）三種不同碰撞能量進(jìn)行裂解，不同能級(jí)質(zhì)譜信息疊加后得到一張標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)裂解離子譜圖。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)包括色譜保留時(shí)間、全掃描及二級(jí)片段質(zhì)荷比、碎裂片段豐度比與同位素豐度比等信息?；诿糠N氯化煙堿類藥物的碎裂途徑以及各自離子碎片間的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度，選擇離子信號(hào)強(qiáng)度比大于10%來(lái)區(qū)分同類分析物的二級(jí)碎片作為定量信息（表1）?；趯?shí)測(cè)碎裂信息與理論裂解途徑的分析結(jié)果，構(gòu)建氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，包含了不同離子模式下多種加合物形式（[M+H]+、[M-H]-、[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+HCOO]）36張譜圖信息（表1）。在進(jìn)行巴氏殺菌乳中氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物非定向篩查時(shí)，應(yīng)用mzClound與TraceFinder對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行管理，選擇Compound Discover對(duì)所采集樣品進(jìn)行背景扣除、峰提取與對(duì)齊、質(zhì)譜信息匹配識(shí)別。

2.3 碎裂片段特征及其在氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物篩查中的應(yīng)用

2.3.1 碎裂途徑與機(jī)理研究

實(shí)驗(yàn)中對(duì)12種氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了碎裂片段機(jī)理研究，得到了所有質(zhì)譜碎裂片段的反應(yīng)途徑。以氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物啶蟲(chóng)脒為例進(jìn)行分析，啶蟲(chóng)脒dd-MS2掃描譜圖如圖3所示。

圖3 啶蟲(chóng)脒超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜圖Fig.3 Ultra performance liquid chromatography quadrupole electrostatic field orbital ion trap mass spectrometry of acetamiprid

該分析物通過(guò)低（15 eV）、中（30 eV）、高（45 eV）三種不同碰撞能量進(jìn)行裂解，3種碰撞能量譜圖的均一化結(jié)果即為所得到的二級(jí)譜圖。分析物通過(guò)失去一個(gè)電子或加和質(zhì)子等方式形成的離子是一個(gè)奇電子離子，奇電子離子有兩個(gè)活潑的反應(yīng)中心，因此該分析物的碎裂機(jī)理主要為電荷引發(fā)的反應(yīng)（i斷裂）、π電子云遷移反應(yīng)、重排反應(yīng)（rHR與rHC）[10]。啶蟲(chóng)脒的分子離子質(zhì)荷比（m/z）理論值為223.07450，該分子離子主要碎裂途徑如圖4所示。

圖4 啶蟲(chóng)脒碎裂機(jī)理示意圖Fig.4 Fragmentation mechanism of acetamiprid

C8H10ClN2+m/z為181.05270碎裂片段有兩條產(chǎn)生途徑，該碎裂機(jī)理為啶蟲(chóng)脒經(jīng)加氫后形成奇電子離子，形成不同的離域體系及不同的電荷中心，電荷中心分別定義于不飽和N原子（亞氨基）及三鍵相連的不飽和N原子（氰基）上，在N電荷中心的誘導(dǎo)下，進(jìn)行重排反應(yīng)形成新的雙鍵及電荷中心。新形成的分子離子[M+H]+均在電荷中心的吸引下產(chǎn)生i斷裂，正電荷中心分別位于三鍵相連的不飽和N原子（氰基）及不飽和N原子（亞胺基）上，乙亞胺基與氰基相連的亞氨基結(jié)構(gòu)相連一對(duì)電子被正電荷中心所吸引，造成電荷的轉(zhuǎn)移和兩端飽和亞氨基及不飽和N鍵的斷裂。

C6H5ClN＋m/z為126.01050碎裂片段有四個(gè)來(lái)源途徑，其中三個(gè)來(lái)源途徑為電荷中心誘導(dǎo)斷裂（i斷裂），啶蟲(chóng)脒經(jīng)加氫后形成奇電子離子，正電荷中心分別位于雙鍵相連的不飽和N原子（亞氨基）上、飽和N原子（亞氨基）上、三鍵相連的不飽和N原子（氰基）上，與6-氯吡啶結(jié)構(gòu)相連飽和N原子的鍵上、與6-氯吡啶結(jié)構(gòu)相連飽和N原子（亞氨基）鍵上、與6-氯吡啶結(jié)構(gòu)相連飽和N原子的鍵上一對(duì)電子被正電荷中心所吸引，造成電荷的轉(zhuǎn)移及相應(yīng)單鍵的斷裂。第二個(gè)來(lái)源途徑為遠(yuǎn)端重排反應(yīng)（rHR），由于π電子云的遷移，6-氯吡啶結(jié)構(gòu)中2、3號(hào)，4、5號(hào)，1、6號(hào)C=C、C=C、N=C鍵發(fā)生斷裂并在4號(hào)碳上形成電荷中心，極不穩(wěn)定，在游離基誘導(dǎo)的氫重排反應(yīng)中，該氫與6-氯吡啶結(jié)構(gòu)內(nèi)部不成對(duì)電子位置發(fā)生互換，因此，與6-氯吡啶結(jié)構(gòu)相連飽和N原子的鍵斷裂。

?

?

C5H8N3+m/z為110.07127碎裂片段有兩個(gè)來(lái)源途徑，第一個(gè)來(lái)源途徑是在π電子云的遷移下，6-氯吡啶結(jié)構(gòu)中2、3號(hào)，4、5號(hào)，1、6號(hào)C=C、N=C鍵發(fā)生斷裂并在4號(hào)碳上形成電荷中心，與6-氯吡啶基與飽和N原子相連鍵上一對(duì)電子被正電荷中心所吸引，造成正電荷的轉(zhuǎn)移同時(shí)形成新的雙鍵（亞胺基）。第二個(gè)來(lái)源途徑是，啶蟲(chóng)脒加氫后，形成的奇電子離子中有一個(gè)未成對(duì)電子，此電子在分子離子中處于反應(yīng)的最有利位置，形成活潑的反應(yīng)中心，在N游離中心誘導(dǎo)下，隨后進(jìn)行重排反應(yīng)（rHC），形成質(zhì)荷比為110.07127碎裂片段。

最后一條碎裂途徑為產(chǎn)生質(zhì)荷比（m/z）為56.04948的碎裂片段，該碎裂機(jī)理為啶蟲(chóng)脒經(jīng)加氫后形成奇電子離子，正電荷中心位于飽和N原子（亞氨基）上，隨后進(jìn)行重排反應(yīng)（rHC），最后進(jìn)行遠(yuǎn)端重排反應(yīng)（rHR）。

2.3.2 碎裂片段的特征

啶蟲(chóng)脒的分子式C10H11ClN4，屬于新煙堿類藥物，新煙堿類藥物目前有兩種主要結(jié)構(gòu)：以第一代新煙堿類藥物啶蟲(chóng)脒為代表的氯代吡啶、以第二代新煙堿類藥物噻蟲(chóng)胺為代表的氯代噻唑，以呋蟲(chóng)胺為代表的四氫呋喃環(huán)。其中，氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物是乙酰膽堿酯酶受體抑制劑，作用于昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，且與傳統(tǒng)的農(nóng)藥之間不存在交互抗性[11]。通過(guò)對(duì)6-氯吡啶-3-甲基雜環(huán)基團(tuán)結(jié)構(gòu)的氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物的碎裂片段機(jī)理研究，發(fā)現(xiàn)啶蟲(chóng)脒、啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-2-1、啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-2、啶蟲(chóng)脒-代謝物-6-氟煙酸、吡蟲(chóng)啉、吡蟲(chóng)啉尿素及五羥基吡蟲(chóng)啉等氯代吡啶結(jié)構(gòu)農(nóng)藥均有C6H5ClN＋碎片（m/z為126.01050），即藥物的功能特性（結(jié)構(gòu)特性）與碎裂片段的功能特性相一致。表2列出了氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物的特征碎裂片段。

2.3.3 特征碎裂片段在氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物篩查中的應(yīng)用

將特征碎裂片段與氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合應(yīng)用于巴氏殺菌乳中氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物非定向篩查中。采用Full MS/vDIA掃描模式，運(yùn)用表2中氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物特征碎裂片段的精確質(zhì)荷比及結(jié)構(gòu)對(duì)色譜圖進(jìn)行峰提取并分析呈高斯分布的色譜峰；比對(duì)氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，初步判斷該物質(zhì)的類屬，其次通過(guò)其質(zhì)荷比（m/z）、保留時(shí)間、同位素豐度比、碎裂片段豐度比等質(zhì)譜信息以及碎裂途徑，推斷該分析物的分子式與結(jié)構(gòu)式。最后采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜質(zhì)譜信息進(jìn)行判定與定量。分析物濃度等于巴氏殺菌乳中氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積之比與標(biāo)準(zhǔn)物濃度的乘積。例如，在篩查巴氏殺菌乳時(shí)，運(yùn)用氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物的特征碎裂片段m/z為126.01050提取出呈高斯分布且在標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有的色譜峰，如圖5所示。

圖5 啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-4超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜圖Fig.5 Ultra performance liquid chromatography quadrupole electrostatic field orbital ion trap mass spectrometry of acetamiprid-metabolite-IM-1-4

通過(guò)質(zhì)荷比（m/z）、保留時(shí)間、同位素豐度比、碎裂片段豐度比等質(zhì)譜信息推斷出該分析物分子式為CxHyClNz，將豐度較高的碎裂片段與氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)的其他化合物斷裂途徑進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該未知化合物與啶蟲(chóng)脒的碎裂片段斷裂機(jī)理相似（如圖6），通過(guò)對(duì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對(duì)分析，判斷該化合物為啶蟲(chóng)脒-代謝物-IM-1-4，最終定量濃度為0.32 μg/kg。

圖6 啶蟲(chóng)脒碎裂機(jī)理示意圖Fig.6 Fragmentation mechanism of acetamiprid-metabolite-IM-1-4

2.4 方法學(xué)參數(shù)考察

依據(jù)合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南GB/T 27417-2017、歐 盟 標(biāo) 準(zhǔn)2002/657/EC和SANCO/12571/2013進(jìn)行方法學(xué)參數(shù)驗(yàn)證。在電噴霧離子化過(guò)程中，巴氏殺菌乳成分中蛋白質(zhì)與脂質(zhì)易影響氯化煙堿藥物及其代謝產(chǎn)物的離子化效率，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，造成目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度降低或增加，最終影響所建立分析方法的準(zhǔn)確性和靈敏度。實(shí)驗(yàn)中對(duì)基質(zhì)效應(yīng)（C%）進(jìn)行分析：

式中：

Sm——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，目標(biāo)分析物應(yīng)用空白基質(zhì)制作的基質(zhì)匹配溶液；

Ss——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，目標(biāo)分析物使用純?nèi)軇┲谱鳌?/p>

結(jié)果表明大部分氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物分析結(jié)果受基質(zhì)效應(yīng)影響，其中16.7%存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，50%為較弱基質(zhì)效應(yīng)，其余的目標(biāo)化合物為中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)。在配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液過(guò)程中，用空白樣品基質(zhì)提取液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使得樣品分析與標(biāo)準(zhǔn)曲線離子化環(huán)境相似，進(jìn)而最大限度的降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)分析的準(zhǔn)確性和靈敏度影響。

利用確定限（CCα）與檢測(cè)容量（CCβ）考察檢測(cè)限與定量下限。CCα指大于與等于該值時(shí)，由α誤差概率統(tǒng)計(jì)得出，表示測(cè)得基質(zhì)中目標(biāo)化合物不符合規(guī)定結(jié)論的限度，CCβ指依據(jù)β誤差概率以鑒別、檢測(cè)或定量基質(zhì)中目標(biāo)物質(zhì)最低含量。通過(guò)校準(zhǔn)曲線法確定CCα范圍，在巴氏殺菌乳中等距梯度濃度添加混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分析色譜質(zhì)譜信息后，測(cè)得目標(biāo)化合物最低響應(yīng)時(shí)，縱坐標(biāo)軸上的濃度含量加合對(duì)應(yīng)重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差2.33倍即CCα。CCα的值加CCα取值時(shí)重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的1.64倍為CCβ。CCβ取值為相應(yīng)化合物CCα重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的1.64倍與CCα的加和。CCα和CCβ分別為0.01 μg/kg～0.33 μg/kg與0.03 μg/kg～0.59 μg/kg。準(zhǔn)確性通過(guò)回收率指標(biāo)，在巴氏殺菌乳基質(zhì)中添加CCβ、2×CCβ、4×CCβ三個(gè)濃度水平的氯化煙堿藥物及其代謝產(chǎn)物混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，通過(guò)6次平行實(shí)驗(yàn)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)價(jià)建立方法的精密度，樣品經(jīng)提取與凈化后，運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與回收率結(jié)果分別為4.4%～ 7.1%和84%～104%（表3），建立的方法精密度和準(zhǔn)確性能夠滿足巴氏殺菌乳中氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物非定向篩查的需要。

2.5 實(shí)際樣品分析

采用所構(gòu)建的超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道離子阱高分辨質(zhì)譜法篩查81個(gè)批次巴氏殺菌乳中氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物[12]，表4列出篩查結(jié)果，研究結(jié)果表明，81個(gè)批次巴氏殺菌乳都未超過(guò)國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)《GB 2763-2021食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》。

3 結(jié)論

本文建立了基于超高效液相色譜-四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜技術(shù)的巴氏殺菌乳中氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物的快速識(shí)別和定量方法，使用dd-MS2與vDIA兩種二級(jí)掃描模式分析了氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物特征斷裂片段獲得了氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)并完成碎裂途徑解析、特征碎裂片段篩選、獲取可追溯的樣品質(zhì)譜信息，最終實(shí)現(xiàn)了巴氏殺菌乳中未知化合物篩查方法的建立。方法學(xué)考察及實(shí)際樣品的檢測(cè)證明該方法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、質(zhì)量精確度高的特點(diǎn)，方法的檢出限、回收率及精密度滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求適用于氯化煙堿類藥物及其代謝產(chǎn)物殘留的定量檢測(cè)與定性確證。