王瑞博，許定花，劉家勝，張 弓，柯江偉，龔昱斌，李方仲，韓 璐，徐國(guó)華，司小偉，沈吉友，邵聰文

（浙江天元生物藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 311100）

0 引言

2019年末開(kāi)始，席卷全球并蔓延至今的嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥疫情，是由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）所引起的［1］.疫情發(fā)生后，國(guó)內(nèi)外迅速組織開(kāi)展多種新型冠狀病毒疫苗的研究［1-2］，其中傳統(tǒng)的滅活疫苗由于其安全、不存在散毒的危險(xiǎn)、便于貯存和運(yùn)輸、產(chǎn)生抗體水平高等優(yōu)點(diǎn)，很快進(jìn)入臨床并用于全球的免疫接種［3］.

新型冠狀病毒滅活疫苗（Inactivated SARS-CoV-2 vaccine）含有病毒的所有抗原，免疫動(dòng)物后可以產(chǎn)生針對(duì)病毒所有蛋白的抗體，從而使機(jī)體獲得適應(yīng)性免疫［4］.其中，病毒表面棘突蛋白（S蛋白）是SARSCoV-2的所有結(jié)構(gòu)蛋白的主要抗原成分，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)［5-6］，與疫苗引起中和抗體水平關(guān)聯(lián)度很大［7］.而且，靶向S蛋白的抗體可以誘導(dǎo)針對(duì)病毒感染的保護(hù)性免疫［8］，因此，S蛋白的特異性抗體效價(jià)是檢測(cè)新冠疫苗保護(hù)作用的重要標(biāo)志.但從當(dāng)前國(guó)內(nèi)研發(fā)進(jìn)展較快的幾款新冠病毒滅活疫苗動(dòng)物和臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)看出，中和抗體數(shù)值偏低，且在免疫效果和免疫時(shí)間上可能都存在不足［3，9-10］.因此，必須通過(guò)添加佐劑的方式來(lái)提高疫苗的免疫效果.

CpG是一類合成的、含有1個(gè)或多個(gè)非甲基化的單鏈DNA，可通過(guò)DC細(xì)胞的吸附和內(nèi)吞作用，被細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜上TLR9受體識(shí)別，引發(fā)天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答，從而介導(dǎo)對(duì)病毒和細(xì)菌的清除，增強(qiáng)免疫效果［11］.CpG還能協(xié)同刺激抗原特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞分化，有效地激活獲得性免疫，并刺激B細(xì)胞分泌IL-6、IL-10等細(xì)胞因子和表達(dá)MHCⅡ、B7-1、B7-2等表面分子，阻止B細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)特異性抗體的分泌［12］；同時(shí)，CpG還能直接激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，引起這些細(xì)胞分泌IL-12、TNFα等Th1樣為主的細(xì)胞因子，增強(qiáng)細(xì)胞免疫的效果［13］.國(guó)外已有Dynavax公司的CpG佐劑乙肝疫苗上市銷售.

本文擬在當(dāng)前鋁佐劑新型冠狀病毒滅活疫苗的基礎(chǔ)上，添加CpG佐劑制成雙佐劑新冠滅活疫苗，可以有效地提高當(dāng)前血清效價(jià)和中和抗體水平，并降低抗原用量，降低生產(chǎn)成本，提高疫苗產(chǎn)率以及未來(lái)全球新冠疫苗的使用覆蓋率，造福人類.

1 材料

1.1 主要試劑及材料

Vero細(xì)胞，購(gòu)買于ATCC，編號(hào)CCL-81；COVID-19新型冠狀病毒毒株（毒株號(hào)：ZJU-CV）由浙江大學(xué)傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離；β-丙內(nèi)酯購(gòu)買于SERVA；核酸酶購(gòu)買于Merck；氫氧化鋁為自制；CpG佐劑來(lái)源于南京華普生物技術(shù)股份有限公司；BALB／C小鼠購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；純化后的滅活病毒原液，公司自制；新冠重組S1蛋白，購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；陰性血清，取自免疫前的動(dòng)物.

1.2 儀 器

冰箱購(gòu)自海爾集團(tuán)有限公司，型號(hào)為HYC-390；電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)STIK集團(tuán)公司，型號(hào)為CTHI-250B；純化層析系統(tǒng)購(gòu)自GE，型號(hào)為AKTA Pure；酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子（Molecular Devices），型號(hào)為VersaMax.

2 方法

2.1 滅活疫苗原液的制備

從液氮罐中取出相應(yīng)數(shù)量的Vero細(xì)胞，復(fù)蘇并置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)傳代，直至達(dá)到生產(chǎn)規(guī)模細(xì)胞數(shù)量.然后在P3操作區(qū)進(jìn)行生產(chǎn)用病毒液的制備，在接種前用MEM培養(yǎng)液將毒種稀釋至相應(yīng)梯度，然后加入到細(xì)胞工廠，混勻完畢后旋緊蓋子，放入35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng).當(dāng)病變達(dá)到50%～80%后，收集培養(yǎng)上清并按1∶4 000比例加入β-丙內(nèi)酯滅活20h.滅活完畢后，取樣在Vero細(xì)胞盲傳，以細(xì)胞病變法檢查病毒，結(jié)果應(yīng)均為陰性.

轉(zhuǎn)到普通潔凈操作區(qū)進(jìn)行超濾濃縮30到50倍，添加核酸酶消化Vero細(xì)胞DNA，然后用純化層析系統(tǒng)純化，收獲樣品溶液第一峰到收集瓶中.除菌過(guò)濾，取樣進(jìn)行蛋白含量和抗原含量測(cè)定，加入人血白蛋白至0.3%～0.5%，即為原液.

2.2 不同配方滅活疫苗半成品及成品的制備

在無(wú)菌操作間A級(jí)層流下，配制半成品原液：新冠單價(jià)抗原總蛋白的終濃度為2、4、8μg／mL，人血白蛋白的終濃度為0.3%～0.5%，氫氧化鋁（自制）終濃度為450μg／mL，CpG佐劑終濃度為5、20、40、80 μg／mL，然后分裝至無(wú)菌西林瓶中，0.5mL／瓶，即為成品.所有樣品配方分組及規(guī)格見(jiàn)表1.

表1 新冠滅活疫苗成品配方規(guī)格Tab.1 Formulation of COVID－19 inactivated vaccine

2.3 動(dòng)物免疫及處理

選取18～20 g的BALB／C小鼠（購(gòu)買于維通利華），按照表1配制分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組8只，雌雄各半；每組按設(shè)計(jì)的免疫程序，在D0和D14天分別以腹腔注射免疫小鼠，每次注射0.5mL.按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間，分別在D0、D6、D13、D21和D28采血并分離血清，所有血清檢測(cè)全病毒和S1蛋白特異性IgG，以及病毒中和抗體；按統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算每組動(dòng)物血清IgG和病毒中和抗體幾何平均效價(jià)（GMT值）.

2.4 免疫動(dòng)物特異性抗體水平檢測(cè)

先用包被液稀釋純化后的滅活病毒原液和S1重組蛋白抗原，包被到酶標(biāo)板中，2～8℃過(guò)夜.次日，用TPBS（含吐溫-20的PBS溶液）清洗3遍，加入封閉液（含10%脫脂奶粉的PBS溶液）在37℃下封閉1h.然后用TPBS清洗3遍，加入用封閉液稀釋成不同比例的新冠病毒實(shí)驗(yàn)血清（取自2.3中的不同組免疫小鼠）或陰性血清（取自免疫前的小鼠），37℃下結(jié)合1h.TPBS清洗3遍后，加入用封閉液以1∶4 000稀釋后的酶標(biāo)二抗，37℃下結(jié)合1h.TPBS清洗3遍后，加入顯色液在室溫下顯色3～5min，然后加入終止液終止反應(yīng).

酶標(biāo)儀下，在450 nm波長(zhǎng)處讀值.以每個(gè)96孔板中的陰性孔讀數(shù)平均值的2.1倍作為Cutoff值判斷陰陽(yáng)性，從而確定每個(gè)血清樣品的效價(jià).

2.5 中和抗體檢測(cè)

在P3潔凈操作區(qū)內(nèi)，取毒種一支接種到準(zhǔn)備好的Vero細(xì)胞中，置35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞發(fā)生病變感染率≥80%則可收集.收集后進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定，用培養(yǎng)基維持液稀釋至200 TCID50／50μL，備用.將待測(cè)血清樣本用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基作連續(xù)1∶10稀釋，然后過(guò)濾除菌，同時(shí)取陰性對(duì)照小鼠血清同法作系列濃度稀釋為陰性對(duì)照.取96孔培養(yǎng)板，按縱向（A-G）每孔加入50μL稀釋的待測(cè)血清和50μL 200 TCID50的病毒液，每個(gè)血清濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔.輕柔混勻血清和病毒液，37℃孵育1 h.

將傳代培養(yǎng)的Vero細(xì)胞消化吹散后，用培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)準(zhǔn)至2×105／mL.取100μL細(xì)胞加入至上述含病毒／血清混合物的培養(yǎng)板孔中并混勻，放置于35°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng).接種后第4天觀察細(xì)胞病變（CPE）情況，第6天最終判定結(jié)果.判定結(jié)果是需滿足：抗體本身無(wú)明顯細(xì)胞毒性；正常細(xì)胞對(duì)照成立；病毒對(duì)照CPE達(dá)++++.以能抑制細(xì)胞不受100 TCID50的新型冠狀病毒感染所致的細(xì)胞病變效應(yīng)的血清最高稀釋度，為該血清樣本的抗病毒中和活性或效價(jià).

3 結(jié)果

3.1 不同配方規(guī)格新冠疫苗成品的制備

配制好的雙佐劑新冠滅活疫苗成品從抗原含量上來(lái)說(shuō)，分為低（組4-8）、中（組9-13）、高（組14-18）三個(gè)劑量，組合低、中、高、超高劑量的CpG佐劑，用以在動(dòng)物上評(píng)價(jià)佐劑的劑量影響.同時(shí)，配方組還設(shè)計(jì)了佐劑對(duì)照組（組1-3）.

3.2 不同配方新冠疫苗免疫動(dòng)物后特異性抗體效價(jià)

最先檢測(cè)了D21的血清樣品，發(fā)現(xiàn)佐劑對(duì)照組的全病毒效價(jià)很高，背景影響較大，所以，其他天血清僅做了S1蛋白特異性抗體水平的檢測(cè).各組配方疫苗在D06天就產(chǎn)生了S1蛋白特異性的抗體，然后逐漸增高.由于在D28天就終止了免疫實(shí)驗(yàn)，所以無(wú)法確定D28的抗體水平是否為最高.結(jié)果見(jiàn)圖1.

在D28天（圖1d）的結(jié)果中，與單獨(dú)鋁佐劑組相比（組4、9），低、中劑量抗原組在添加CpG后，S1蛋白抗體效價(jià)遠(yuǎn)大于單獨(dú)鋁佐劑組，效價(jià)水平可以達(dá)到200 000以上，但超高劑量CpG組（組8、13）下的效價(jià)水平反而比其他CpG劑量組要低.而在高劑量抗原下，超高劑量CpG組抗體效價(jià)水平又有所恢復(fù)（組18）.

圖1 免疫后小鼠血清中新冠病毒特異性抗體效價(jià)Fig.1 Titers of SARS－CoV－2 specific antibodies in mouse serum after immunization

3.3 不同配方新冠疫苗中和抗體效價(jià)

通過(guò)滅活疫苗體外細(xì)胞效力試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)血清中的中和抗體水平，各組幾何平均效價(jià)（GMT值）具體結(jié)果見(jiàn)表2.各組配方疫苗在D13天才產(chǎn)生了較低水平的中和抗體，然后逐漸增高.在D21天就已經(jīng)達(dá)到了較高的水平，同樣由于在D28就終止了免疫實(shí)驗(yàn)，無(wú)法確定是否為最高.

表2 新冠滅活疫苗中和抗體效價(jià)Tab.2 Neutralization titer of COVID－19 inactivated vaccine

在D28天的結(jié)果中，低劑量抗原下，添加CpG后（組5、6、7、8），中和效價(jià)水平明顯高于單獨(dú)鋁佐劑組（組4），但不同劑量CpG組差別不大，效價(jià)均達(dá)到了600以上.中劑量抗原下，整體結(jié)果與低劑量抗原組相似，但水平略高，效價(jià)均達(dá)到了1000以上；但超高CpG劑量組（組13）水平反而低于其他組（組9、10、11、12）.而在高劑量抗原下，添加CpG后，中和抗體效價(jià)水平（組15、16、17、18）反而低于單獨(dú)鋁佐劑組（組14）.

4 討論

本文評(píng)價(jià)了一種雙佐劑新冠病毒滅活疫苗免疫原性，由于氫氧化鋁是常用的佐劑類型，因此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中固定了氫氧化鋁的濃度，只改變CpG的濃度來(lái)進(jìn)行研究.而中和抗體效價(jià)檢測(cè)方法設(shè)計(jì)中，根據(jù)新冠病毒培養(yǎng)的特性，個(gè)別參數(shù)上稍做了調(diào)整，如本研究使用的病毒培養(yǎng)溫度為35°C，是由于此溫度下可降低Vero細(xì)胞的增值速度，利于新冠病毒的擴(kuò)增；血清標(biāo)本未做滅活處理，是想綜合評(píng)價(jià)免疫血清的效果，避免補(bǔ)體去除后，無(wú)法參與抗原核抗體結(jié)合過(guò)程，造成結(jié)果的偏頗；實(shí)驗(yàn)中使用200TCID50的病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而非一般使用100TCID50的病毒，原因是200TCID50的病毒可以保證100%的病變；觀察天數(shù)選擇上，發(fā)現(xiàn)第6天和第7天并無(wú)區(qū)別，因此選擇第6天為最終判定結(jié)果.

在檢測(cè)滅活疫苗特異性抗體效價(jià)時(shí)，本想選用滅活病毒原液作為包被抗原，但由于滅活病毒原液在制備過(guò)程中添加了人血白蛋白等原料，盡管在后期純化工序去除了大部分非病毒成分的雜蛋白，但仍有少量殘余.這些異源物質(zhì)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也會(huì)引起顯著的免疫應(yīng)答效應(yīng)，使得背景值過(guò)高，影響特異性抗體水平的判定.因此，只能通過(guò)檢測(cè)病毒S蛋白特異性抗體水平來(lái)評(píng)價(jià)疫苗的免疫原性，而S蛋白上的受體結(jié)合區(qū)（Receptor-Binding Domain，RBD）作為宿主細(xì)胞表面結(jié)合的關(guān)鍵靶點(diǎn)位于S1亞單位中［14-15］，且成本造價(jià)也遠(yuǎn)低于重組S蛋白.實(shí)際上，市售的許多檢測(cè)試劑盒中，對(duì)于S蛋白含量測(cè)定所提供的標(biāo)準(zhǔn)品均為重組的S1亞基蛋白.因此，本實(shí)驗(yàn)中最終選取了S1重組蛋白作為直接包被抗原來(lái)檢測(cè)病毒S蛋白特異性抗體.后期若能獲得完全不含人血白蛋白的純化滅活病毒抗原，則可進(jìn)一步對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化.

與單獨(dú)鋁佐劑疫苗組相比，添加CpG之后，小鼠血清中的新冠病毒特異性抗體效價(jià)以及中和抗體滴度都有明顯的提高，特別是在低、中抗原含量下就能達(dá)到很好的免疫效果，這對(duì)延長(zhǎng)血清中抗體的持續(xù)時(shí)間，提高疫苗的有效保護(hù)時(shí)間都有很大的意義.但也可以看出，過(guò)量的CpG佐劑可能會(huì)抑制免疫效應(yīng)，該結(jié)果與聶杰等的結(jié)果［16］類似，在相同抗原劑量下，低劑量CpG均表現(xiàn)出更優(yōu)的免疫效果；但zhang等的結(jié)果［17］則正好相反，高劑量CpG組獲得較低劑量組更為顯著的免疫增強(qiáng)效果.這可能與CpG的不同免疫方式有關(guān)，而且說(shuō)明CpG與抗原之間有量效關(guān)系.后續(xù)需要進(jìn)一步研究CpG佐劑與抗原之間相互作用的機(jī)理，進(jìn)而闡明其抑制免疫效應(yīng)的原因.

5 結(jié)論

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)和分析，可以得到如下結(jié)論：

1）利用CpG佐劑的“增強(qiáng)效應(yīng)”，可以使新冠病毒滅活抗原在較低的劑量下，就能產(chǎn)生較高水平的S蛋白特異性抗體效價(jià)及中和抗體效價(jià).該特性在實(shí)際生產(chǎn)中可以有效降低單劑新冠抗原的使用量，提高單位產(chǎn)能.

2）通過(guò)不同配方組別中和抗體效價(jià)的分析，選擇出優(yōu)選新冠滅活疫苗的配方組，即新冠病毒抗原總蛋白含量2～4μg／mL，CpG含量為5～40μg／mL，鋁含量450μg／mL.此外，CpG佐劑的優(yōu)勢(shì)還表現(xiàn)在可同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，提高疫苗的保護(hù)效果.因此，下一步計(jì)劃在大鼠模型上開(kāi)展細(xì)胞免疫、安全性評(píng)價(jià)等一系列工作.