許可 張碧辰 商雪純 張?zhí)m

橋本甲狀腺炎(hashimoto’s thyroiditis，HT)又稱慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，是臨床上常見的導(dǎo)致甲狀腺功能減退的主要原因之一[1]。隨著社會發(fā)展和人們生活、工作壓力的增加，甲狀腺疾病發(fā)病率逐年升高，威脅人們健康[2]。HT在中醫(yī)統(tǒng)屬于“癭病”，情志失調(diào)、肝郁脾虛均與HT的發(fā)病有關(guān)[3]。HT是一種特異性自身免疫性甲狀腺疾病，CD4+T細(xì)胞可分化為輔助性T細(xì)胞1(helper T cell 1，Th1)、輔助性T細(xì)胞2(helper T cell 2，Th2)、輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17，Th17)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)細(xì)胞亞型，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫、體液免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)，并維持機(jī)體免疫平衡，研究表明Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞失衡與HT等多種自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)[4- 5]。逍遙散具有疏肝健脾、軟堅散癭的功效，臨床上能夠降低HT患者炎癥因子水平，改善患者癥狀[6]。本研究通過構(gòu)建肝郁脾虛型HT大鼠模型，探討柴胡軟堅消癭顆粒對肝郁脾虛型HT大鼠治療的效果及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體級Sprague Dawley雌性大鼠(182～214 g)，選購于遼寧長生生物科技有限公司，許可證號碼：SCXK(遼)2015-0001，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，常規(guī)喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。研究經(jīng)本院動物倫理道德委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗藥物

柴胡軟堅消癭顆粒劑：當(dāng)歸10 g、白芍15 g、柴胡6 g、茯苓10 g、太子參15 g、白術(shù)6 g、海藻8 g、昆布8 g、酒萸肉10 g、山藥10 g、熟地黃20 g、陳皮8 g、清半夏6 g、香櫞6 g、佛手6 g，江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥顆粒劑；金水寶片(產(chǎn)品批號：201112)江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司。

1.3 試劑與儀器

完全弗氏佐劑，不完全弗氏佐劑，豬甲狀腺球蛋白，無水碘化鈉，美國西格瑪公司(貨號分別為：F5506、F5881、A9011、7681-82-5)；甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody，TGAb)、甲狀腺過氧化酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)、游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，購于上海信帆生物科技有限公司(貨號分別為：XFR30792、XFFM248D、XFR31488、XF433、XFR30548)；γ-干擾素(γ-interferon，IFN-γ)、白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)、白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)、白細(xì)胞介素35(interleukin 35，IL-35)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，武漢純度生物科技有限公司(貨號分別為：CD-2570ELAS、CD-117786-ELISA、CD-117814-ELISA、CD-2270ELA)；紅細(xì)胞裂解液，蘇木素—伊紅染色試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司(貨號為：R1010、G1120-100)；CD3-藻紅蛋白-Cy5(phycoerythrin-Cy5，PCy5)、CD8-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、IFN-γ-FITC、IL-4-藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)、IL-17-PE、CD4-FITC、CD25-別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)、轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白P3(forkhead box protein p3，F(xiàn)oxp3)-PE抗體，美國Biolegend公司(貨號分別為： cat 2558、F7250-50MG、102373、5889-1、25-7177-80、305206、DXT-130-109-052、GOY-(elisa)-18307)；兔抗鼠T盒子轉(zhuǎn)錄因子(T-box transcription factor，T-bet)、GATA結(jié)合蛋白3(GATA binding protein 3，GATA3)、Foxp3、維A酸相關(guān)孤獨受體γt(retinoid related orphan receptor γt，RORγt)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗、山羊抗兔IgG H&L，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司(貨號分別為：ab109253、150309、ab2481、SND-M176、9001-50-7、SY0674)；組織裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白提取試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司(批號為：P0013B、20112548)。

FACSCanto II流式細(xì)胞儀，美國Becton Dickinson公司；ELX808酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；BX41 熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司；EG1150包埋機(jī)，LEICSRM2235石蠟切片機(jī)，德國萊卡公司；蛋白凝膠成像系統(tǒng)，美國Ultra-Violet Products公司。

1.4 大鼠模型構(gòu)建

隨機(jī)數(shù)字表法將48只大鼠分為正常組(12只)和造模組(36只)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，于第2周給予大鼠500 mg/L高濃度碘水喂養(yǎng)，第4周的第1天和第4天，于大鼠背部皮下多點注射100 μg/次豬甲狀腺球蛋白(經(jīng)完全弗氏佐劑完全乳化)。第5～8周，每周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)，注射方法劑量同初次免疫一致。實驗第5周開始，將大鼠每半日限制于束縛筒內(nèi)3小時，剩余半日強(qiáng)制大鼠游泳至體力耗竭，足量飼料與禁食飼料隔日交替喂養(yǎng)，連續(xù)4周。正常組大鼠給予蒸餾水，常規(guī)喂養(yǎng)[7]。

實驗第9周，所有大鼠眼球后靜脈叢穿刺術(shù)取血2 mL，4℃，3000 r/min離心15分鐘，收集血清，檢測大鼠血清TGAb、TPOAb水平，模型組大鼠血清TGAb和TPOAb抗體水平超正常組大鼠抗體水平的2倍及以上，代表造模成功[7]，實驗過程中，有2只大鼠造模失敗，1只大鼠死亡，33只大鼠造模成功。

記錄實驗前后大鼠體重、日攝食量；于試驗前后分別收集大鼠日排糞便，計算大鼠糞便含水量。

曠場實驗分析大鼠行為，大鼠逐只放置于曠場箱中，安靜狀態(tài)下，大鼠緩慢放于礦場箱底部中心，計時觀察5分鐘；記錄大鼠于曠場箱中抬頭、站立、修飾次數(shù)及穿格數(shù)量。

1.5 動物分組與給藥

隨機(jī)將33只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、金水寶片組和柴胡軟堅消癭顆粒組，每組11只。柴胡軟堅消癭顆粒加至燒開蒸餾水中，混勻制成柴胡軟堅消癭顆粒藥液，配比為11.43 g/10 mL；金水寶片研磨成細(xì)粉，加至燒開蒸餾水中，制成混懸液，配比為0.45 g/10 mL。參照《藥理實驗方法學(xué)》[8]，根據(jù)每周大鼠體質(zhì)量變化換算大鼠有效給藥量，正常組和模型組，每次給予2 mL蒸餾水灌胃；金水寶片組，按照0.45 g/(kg·d)劑量給藥，分2次灌胃；柴胡軟堅消癭顆粒組，按11.43 g/(kg·d)給藥，分2次灌胃，療程共8周。實驗過程中，觀察大鼠一般形態(tài)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞

末次給藥12小時后，所有大鼠腹主動脈取血2 mL，分裝2管，一管置于-80℃冰箱，用于后續(xù)實驗。取100 μL大鼠外周血，肝素鈉抗凝，紅細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加CD3、CD8、IFN-γ、IL-4、IL-17抗體，檢測Th1、Th2、Th17細(xì)胞；加CD4、CD25、Foxp3抗體檢測Treg細(xì)胞。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠血清甲狀腺抗體、甲狀腺功能指標(biāo)及相關(guān)細(xì)胞因子水平

取1.6中保存于-80℃冰箱大鼠外周血，4℃，3000 r/min離心15分鐘，收集上清。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測大鼠血清中TPOAb、TGAb、FT3、FT4、TSH及IFN-γ、IL-10、IL-17、IL-35等水平，實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 蘇木素—伊紅染色法檢測各組大鼠甲狀腺組織形態(tài)

取血結(jié)束后，脊椎脫臼法處死大鼠，大鼠頭頸部血管處取出甲狀腺，分為2份，一份置于10%福爾馬林中固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。另一部分存于-80℃冰箱，用于后續(xù)實驗研究。

石蠟切片進(jìn)行4 μm連續(xù)切片，脫蠟至水，進(jìn)行蘇木素—伊紅染色，透明，封片，顯微鏡下觀察大鼠甲狀腺組織形態(tài)。

1.9 蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠甲狀腺組織T-bet、GATA3、Foxp3、RORγt的蛋白表達(dá)

取1.8中存于-80℃冰箱的甲狀腺組織，加入組織裂解液，研磨，勻漿，4℃離心，收集上清。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，之后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入兔抗鼠T-bet、GATA3、Foxp3、RORγt、GAPDH，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG，37℃孵育，TBST洗膜，蛋白凝膠成像儀成像，ImageJ軟件分析蛋白T-bet、GATA3、Foxp3、RORγt的表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般形態(tài)

正常組大鼠皮毛順滑光潔，日?；顒佣容^好，精神狀況佳，飲食正常規(guī)律，排便形狀未見異常。造模組大鼠進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)前期掙扎激烈，于束縛桶內(nèi)抵抗撕咬反應(yīng)明顯，出桶后抵抗明顯，呈對峙狀態(tài)。造模后期大鼠掙扎反應(yīng)明顯減弱，精神狀態(tài)低下，活動度降低，皮毛枯黃質(zhì)脆，飲食不佳，排便偏稀。金水寶片及柴胡軟堅消癭顆粒治療后，大鼠上述癥狀明顯改善。

造模前，正常組和造模組大鼠體重、攝食量、糞便含水率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。造模后，與正常組相比，造模組大鼠體重、攝食量、糞便含水率顯著降低，曠場實驗運(yùn)動5分鐘距離、中央穿格次數(shù)顯著減少，而中央停留時間增加(P<0.01)。見表1。

表1 造模后正常組與模型組大鼠體重、攝食量、糞便含水率及曠場實驗結(jié)果比較

2.2 柴胡軟堅消癭顆粒對大鼠甲狀腺自身抗體滴度及甲狀腺功能指標(biāo)的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清TPOAb、TGAb、FT3、FT4水平顯著升高，TSH水平顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，金水寶片組、柴胡軟堅消癭顆粒組大鼠血清TPOAb、TGAb水平FT3、FT4水平顯著降低，TSH水平顯著升高(P<0.01)；與金水寶片組相比，柴胡軟堅消癭顆粒組大鼠血清TPOAb、TGAb水平FT3、FT4水平顯著降低(P<0.01)，TSH水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠甲狀腺自身抗體滴度及甲狀腺功能指標(biāo)比較

2.3 柴胡軟堅消癭顆粒對大鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)的影響

正常組甲狀腺結(jié)構(gòu)完整，濾泡腔及上皮細(xì)胞構(gòu)型規(guī)則、形態(tài)趨近，無炎性浸潤；模型組甲狀腺構(gòu)型不完整，濾泡結(jié)構(gòu)破壞，形態(tài)不規(guī)整，腔內(nèi)膠質(zhì)成分減少，存在大量炎性浸潤；與模型組相比，金水寶片組、柴胡軟堅消癭顆粒組甲狀腺結(jié)構(gòu)相對完整，組織破壞不明顯，濾泡形態(tài)改變相對不明顯，濾泡腔內(nèi)外細(xì)胞核相對減少，存在少量炎性浸潤，見圖1。

注：A.正常組；B.模型組；C.金水寶片組；D.柴胡軟堅消癭顆粒組

2.4 柴胡軟堅消癭顆粒對大鼠血清Th1/Th2及Th17/Treg平衡的影響

與正常組相比，模型組大鼠Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg、IFN-γ、IL-17水平顯著升高，Th2、Treg、IL-10、IL-35水平顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，金水寶片組、柴胡軟堅消癭顆粒組大鼠Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg、IFN-γ、IL-17水平顯著降低，Th2、Treg、IL-10、IL-35水平顯著升高(P<0.01)；與金水寶片組相比，除Treg外，柴胡軟堅消癭顆粒組大鼠血清Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg、IFN-γ、IL-17水平顯著降低，Th2、IL-10、IL-35水平顯著升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清Th1/Th2、Th17/Treg及相關(guān)細(xì)胞因子比較

2.5 柴胡軟堅消癭顆粒對大鼠甲狀腺組織T-bet、GATA3、Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組大鼠GATA3、Foxp3表達(dá)顯著降低，T-bet、RORγt顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，金水寶片組、柴胡軟堅消癭顆粒組大鼠GATA3、Foxp3表達(dá)顯著升高，T-bet、RORγt表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與金水寶片組比較，柴胡軟堅消癭顆粒組大鼠GATA3、Foxp3表達(dá)顯著升高，T-bet、RORγt表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見表4、圖2。

表4 各組大鼠甲狀腺組織T-bet、GATA3、Foxp3、RORγt的蛋白表達(dá)比較

注：A：正常組；B：模型組；C：金水寶片組；D：柴胡軟堅消癭顆粒組

3 討論

HT是一種以識別自身組織為抗原信號的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為血清中TPOAb和TGAb滴度超過正常滴度的2倍，甲狀腺組織出現(xiàn)淋巴浸潤及纖維增生的病理改變[9]。柴胡軟堅消癭顆粒為化裁經(jīng)典解郁名方逍遙散意加減而來，兼具有舒肝健脾及軟堅消癭之功效。君藥為柴胡，具有疏肝解郁，調(diào)達(dá)肝氣之功效，對本病可起到調(diào)暢氣機(jī)、改善情緒郁結(jié)的作用；白芍，斂陰養(yǎng)血，止痙柔肝；當(dāng)歸，養(yǎng)血活血，二者合用可避免應(yīng)用方中柴胡造成宣泄太過，可起到調(diào)和共濟(jì)的作用；香櫞、佛手可起到疏肝理氣和中之效；茯苓、山藥、太子參和白術(shù)具有健脾益氣補(bǔ)中等療效；酒萸肉和熟地黃可起到填髓充精的固本之效；陳皮和半夏針對本病發(fā)揮祛痰燥濕、軟堅散結(jié)的作用；海藻及昆布皆為含碘中藥，可以共用來祛痰消癭、利水散結(jié)，調(diào)和組方。本方具有針對性的軟堅消癭、舒肝健脾之功效，兼可促進(jìn)患者免疫功能的恢復(fù)，從而祛病除邪，達(dá)到扶正補(bǔ)元的根治作用。臨床應(yīng)用觀察顯示其具有明顯降低甲狀腺自身雙抗體滴度水平及改善患者各種不適癥狀的功效[2]。本研究基于中醫(yī)辨證施治理論，通過構(gòu)建肝郁脾虛HT大鼠模型，模擬臨床上HT發(fā)病過程，發(fā)現(xiàn)造模組大鼠早期易激惹，后期活動度減退，食少便溏，血清甲狀腺抗體TGAb、TPOAb滴度顯著升高，甲狀腺組織損傷嚴(yán)重，甲狀腺功能亢進(jìn)，且呈現(xiàn)肝郁脾虛狀態(tài)，經(jīng)柴胡軟堅消癭顆粒治療后，模型組大鼠血清TGAb、TPOAb滴度顯著降低，甲狀腺組織損傷減輕，甲狀腺功能得到明顯改善，且效果略好于金水寶片，提示柴胡軟堅消癭顆粒對治療肝郁脾虛型HT大鼠效果顯著。

Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞平衡在機(jī)體免疫中具有重要作用，未分化的CD4+T細(xì)胞在受到IL-12、IFN-γ等炎癥因子刺激后，分化出Th1、Th2、Th17、Treg等不同Th細(xì)胞亞型，維持免疫功能穩(wěn)態(tài)，Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞失衡則會導(dǎo)致免疫功能失調(diào)，從而引起自身免疫性疾病的發(fā)生[10]。Th1細(xì)胞，亦被稱之為炎癥性T細(xì)胞，研究表明Th1通過分泌IFN-γ、IL-2等炎癥因子，使淋巴細(xì)胞浸潤甲狀腺腺體，引起甲狀腺組織破壞和細(xì)胞凋亡[11]。Th2細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫，通過分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子對Th1進(jìn)行功能拮抗，抑制Th1細(xì)胞活化與增殖[12]。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17、IL-23等促炎因子，誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌，參與機(jī)體炎癥和免疫防御[13]。Treg細(xì)胞是一種具有免疫抑制作用的CD4+T細(xì)胞，通過分泌IL-10、IL-35等抑炎性細(xì)胞因子，抑制CD4+T、CD8+T等細(xì)胞的活化和增殖，發(fā)揮免疫抑制作用[14]。Safdari等[10]研究表明HT患者血清Th1、Th17水平顯著高于正常對照組，而Th2、Treg水平顯著降低，患者存在Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞失衡。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠存在Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞失衡，Th1、Th17功能亢進(jìn)，二者細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17水平顯著升高，高于正常組，而Th2、Treg細(xì)胞因子IL-10、IL-35水平顯著降低，提示Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞失衡可能與肝郁脾虛HT的發(fā)生有關(guān)，猜測可能是Th1、Th17細(xì)胞的增多導(dǎo)致Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞平衡向Th1和Th17方向偏移，引起機(jī)體免疫失衡和炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致甲狀腺組織損傷，從而促進(jìn)HT的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，柴胡軟堅消癭顆粒組大鼠Th1、Th17細(xì)胞及IFN-γ、IL-17水平減少，而Th2、Treg細(xì)胞和IL-10、IL-35水平增加，提示柴胡軟堅消癭顆?？筛纳艸T大鼠Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞失衡。

T-bet、GATA3是人體重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，T-bet屬于轉(zhuǎn)錄因子T-box家族，是Th1細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，能夠誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1分化[15]。GATA3是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控IL-4等Th2相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th2分化[16]。GATA3能夠抑制T-bet的轉(zhuǎn)錄，抑制IFN-γ的表達(dá)，進(jìn)而抑制CD4+T細(xì)胞向Th1方向轉(zhuǎn)化[17]。RORγt是調(diào)節(jié)Th17分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，是Th17的特異性標(biāo)志物，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞發(fā)育和功能維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是Treg細(xì)胞的標(biāo)志物[18]。Foxp3是調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞功能維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠抑制RORγt的表達(dá)，從而抑制Th17細(xì)胞的分化[19]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠甲狀腺組織T-bet、RORγt蛋白表達(dá)顯著升高，GATA3、Foxp3表達(dá)顯著降低，柴胡軟堅消癭顆粒治療能夠提高GATA3、Foxp3蛋白的表達(dá)，提示柴胡軟堅消癭顆?？赡芡ㄟ^促進(jìn)蛋白GATA3、Foxp3的表達(dá)，促進(jìn)Th2、Treg細(xì)胞的分化，抑制Th1、Th17細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞平衡，可能是柴胡軟堅消癭顆粒治療HT的機(jī)制。

綜上所述，柴胡軟堅消癭顆粒對肝郁脾虛HT大鼠治療有一定的療效，可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2及Th17/Treg細(xì)胞平衡有關(guān)。然而本研究僅從大鼠實驗水平探討了柴胡軟堅消癭顆粒在治療肝郁脾虛HT中的可能機(jī)制，下一步需結(jié)合臨床實驗進(jìn)一步探討相關(guān)機(jī)制。