余艷芳，趙開順，屠春林，陳娓，梁海鷹，易清清，梁凱軼，孫亞蒙

結(jié)核病已成為嚴重危害全球范圍內(nèi)人群健康的公共衛(wèi)生問題之一，近年來廣泛耐藥結(jié)核?。╡xtensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）和耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）使結(jié)核病的臨床治療困難重重。為了避免結(jié)核分枝桿菌發(fā)生獲得性耐藥，WHO建議結(jié)核病及疑似結(jié)核病患者在行標準抗結(jié)核治療前進行藥敏試驗［1］，以早期發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核?。╠rug-resistant tuberculosis，DRTB）。但傳統(tǒng)細菌耐藥檢測手段如表型藥物敏感性試驗（drug susceptibility test，DST）耗時較長（一般需要3～4周），同時因細菌生長不良或受其他微生物污染影響而導致結(jié)果不確定，進而延誤患者治療［2］。

近年隨著結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機制的闡明，采用分子生物學技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因已成為診斷DR-TB的方法［3］。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF）是美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的痕量核酸檢測系統(tǒng)，其具有檢測時間快、準確度高、成本低等特點［4］。近年隨著GridION（Oxofrd Nanopore Technologies）測序平臺不斷更新，利用納米孔測序儀獲得較大測序深度后得到的校正序列與Sanger測序相比準確率高達100%，且其鑒定微生物及微生物耐藥性的費用與Illumina二代測序相當，但測序時間極大縮短了［5-6］。本研究以最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）法為藥敏試驗的“金標準”，以三代測序驗證突變基因，旨在分析MALDI-TOF在結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測中的應用價值，以期為DR-TB防控方案的制定提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2016—2020年上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院肺科診治的200例復治肺結(jié)核患者的痰液標本，其中男性157例，女性43例；年齡24～65歲，平均（45.0±10.3）歲。

1.2 主要試劑和材料 iPLEX Pro高保真基因型分析試劑盒購自Agena Bioscience公司（美國，10160），三代測序Barcode試劑盒購自O(shè)xford Nanopore Technologies（英國，EXP-NBD104、EXP-NBD114），三代測序建庫試劑盒購自O(shè)xford Nanopore Technologies（英國，SQK_LSK109），測序芯片R 9.4.1購自O(shè)xford Nanopore Technologies（英國，F(xiàn)LOMIN106），Invitrogen Platinum ⅡTaq熱啟動DNA聚合酶（美國，14966001），芯片清洗試劑盒購自O(shè)xford Nanopore Technologies（ 英 國，SQK-RBK004）， 細 菌 DNA/RNA提取試劑盒購自寧波市重鼎生物技術(shù)有限公司（中國，ZDTG-91-100），AMPure XP Beads購自 Beckman Coulter。

1.3 檢測方法

1.3.1 MIC法 采用BACTEC MGIT960全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀快速培養(yǎng)痰液標本，鑒定為陽性的結(jié)核分枝桿菌采用MIC法進行藥敏試驗［7］。使用細菌DNA/RNA提取試劑盒提取結(jié)核分枝桿菌DNA樣本，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作。以MIC法為本次藥敏試驗的“金標準”，評價MALDI-TOF對結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢出情況。

1.3.2 MALDI-TOF 采用MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥情況及耐藥相關(guān)位點突變結(jié)果，具體如下：DNA模板經(jīng)多重聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增后，采用蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）去除殘留的脫氧核糖核苷三磷酸，再采用雙脫氧核苷三磷酸、與待測位點的前模板匹配的特異性單堿基延伸引物進行待測位點單個堿基的延伸反應，根據(jù)延伸產(chǎn)物分子質(zhì)量特異性區(qū)分待測位點的堿基類型?？菇Y(jié)核藥物及其對應的基因耐藥位點參考文獻［8-12］，見表1。引物和單堿基延伸引物的設(shè)計及MALDI-TOF具體操作過程參照TSUCHIDA等［13］研究。

1.3.3 三代測序 采用三代測序驗證MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)位點突變的準確性，具體如下：從200份結(jié)核分枝桿菌DNA標本中隨機選取20份，其對應的MIC結(jié)果見表2，分別針對表1中基因的突變熱點區(qū)域設(shè)計引物，進行多重PCR擴增，產(chǎn)物長度約為500 bp，三代測序多重PCR的引物序列見表3。使用三代測序建庫試劑盒建庫上機，上機操作流程參照MORRISON等［14］的方法。具體操作步驟如下：將20份結(jié)核分枝桿菌DNA的多重PCR產(chǎn)物稀釋至終濃度為100～200 fmol的48 μl無核酶水中，采用NEB末端修復和加T/A尾試劑盒進行末端修復，采用AMPure XP Beads磁珠純化修復產(chǎn)物，將產(chǎn)物稀釋至終濃度為100～200 fmol的22.5 μl無核酶水中，分別連接標簽序列（EXP-NBD104 and EXP-NBD114 kits，ONT）。磁珠純化上述產(chǎn)物并采用Qubit 3.0熒光定量儀進行定量分析，使用SQK-LSK109連接建庫試劑盒（ONT官方試劑）進行混合樣本建庫，混合樣本終濃度為100～200 fmol/L，樣本終體積為65 μl。連接建庫產(chǎn)物并采用磁珠純化后洗脫在15 μl體系中，終濃度需為50～100 fmol/L，取12 μl 混合SQB和LB后，點樣到測序芯片R 9.4.1，使用GridION×5測序3 h，下機后提取FastQ數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。測序完成后，清洗芯片（EXP-WSH003，ONT）并質(zhì)檢，當活性孔≥800時，可以用于下一次測序，將芯片按要求保存于4 ℃冰箱中。堿基識別軟件為Guppy 4.5.2，數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件為NanoPlot，單堿基變異（single nucleotide variant，SNV）位點識別使用Medaka。

表1 抗結(jié)核藥物及其對應的基因耐藥位點Table 1 Anti-tuberculosis drugs and their corresponding gene resistance sites

表2 20株結(jié)核分枝桿菌對應的MIC結(jié)果（μg/ml）Table 2 MIC results corresponding to 20 strains of Mycobacterium tuberculosis

表3 三代測序多重PCR的引物序列Table 3 Primer sequence of third generation sequencing multiplex PCR

（續(xù)表1）

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以相對數(shù)表示；以MIC法為藥敏試驗的“金標準”，計算MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥的靈敏度、特異度及正確率；采用Kappa檢驗進行一致性分析，以Kappa值＜0.40為一致性較差，Kappa值為0.40～0.75為一致性中等，Kappa值＞0.75為一致性較高。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況 以MIC法為藥敏試驗的“金標準”，MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥的靈敏度為93.1%、特異度為87.8%、正確率為90.5%、Kappa值為0.810；MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥的靈敏度為77.2%、特異度為98.6%、正確率為85.0%、Kappa值為0.701；MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對左氧氟沙星耐藥的靈敏度為77.8%、特異度為99.0%、正確率為88.5%、Kappa值為0.769；MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對莫西沙星耐藥的靈敏度為85.7%、特異度為76.2%、正確率為78.5%、Kappa值為0.516；MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對阿米卡星耐藥的靈敏度為94.9%、特異度為89.4%、正確率為90.5%、Kappa值為0.736；MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對卷曲霉素耐藥的靈敏度為88.9%、特異度為87.8%、正確率為88.0%、Kappa值為0.654，見表4。

表4 MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對抗菌藥物耐藥的效能（株）Table 4 Efficacy of MALDI-TOF in detecting antimicrobial resistance of Mycobacterium tuberculosis

2.2 三代測序驗證MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)位點突變的準確性 三代測序時間為3 h，獲得518.8 M數(shù)據(jù)（其中堿基質(zhì)量值＜9的數(shù)據(jù)有88.79 M），測序質(zhì)量通過讀長N50=530，平均測序質(zhì)量為12.7，見表5。下機數(shù)據(jù)的fast5文件轉(zhuǎn)換為fastq文件（guppy_basecaller -i fast5_pass-s fast5_pass --config dna_r9.4.1_450bps_hac.cfg -r --num_callers 4 --cpu_threads_per_caller 4 --fast5_out）（Guppy Version 4.5.2），數(shù)據(jù)質(zhì)控（guppy_basecaller -i fast5_pass -s fast5_pass --config dna_r9.4.1_450bps_hac.cfg -r --num_callers 4 --cpu_threads_per_caller 4 --fast5_out），拆分20個樣本的barcode（guppy_barcoder guppy_barcoder -i sample_fastq -s .--barcode_kits "EXP-NBD104 EXP-NBD114" --allow_inferior_barcodes），去除各樣本barcode序列（guppy_barcoder --input_path sample_fastq --save_path . --config configuration.cfg --trim_barcodes），以結(jié)核分枝桿菌H37Rv的序列為參考基因組，識別各樣本的SNV位點（medaka_haploid_variant -i sample.fastq-r ref.fna -t 16 -m r941_min_high_g360）。在20份分枝結(jié)核桿菌中，MALDI-TOF檢測的耐藥突變位點與三代測序檢測的耐藥突變位點一致率為100%；此外，三代測序還獲得MALDITOF檢測體系中未涉及的突變位點，見表6～7。

表5 基于NanoPlot的數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果Table 5 Data quality control results based on NanoPlot

表6 MALDI-TOF檢測的耐藥相關(guān)位點突變結(jié)果Table 6 Mutation results of drug resistance related sites detected by MALDI-TOF

3 討論

中國是結(jié)核病高負擔國家，近年來結(jié)核分枝桿菌原發(fā)耐藥率和繼發(fā)耐藥率不斷上升，復治患者耐藥率相對較高，究其原因主要為疾病初期未采取合理的治療方案、抗生素濫用、服藥不規(guī)律和患者依從性差等［15］。近年隨著分子生物學技術(shù)進步，臨床上可快速、敏感地檢測出結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株，進而為臨床治療方案的制定提供實驗依據(jù)，也為結(jié)核病的控制提供了理論基礎(chǔ)［2］。

表7 三代測序檢測的耐藥相關(guān)位點突變結(jié)果Table 7 Mutation results of drug resistance related sites detected by thirdgeneration sequencing

既往研究表明，95%以上的利福平耐藥菌株突變發(fā)生在rpoB基因81bp（密碼子507-533）的耐藥決定區(qū)，密碼子531位點是最常見的突變位點［16］，但rpoB基因突變與利福平耐藥的關(guān)系存在地域性差異［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，異煙肼耐藥主要與KatG、inhA 基因突變相關(guān)［18］，KatG基因密碼子315是引起異煙肼耐藥的主要突變位點（76.9%）［19］；但也有研究結(jié)果顯示，KatG基因密碼子315的突變頻率很低［20］。在全球范圍內(nèi)，結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥、對利福平敏感是最常見的耐藥模式，而采用標準抗結(jié)核治療模式會導致治療失敗或MDT-TB患者數(shù)量增加，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)閄DR-TB，因此快速、準確地檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥情況十分重要［21-23］。

根據(jù)WHO的建議，治療MDR-TB患者時應首先進行氟喹諾酮類和二線注射類藥物的藥敏試驗或分子藥敏試驗，然后再確認治療方案，以減少XDR-TB的產(chǎn)生［1］。gyrA基因、gyrB基因、rrs基因和eis基因分別是氟喹諾酮類和二線注射類藥物分子耐藥的主要機制，可以解釋60%～90%的耐藥情況［24-26］。本研究結(jié)果顯示，MALDI-TOF與MIC法檢測結(jié)核分枝桿菌對莫西沙星耐藥的Kappa值為0.516，分析MIC結(jié)果和三代測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，20例標本均顯示對氟喹諾酮類藥物耐藥，同時三代測序結(jié)果還顯示，gyrA基因61密碼子和284密碼子均突變。但也有研究證實，gyrA基因284密碼子的突變與氟喹諾酮類藥物的耐藥無關(guān)［27］，故gyrA基因61密碼子突變與氟喹諾酮類藥物耐藥的關(guān)系值得進一步研究。此外，本研究結(jié)果還顯示，20份結(jié)核分枝桿菌中7號菌株gyrB基因1510位點是G→A的突變，該位點是MALDI-TOF未檢測出的突變位點，該標本臨床藥敏試驗結(jié)果顯示對氟喹諾酮類耐藥，需持續(xù)關(guān)注。

綜上所述，通過MALDI-TOF檢測的結(jié)核分枝桿菌對常用抗結(jié)核藥物耐藥結(jié)果與MIC法高度或中度一致，其檢測的耐藥突變位點與三代測序檢測的耐藥突變位點一致率為100%，故MALDI-TOF檢測的結(jié)核分枝桿菌耐藥結(jié)果可以作為臨床鑒定結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗結(jié)果的有效補充。

作者貢獻：余艷芳、屠春林進行文章的構(gòu)思與設(shè)計；余艷芳、孫亞蒙進行研究的實施與可行性分析；余艷芳、趙開順、陳娓、梁海鷹進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；易清清、梁凱軼進行結(jié)果分析與解釋；余艷芳負責撰寫、修訂論文；屠春林負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。