獼猴桃花粉液體培養(yǎng)方法的優(yōu)化

錢崢，姚春潮

（西北農(nóng)林科技大學園藝學院，陜西楊凌 712100）

獼猴桃（Actinidia）為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia Lindl.）雌雄異株落葉藤本果樹，授粉是獼猴桃果實產(chǎn)量及品質(zhì)形成的前提和保證。自然授粉對獼猴桃的授粉效果而言相對不穩(wěn)定，因此，人工輔助授粉技術成為獼猴桃充分授粉的重要保障措施。液體授粉在操作上省時省力，高效便捷，適合大面積快速授粉，對提高授粉作業(yè)效率和坐果率具有明顯優(yōu)勢?；ǚ垡后w培養(yǎng)配方是決定獼猴桃液體授粉效果及作業(yè)效率的關鍵條件。大量研究表明，碳水化合物的存在對花粉的生活力有顯著的促進作用，其中使用最多的是蔗糖[1-3]。適宜濃度的糖在花粉培養(yǎng)基中主要起到的作用：一是保持花粉內(nèi)外滲透壓；二是為花粉萌發(fā)提供營養(yǎng)，并促進花粉管的伸長[4]。硼酸和鈣對花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長也有一定的促進作用[5]。穩(wěn)定劑作為花粉液體培養(yǎng)配方中的重要組分，起到使花粉均勻分散在液體中，并保證花粉液不易產(chǎn)生沉淀的作用。適宜種類及濃度的穩(wěn)定劑有助于保持液體授粉作業(yè)過程中花粉液的均勻，使噴口不易被堵塞，保證授粉效果良好。因此，研究花粉液體培養(yǎng)配方中穩(wěn)定劑組分，為優(yōu)化花粉培養(yǎng)方法及獼猴桃生產(chǎn)的提質(zhì)增效提供一定的技術支撐。

1 材料與方法

本試驗在眉縣西北農(nóng)林科技大學獼猴桃試驗站進行。所用花粉材料均為“佰瑞”牌商品花粉，將花粉置于-20℃冰箱中冷凍保存，使用前24h 提前取出，置于4℃條件下以恢復其活性。

在不同黃原膠（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L）（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L）、海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L）濃度的液體培養(yǎng)基上進行花粉離體萌發(fā)試驗，以10%蔗糖+0.1g/L H3BO3+1.0 g/L 花粉+純水+溫度25℃為對照組，在對照組的基礎上，研究添加各穩(wěn)定劑不同濃度對花粉萌發(fā)率的影響，分別獲得各穩(wěn)定劑對花粉液體培養(yǎng)最適宜的濃度。將配制好的各處理花粉培養(yǎng)液分別裝入10mL 離心管中搖勻，每一支離心管裝入7mL 花粉培養(yǎng)液，置于設定溫度25℃、轉速100rpm 的恒溫搖床中培養(yǎng)2h，取出后將花粉液樣品置于光學顯微鏡下進行觀察，統(tǒng)計萌發(fā)花粉粒及全部花粉粒的數(shù)量，花粉管長度大于花粉粒直徑作為已萌發(fā)花粉粒，計算花粉萌發(fā)率[6]。每個處理重復3 次。

花粉懸浮效果的測定采用血球計數(shù)法，以10%蔗糖+0.1g/L H3BO3+1.0 g/L 花粉+純水為對照組，在此基礎上，研究添加不同種類及濃度穩(wěn)定劑對花粉懸浮效果的影響。將配制好的花粉培養(yǎng)液分別裝入5 支10mL離心管中搖勻，每支離心管裝入7mL 花粉培養(yǎng)液，分別在常溫下靜置0min、30min、60min、90min、120min，將靜置各時間段后的離心管中間部位的花粉培養(yǎng)液，滴入25×16 格血球計數(shù)板，置于光學顯微鏡下進行觀察，統(tǒng)計花粉粒個數(shù)，計算1mL 液體中的花粉總數(shù)[6]。每個處理重復3 次。

根據(jù)添加以上穩(wěn)定劑的花粉培養(yǎng)液的懸浮效果及萌發(fā)率的單因素試驗，設計正交試驗，確定最適花粉培養(yǎng)液穩(wěn)定劑復配比例。

本試驗的數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2016 進行數(shù)據(jù)整理，使用IBM SPSS Statistics 26 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同穩(wěn)定劑種類及濃度對花粉萌發(fā)率的影響

由表1 可知，3 種穩(wěn)定劑對花粉萌發(fā)率的影響不一致?？傮w而言，無論濃度的高低，黃原膠對保持花粉萌發(fā)率的效果最好，不同黃原膠濃度處理對花粉萌發(fā)率的影響與對照組差異不顯著。海藻酸鈉在較低濃度時（0.1g/L、0.2g/L）對花粉萌發(fā)率的影響與對照組相比差異不顯著，但在高于0.3g/L 的濃度下則會顯著降低花粉萌發(fā)率。羧甲基纖維素鈉與海藻酸鈉對花粉萌發(fā)率的影響較為相似，在較低濃度時對萌發(fā)率的影響與對照組相比不顯著，而隨著濃度的增加則顯著抑制花粉的萌發(fā)。0.2g/L 黃原膠處理的花粉萌發(fā)率最高，為55.59%。

2.2 不同穩(wěn)定劑種類及濃度對花粉懸浮效果的影響

由表1 可知，不同種類穩(wěn)定劑對花粉培養(yǎng)液的穩(wěn)定效果存在顯著差異。穩(wěn)定劑濃度為0.4g/L 時，黃原膠作為穩(wěn)定劑的花粉培養(yǎng)液在靜置120min 后的花粉濃度比例為21.21%，海藻酸鈉作為穩(wěn)定劑的花粉培養(yǎng)液在靜置120min 后的花粉濃度比例為26.47%，羧甲基纖維素鈉處理的花粉濃度比例則為41.18%。相同濃度的以上3 種穩(wěn)定劑，懸浮效果最好的是羧甲基纖維素鈉，其次為海藻酸鈉，最后是黃原膠。隨著黃原膠濃度的增大，花粉濃度比例隨靜置時間的變化而提高，有效提高了花粉培養(yǎng)液的穩(wěn)定性，當黃原膠濃度為1.0g/L 時，靜置120min 后的花粉濃度比例達到75%?；ǚ叟囵B(yǎng)液的穩(wěn)定性隨著海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉濃度的升高而提高，在濃度為0.5g/L 時，兩者靜置120min 后的花粉濃度比例分別為39.39%和46.88%。

表1 不同穩(wěn)定劑種類及濃度對花粉萌發(fā)率和懸浮效果的影響

2.3 復配穩(wěn)定劑的確定

根據(jù)復配穩(wěn)定劑正交試驗結果（見表2）可知，3 種穩(wěn)定劑對花粉萌發(fā)率的影響主次順序為B＞C＞A，即羧甲基纖維素鈉＞海藻酸鈉＞黃原膠。根據(jù)保證最佳花粉萌發(fā)率的原則，選用最優(yōu)復配穩(wěn)定劑方案為A1B1C1，即黃原膠0.8g/L、羧甲基纖維素鈉0.1g/L、海藻酸鈉0.1g/L。

表2 復配穩(wěn)定劑L9（33）正交試驗結果及極差分析

3 討論與結論

在花粉培養(yǎng)液中添加穩(wěn)定劑時，首先，考慮穩(wěn)定劑是否對花粉活力有影響。其次，考慮穩(wěn)定劑增加花粉懸浮效果方面的作用。適當濃度的黃原膠、海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉可作為花粉培養(yǎng)液穩(wěn)定劑。黃原膠、海藻酸鈉以及羧甲基纖維素鈉隨著濃度的升高而增加花粉懸浮時間，更好地降低花粉濃度的衰減速率，保持花粉培養(yǎng)液的穩(wěn)定性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的NaCl 對花粉萌發(fā)和花粉管伸長有抑制作用[7]。在本研究中，盡管海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉在相同濃度條件下的穩(wěn)定效果好于黃原膠，但由于濃度高于0.3g/L 的海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉會顯著抑制花粉萌發(fā)。因此，不宜使用過高濃度的以上2 種穩(wěn)定劑。而黃原膠隨著濃度的上升，既可以保證較高水平的花粉萌發(fā)率，又可以進一步增強花粉懸浮效果。本研究通過正交試驗得到最優(yōu)復配穩(wěn)定劑為黃原膠0.8g/L、羧甲基纖維素鈉0.1g/L、海藻酸鈉0.1g/L。相關研究表明，在控制溶液穩(wěn)定效果相同的情況下，使用復配穩(wěn)定劑可以降低單一穩(wěn)定劑的添加量，且使體系具有更低的粘度[8]。因此，復配穩(wěn)定劑的應用可能比單一穩(wěn)定劑更具有實際生產(chǎn)意義。