基于ISSR 分子標記的茶樹種質資源的遺傳多樣性及親緣關系分析

張麗麗

（江西建設職業(yè)技術學院，江西南昌 330200）

茶樹作為一種歷史悠久的作物，通過自然培育和人工培育相結合的方式形成豐富的種類，分布范圍極其廣泛。由于茶樹的材質特殊，可在木質雕刻中發(fā)揮良好效果，茶樹葉子制作茶葉、茶樹的種子也可用作榨油，具有良好的經濟效益。茶樹性狀的控制需要依據茶樹種質資源，通過科學的基因選擇和融合，培育出產量高、質量好的茶樹種子[1]，茶樹種質資源的研究本質上是分析茶樹基因，不再依靠茶樹自身進化，而是采用人工的方式選取最佳基因，提升茶樹產量和質量。茶樹種質資源就是茶樹的品種基因，在自然演化后，經由人工選擇形成，作為一種極其重要的物質基礎，可以此為依據創(chuàng)新茶樹品種。茶樹遺傳物質存在于茶樹種質資源之內[2]，根據種質資源的分析結果可知，將高質量的茶樹品種及一些特殊品種的遺傳物質親子相傳。茶樹種質資源分析過程中[3]，分子標記技術的應用逐漸廣泛，作為一種新型技術，采用PCR 技術擴增錨定的ISSR 引物內的DNA 序列，直觀表達茶樹的親緣關系，并分析遺傳背景的差異[4]。所以，以ISSR 分子標記作為核心，深入研究茶樹種質資源，可以在培育茶樹良種方面發(fā)揮較大作用，促進茶葉產業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

從4 個氣候差異較大的城市共采集36 種茶樹材料，將其編號為1～36 作為試驗樣本，進行茶樹種質資源分析試驗。

1.2 提取DNA

通過CTAB 改進法，提取不同茶樹樣本的DNA。首先需要冷凍茶樹種質資源樣本，為了保證材料冷凍效果在其中添加液氮。放入自動研磨儀內，并研磨冷凍后的材料。倘若茶樹樣本研磨得不夠徹底，可以重新冷凍研磨。在研磨后的樣本中滴入提取液，按照提取說明觀察樣本變化，并獲取所有樣本的DNA。針對DNA 樣本檢測結果，記錄不同DNA 樣本的濃度和純度測試結果。根據DNA 濃度添加稀釋液，使得所有樣本濃度保持在20～30 ng·μ/L，并在-20℃條件下保存。

1.3 ISSR 引物的PCR 擴增

茶樹樣本應用ISSR 分子標記的方法形成ISSR 產物，針對每一個DNA 樣本應用PCR 擴增技術。使用溴化乙錠對擴增產物染色處理，利用紫外分析儀進行檢測。之后配制緩沖液，并在電泳上添加6%的聚丙烯酞胺凝膠。通過1min 的94℃變性處理，和40s 的56℃退火，保存處理后的樣本，以便后續(xù)應用。

2 結果分析

2.1 ISSR 引物多態(tài)性

將原茶樹樣本通過PCR 擴增，形成89 條ISSR 引物，在其中選擇14 對穩(wěn)定性較高的擴增條帶。選取的擴增條帶中多態(tài)性百分比達到100%的共有8 條，并且其他引物中也包含或多或少的多態(tài)性條帶，詳細結果如表1 所示。

表1 ISSR 引物擴增結果

由表1 可知，14 對ISSR 引物使原始樣本擴增出156 條條帶，而其中僅有7 條沒有呈現(xiàn)出多態(tài)性條帶，僅占總條帶的4.49%。通過上述表格分箱子可以發(fā)現(xiàn)，ISSR 引物擴增形成的平均多態(tài)性條帶數(shù)達到10.43條，而平均多態(tài)性百分比高達95.19%。由此可見，各種茶樹都存在豐富的遺傳多樣性。

2.2 ISSR 聚類分析

通過茶樹種質資源遺傳距離的分析，針對36 個材料樣本，構建圖1 所示的UPGMA 進化樹。

圖1 UPGMA 進化樹

根據遺傳距離可以將試驗樣本劃分為3 部分，如圖1 中顯示的Group1、Group2、Group3。第1 個類群中一共包含15 個樣本，其中遺傳距離最近的是樣本10和樣本13，合理推斷出樣本10 和樣本13 之間親緣關系很近。第2 個類群中包含9 個樣本，第3 個類群則由12 個樣本組成。在后2 個類群中，一些組合的遺傳距離完全相同，這種現(xiàn)象意味著這些茶樹種質資源具有相似的背景。由UPGMA 進化樹形成3 個類群，計算不同類群的分子方差，可以發(fā)現(xiàn)14 對ISSR 引物的分子變異程度如下所示：根據分析可知，ISSR 引物組間與組內的相似頻率分別達到8%、14%，引物個體基因相似頻率達到78%。在分析不同茶樹樣本的遺傳距離差異后，可得出茶樹的分子遺傳或變異均是以個體為基礎。應用Cervus 軟件模擬不同茶樹樣本之間的親緣關系，得出大部分情況下親緣關系置信度水平超過80%，所以將親緣關系判斷閾值設置為1.00 和1.25，當2 個樣本計算的LOD 值超過閾值，則表明2 個樣本間存在親緣關系。針對試驗結果可知，樣本35 和樣本36 的親緣關系較為明顯，并且二者均與樣本21 存在親緣聯(lián)系。

3 試驗結果討論

根據結論與討論可知，選出的擴增條帶顯示出茶樹樣本的整體多態(tài)性。因此，可以成功識別文中采集的36 份茶樹種質資源材料的遺傳多樣性及親緣關系。

分析茶樹種質資源的多態(tài)性結構，將DNA 樣本的多態(tài)性展現(xiàn)在人們面前，并展示出不同茶樹種質資源群體的變異性。依靠1SSR 分子標記方法展現(xiàn)了不同茶樹種質資源的聚類結果，其中在相同地區(qū)采集的茶樹通常聚為一類，而適制性相同的也會單獨聚類。根據遺傳背景分析可知，很多背景相似度不高的品種，由于遺傳相似性顯示出親緣關系。

茶樹種質資源間的親緣關系取決于遺傳背景。遺傳距離往往隨著遺傳背景的接近而減小，則表明這2 株茶樹存在較近的親緣關系，同時具有較為相似的遺傳相似背景。分析試驗中使用的36 種茶樹樣本，計算出不同茶樹之間具有0.35～0.95 的相似系數(shù)，并且平均相似系數(shù)為0.74。這代表不同茶樹種質資源之間遺傳背景差別較大，親緣關系的遠近也有很大差別，并顯示出了較強的遺傳多樣性。但根據UPGMA 進化樹的分析可知，絕大部分茶樹樣本的遺傳距離都高于0.7，這顯示了大部分茶樹擁有較近的親緣關系，顯示了茶樹群體的遺傳多樣性。根據試驗結果可知，明確不同品種茶樹之間遺傳信息的差別主要是由于地理隔離。因為不同地理區(qū)域內，氣候條件差別較大，使得在相同區(qū)域內的茶樹會頻繁交換基因。由于區(qū)域環(huán)境的限制，相隔較遠的茶樹難以多次交換基因，最終造成了茶樹群體具有豐富的遺傳多樣性，同時很多茶樹之間具有一定的親緣關系。

4 結語

以茶樹種質資源樣本進行試驗，研究茶樹親緣關系，并分析出不同茶樹的遺傳多樣性，在完成PCR 擴增后可篩選出穩(wěn)定性較高的引物，引物表現(xiàn)出了茶樹具有極高的平均多態(tài)性，分析劃分類群后的樣本完成親緣關系。研究結果顯示，多數(shù)茶樹品種之間的遺傳背景差異較大。在茶樹發(fā)展過程中，遺傳多樣性、親緣關系的分析，為茶樹育種提供了支撐，通過茶樹樣本基因型的分析，將結果應用于茶樹雜交培養(yǎng)中，提升優(yōu)秀茶樹品種的概率，推動了未來茶樹新品種選育及種質資源保存。