不同根頸直徑苜蓿生理生化特性對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)

朱愛(ài)民， 黃衛(wèi)麗， 韓國(guó)棟*， 張玉霞， 王顯國(guó)， 武 倩

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院， 草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 農(nóng)業(yè)部飼草栽培、加工與高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 內(nèi)蒙古自治區(qū)草地管理與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 通遼 028041； 4. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 北京 100083)

低溫不僅影響苜蓿(MedicagosativaL.)的地理分布，而且影響苜蓿人工草地的可持續(xù)利用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)苜?？购匝芯枯^多[1-4]，研究表明，苜蓿的抗寒性與其根系保護(hù)酶(超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶)活性強(qiáng)弱有關(guān)[5-9]。寇建村等[10]、朱愛(ài)民等[11]研究表明，低溫鍛煉期苜蓿會(huì)通過(guò)增強(qiáng)根頸中抗氧化酶活性以抵御凍害。除苜蓿根頸中抗氧化酶活性與苜蓿抗寒性密切相關(guān)外，苜蓿根頸中非結(jié)構(gòu)碳氮也被認(rèn)為是抗寒保護(hù)物質(zhì)[12-14]。Krasnak等[15]研究表明，低溫脅迫會(huì)引起苜蓿根內(nèi)的可溶性蛋白含量明顯升高，認(rèn)為可溶性蛋白含量的增加有利于苜蓿根系抵御低溫脅迫，這與Trunova等[16]、Wldngm等[17]的研究結(jié)果相同。除了植物體中可溶性蛋白、可溶性糖外[18]，游離脯氨酸也是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物處于不利環(huán)境條件時(shí)(干旱、寒冷、高溫等)，其對(duì)維持細(xì)胞原生質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡具有重要作用[19]。在一定低溫脅迫范圍內(nèi)，苜蓿能通過(guò)自身調(diào)節(jié)抵御低溫脅迫，但是苜蓿在不同低溫脅迫下發(fā)生怎樣的生理生化反應(yīng)是需要進(jìn)一步研究的問(wèn)題。

苜蓿能否安全越冬不僅取決于自身抗寒能力的強(qiáng)弱，還受環(huán)境因素及種植管理水平的影響，適時(shí)早播對(duì)于提高苜蓿的抗寒性具有重要作用。早播苜?？梢猿浞值睦霉夂蜔?，能保證苜蓿正常的生長(zhǎng)發(fā)育，根系生長(zhǎng)粗壯更有利于其越冬。Schwab等[20]發(fā)現(xiàn)根頸越粗，苜蓿耐寒性越強(qiáng)。然而，對(duì)于根頸直徑對(duì)苜?？购缘呢暙I(xiàn)率以及苜蓿抗寒生理生化變化機(jī)制尚不清楚，因此，本研究在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)不同根頸直徑苜蓿根系低溫脅迫處理，分析了低溫脅迫對(duì)不同頸粗苜蓿根頸生理生化指標(biāo)的影響，以期探明不同根頸直徑苜?？购缘纳砩瘷C(jī)制，這將對(duì)指導(dǎo)北方寒冷地區(qū)苜蓿的高效生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)自然概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市阿魯科爾沁旗牧草生產(chǎn)基地，地理位置為42°30′50″ N，115°27′34″ E。試驗(yàn)地土壤營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)地土壤養(yǎng)分含量Table 1 Soil nutrient content of the test site

1.2 供試材料

試驗(yàn)材料是由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草地研究所提供的‘公農(nóng)1號(hào)’紫花苜蓿品種(MedicagosativaL. ‘Gongnong No.1’)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

大田試驗(yàn)設(shè)計(jì)：于2017年7月1日采用機(jī)械條播的方式進(jìn)行播種，苜蓿播種量為22.5 kg·hm-2。2017年11月10日土壤凍融期對(duì)苜蓿根系取樣，挖取苜蓿根系的深度約為20 cm。在實(shí)驗(yàn)室中用游標(biāo)卡尺對(duì)紫花苜蓿根頸0.5 cm處進(jìn)行測(cè)量，將苜蓿分成根頸直徑大小分別為3.50 mm,5.25 mm,7.00 mm的3個(gè)類(lèi)別，并于4℃恒溫冰箱低溫保存。

低溫處理試驗(yàn)設(shè)計(jì)：將備用的3種直徑大小(3.50 mm,5.25 mm,7.00 mm)苜蓿越冬器官用蒸餾水沖洗干凈。共12個(gè)處理(3個(gè)苜蓿根頸直徑、4個(gè)低溫處理溫度)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株苜蓿根系，根系長(zhǎng)度均控制為15 cm。將根系并排整齊地?cái)[放在厚度為3 mm，長(zhǎng)、寬為30 cm×20 cm的脫脂棉上，包裹好后分別均勻噴灑20 mL蒸餾水，最后用長(zhǎng)、寬為30 cm×30 cm的錫箔紙包好。放在4℃恒溫冰箱中的苜蓿材料作為對(duì)照，其他處理放入低溫程控箱中進(jìn)行低溫處理，處理目標(biāo)溫度分別為-10℃，-15℃和-20℃。低溫程控箱設(shè)置為：以4℃為起點(diǎn)，先以4℃·h-1的速率降溫，到達(dá)設(shè)定溫度后保持6 h，之后以4℃·h-1的速率升溫達(dá)到室溫后取出置于4℃下保持12 h，然后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定[21-22]。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

用刀片對(duì)低溫處理后的苜蓿根頸0～0.5 cm處取樣，并切片，進(jìn)行根頸活力、非結(jié)構(gòu)碳氮和抗氧化酶活性的測(cè)定。根系活力測(cè)定用TTC染色法測(cè)定[23]。其他生理生化指標(biāo)采用鄒琦[24]和郝再彬[25]的測(cè)定方法：可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定；淀粉含量采用蒽酮比色法測(cè)定；游離氨基酸含量采用茚三酮染色法測(cè)定；超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定；過(guò)氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法測(cè)定；過(guò)氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定。

公式中C指苜蓿根頸中的可溶性糖和淀粉含量，N指根頸中的游離氨基酸和可溶性蛋白含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，并制作表格。采用SPSS17.0軟件對(duì)根頸活性、抗氧化酶活性和非結(jié)構(gòu)碳氮等指標(biāo)做雙因素(溫度和根頸直徑)方差顯著性分析，并對(duì)不同低溫處理下不同頸粗苜蓿根頸生理生化指標(biāo)與根頸活力做相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)不同根頸直徑苜蓿生理生化特性的影響

2.1.1溫度、根頸直徑及交互作用對(duì)苜蓿根頸生理生化指標(biāo)的影響 由表2可知，不同根頸直徑的苜蓿在低溫脅迫下其生理生化指標(biāo)變化明顯，其中根頸直徑對(duì)苜蓿根頸活力及根頸中SOD活性有顯著影響(P<0.05)，對(duì)根頸中可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白及C/N具有極顯著影響(P<0.01)。除SOD和POD外，低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸活力、根頸中非結(jié)構(gòu)碳氮、C/N及CAT活性均有極顯著影響(P<0.01)。溫度和根頸直徑的交互作用對(duì)苜蓿根頸活力、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和非結(jié)構(gòu)碳氮比具有顯著影響(P<0.05)，對(duì)淀粉含量有極顯著影響(P<0.01)。

表2 溫度、根頸直徑及交互作用對(duì)苜蓿根頸生理生化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of low temperature,root collar diameter and interaction on physiological and biochemical indexes of alfalfa root collar

2.2 低溫處理對(duì)不同根頸直徑苜蓿根頸活力的影響

由表3可知，隨低溫脅迫強(qiáng)度的加劇不同根頸直徑的苜蓿根頸活力均呈逐漸降低的變化趨勢(shì)。4℃和-10℃處理下的苜蓿根莖活力差異不顯著，但均顯著大于-15℃和-20℃處理(P<0.05)。其中3.5 cm頸粗的苜蓿在-15℃脅迫下，比-10℃脅迫根頸活力下降了78.1%，下降幅度較大，而5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿在-10℃至-15℃脅迫下根頸活力下降幅度分別為52.2%,35.0%。4℃和-20℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸活力顯著大于7 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)，在-10℃處理下不同頸粗苜蓿根頸活力差異不顯著，-20℃處理下3.5 cm和5.25 cm頸粗苜蓿的根頸活力顯著大于7 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)。

表3 低溫處理對(duì)不同根頸直徑苜蓿根頸活力的影響Table 3 Effect of low temperature treatment on root collar activity of alfalfa with different root collar diameters 單位：μg·g-1·h-1

2.3 低溫處理對(duì)不同根頸直徑苜蓿根頸非結(jié)構(gòu)碳氮含量及C/N的影響

由表4可知，隨低溫脅迫強(qiáng)度的加劇不同頸粗的苜蓿根頸中可溶性糖含量均呈增加-降低-增加的變化趨勢(shì)，先在-10℃處理下達(dá)到一個(gè)峰值，后在-15℃處理下降低，在-20℃處理下又顯著增加。除-20℃外，其他低溫處理下3.5 cm和7 cm頸粗的苜蓿根頸中的可溶性糖含量均大于5.25 cm頸粗的苜蓿，且在-10℃下差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表4 低溫處理對(duì)不同根頸直徑苜蓿根頸非結(jié)構(gòu)碳氮含量及C/N的影響Table 4 Effects of low temperature treatment on the content of non-structural carbon and nitrogen and C/N ratio of alfalfa with different collar diameters

隨低溫脅迫強(qiáng)度的加劇不同頸粗的苜蓿根頸中淀粉含量均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，其中3.5 cm和5.25 cm頸粗的苜蓿在-15℃下根頸中的淀粉含量達(dá)到最高，而7 cm頸粗的苜蓿在-10℃下達(dá)到最大。-10℃和-15℃處理下3.5 cm和5.25 cm頸粗的苜蓿根頸中淀粉含量均顯著大于4℃和-20℃處理，-10℃處理下7 cm頸粗的苜蓿根頸中淀粉含量顯著大于4℃,-15℃和-20℃。4℃和-10℃處理下3.5 cm和7 cm頸粗苜蓿根頸淀粉含量顯著大于5.25 cm頸粗的苜蓿，而-15℃處理下3.5 cm和5.25 cm頸粗的苜蓿根頸淀粉含量顯著大于7 cm頸粗的苜蓿。

隨低溫脅迫強(qiáng)度的加劇不同頸粗苜蓿根頸中游離氨基酸的含量均呈先降低后增加的變化趨勢(shì)，3.5 cm頸粗的苜蓿在-15℃處理下最低，而5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿在-10℃下最低。-10℃和-15℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸中游離氨基酸含量顯著大于7 cm頸粗的苜蓿，但與5.25 cm頸粗的苜蓿相比差異不顯著。

不同頸粗苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量變化與可溶性糖含量變化趨勢(shì)一致，隨低溫脅迫強(qiáng)度的加劇呈增加-降低-增加的變化。苜蓿根頸中可溶性蛋白含量均在-15℃下達(dá)到最低，顯著低于4℃和-10℃處理。4℃和-10℃處理下5.25 cm和7 cm頸粗苜蓿根頸中可溶性蛋白含量顯著大于3.5 cm頸粗的苜蓿。

隨低溫脅迫強(qiáng)度的加劇不同頸粗苜蓿根頸中的C/N均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，C/N均在-15℃下達(dá)到最大。-15℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸中C/N顯著大于4℃和-20℃，5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿根頸中的C/N在-15℃和-20℃處理顯著大于4℃，-10℃處理。4℃和-10℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸中C/N顯著大于5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿。

2.4 低溫處理對(duì)不同根頸直徑苜蓿根頸抗氧化酶活性的影響

由表5可知，隨低溫脅迫強(qiáng)度的加劇，3.5 cm頸粗的苜蓿根頸中SOD活性呈先增加后降低的變化，在-15℃處理下達(dá)到最大，5.25 cm頸粗的苜蓿呈逐漸增加的變化，在-20℃處理下最大，7 cm頸粗的苜蓿在4℃,-15℃處理下較高，顯著大于-20℃處理(P<0.05)。隨苜蓿根頸直徑的增加，4℃處理下苜蓿根頸中SOD活性逐漸增加，-10℃和-15℃處理下根頸中SOD活性逐漸降低，-20℃處理下根頸中SOD活性呈先增加后降低變化。

表5 低溫處理對(duì)不同根頸直徑苜蓿根頸抗氧化酶活性的影響Table 5 The effect of low temperature treatment on antioxidant enzyme activity of alfalfa root collar with different diameters

4℃和-20℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸中POD活性顯著大于-10℃處理(P<0.05)。4℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸POD活性顯著大于7 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)，但與5.25 cm頸粗的苜蓿相比差異不顯著。-10℃處理下5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿根頸POD活性顯著大于3.25 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)。

隨低溫脅迫強(qiáng)度的加劇不同頸粗苜蓿根頸中CAT活性均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，3.5 cm和5.25 cm頸粗的苜蓿根頸CAT活性在-10℃處理下最高，而7 cm頸粗的活性則在-15℃下達(dá)到最大。-15℃處理下7 cm頸粗的苜蓿根頸中CAT活性顯著大于3.5 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)，-20℃處理下3.5 cm和5.25 cm頸粗的苜蓿根頸中CAT活性顯著大于7 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)。

2.5 根頸直徑、溫度和根頸活力與非結(jié)構(gòu)碳氮及抗氧化酶活性的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明(表6)，苜蓿根頸直徑大小與根頸中的可溶性蛋白含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。溫度高低與苜蓿根頸中可溶性糖含量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，與可溶性蛋白含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，與根頸中C/N比呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表6 根頸直徑、溫度與非結(jié)構(gòu)碳氮含量、C/N及抗氧化酶活性的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of C/N ratio,non-structural carbon,nitrogen and antioxidant enzyme activity with temperature and root collar diameter

由表7可知，苜蓿根頸活力與根頸中可溶性糖含量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，與可溶性蛋白含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，與CAT活性呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，與根頸中C/N呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表7 苜蓿根頸活力與根頸中非結(jié)構(gòu)碳氮及抗氧化酶活性的相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis of alfalfa root collar activity with non-structural carbon,nitrogen and antioxidant enzyme activities in root collar

3 討論

根頸活力是判斷植物抗寒性大小的重要指標(biāo)[27-28]，研究表明[22]，低溫脅迫后苜蓿植株根頸活力會(huì)明顯下降，通過(guò)測(cè)定苜蓿根頸活力的大小可以判斷苜?？购缘膹?qiáng)弱。本研究表明，苜蓿根頸活力對(duì)低溫的響應(yīng)極其敏感，根頸直徑較小的苜蓿耐受低溫的能力小，說(shuō)明根頸直徑小的苜?？购暂^弱，根頸直徑較大的苜?？购暂^強(qiáng)。

前人的研究表明[16-17]，苜蓿根頸中可溶性糖、可溶性蛋白及游離氨基酸含量的升高有利于苜?？购缘脑鰪?qiáng)。本研究中，根頸直徑和低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸中可溶性糖和可溶性蛋白含量均有顯著影響，但兩個(gè)因素交互作用影響卻未達(dá)到顯著水平。說(shuō)明根頸直徑較粗的苜?？赡軙?huì)通過(guò)調(diào)節(jié)根頸中可溶性糖和可溶性蛋白含量的降低以消除低溫脅迫的影響。C/N間接反映植物組織中非結(jié)構(gòu)碳氮物質(zhì)含量，是衡量植物抗逆性的重要指標(biāo)，研究表明植物根系C/N越高對(duì)植物越冬越有利[29]。本研究發(fā)現(xiàn)不同頸粗的苜蓿根頸中可溶性糖和可溶性蛋白含量隨溫度的降低變化趨勢(shì)一致，但游離氨基酸含量變化趨勢(shì)則不同，說(shuō)明不同頸粗苜蓿在低溫脅迫下調(diào)節(jié)根頸中非結(jié)構(gòu)碳氮含量的能力不同。研究表明[22,30]，苜蓿耐受低溫脅迫的能力是有限的，即一定溫度的低溫脅迫條件下苜蓿能通過(guò)自身的生理生化調(diào)節(jié)以適應(yīng)低溫環(huán)境，當(dāng)溫度超過(guò)苜蓿耐受低溫脅迫的極限時(shí)，苜蓿根系將會(huì)受到凍傷或凍害。本研究中不同頸粗苜蓿根頸中CAT活性與非結(jié)構(gòu)碳氮比變化趨勢(shì)一致，均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，但不同頸粗的苜蓿根頸中CAT活性最強(qiáng)處的脅迫溫度不同。說(shuō)明根頸中CAT參與了苜蓿抵御低溫脅迫的自身調(diào)節(jié)過(guò)程，且不同頸粗苜蓿耐低溫和調(diào)控能力不同[9,11]。

相關(guān)性分析和雙因素方差分析均表明苜蓿根頸可溶性蛋白含量與苜蓿根頸大小密切相關(guān)，溫度和根頸活力與可溶性糖、可溶性蛋白、CAT活性和C/N關(guān)系密切，說(shuō)明不同根頸直徑的苜蓿在受到低溫脅迫時(shí)通過(guò)調(diào)控根頸中可溶性蛋白、可溶性糖、CAT活性和C/N以適應(yīng)或抵御低溫脅迫[11,26,31]。結(jié)合根頸活力值的變化及不同頸粗苜蓿根頸中生理生化指標(biāo)變化的拐點(diǎn)溫度，研究認(rèn)為，當(dāng)在目標(biāo)溫度低溫脅迫處理6 h時(shí)，3.5 cm頸粗的苜蓿耐受低溫的極限溫度在-10℃至-15℃之間，而5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿耐受低溫的極限在-15℃至-20℃之間。在一定低溫脅迫范圍內(nèi)，苜蓿通過(guò)增加根頸中CAT活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量及調(diào)節(jié)根頸中的非結(jié)構(gòu)碳氮比以抵御低溫脅迫，但當(dāng)?shù)蜏孛{迫溫度超過(guò)苜蓿的耐受極限時(shí)則苜蓿根頸中CAT活性會(huì)迅速降低逐漸失活，而可溶性蛋白和可溶性糖含量則會(huì)先降低后迅速增加，這可能與根頸中可溶性糖和可溶性蛋白進(jìn)一步水解有關(guān)[32]，仍需進(jìn)一步的研究加以佐證。

4 結(jié)論

苜蓿通過(guò)調(diào)控根頸中可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、過(guò)氧化氫酶活性和非結(jié)構(gòu)碳氮比以適應(yīng)或抵御低溫脅迫，根頸直徑小的苜蓿調(diào)控能力較弱，根頸直徑較大的苜蓿調(diào)控能力較大。當(dāng)在目標(biāo)溫度低溫脅迫處理6 h時(shí)，3.5 cm頸粗的苜蓿耐受低溫的極限溫度在-10℃至-15℃之間，而5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿耐受低溫的極限在-15℃至-20℃之間。