β-葡萄糖苷酶固體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

王振麗，李書華，王婷婷

（河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院，河南平頂山 467000）

大豆異黃酮是大豆生長中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，是一類重要的生理活性物質(zhì)，如防治心腦血管疾病、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、改善婦女更年期綜合癥等。大豆異黃酮主要有兩種存在形式—游離型的苷元（Aglycon）和結(jié)合型的糖苷（Glycosides）兩類，從大豆中提取的大豆異黃酮中游離的苷元占總量的2%～3%，糖苷占總量的97%～98%，而糖苷形式的大豆異黃酮不具有最佳的生理活性狀態(tài)，很難被人體直接吸收，必須要經(jīng)過β-葡萄糖苷酶作用，生成苷元形式才易被人體吸收[1-2]。充分發(fā)揮菌株的產(chǎn)酶性能還需提供最佳產(chǎn)酶條件[3-5]，因此，β-葡萄糖苷酶的固體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究十分重要。

1 材料與方法

1.1 菌種與固體培養(yǎng)基

米曲霉3042，由遼寧省微生物科學(xué)研究院菌種保藏中心提供。黑豆：麩皮為2∶3、培養(yǎng)基中加水量與固體物料比為1.5∶1，KH2PO40.1%、MgSO40.1%、(NH4)2SO40.5%、水楊苷0.01%，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器

高壓滅菌鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱、7230型分光光度計、恒溫水浴鍋（北京）、低溫高速離心機（Sigma）、超聲波細胞粉碎機。

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)酶固體發(fā)酵

將培養(yǎng)42 h后的液體種子接入產(chǎn)酶固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接入量為10%，28 ℃恒溫培養(yǎng)，當(dāng)菌體孢子大量長出時取出，在研缽中研磨至小碎片后稱取5 g加入50 mL蒸餾水，室溫浸泡提取4 h，用紗布過濾，濾液于4 ℃離心后取上清液，測其β-葡萄糖苷酶的酶活力，測定時取相應(yīng)的0.05 mol·L-1pH為4.5的檸檬酸緩沖液稀釋。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶活力的測定

取3支10 mL洗凈干燥的具塞刻度試管，編號后每支加1 mL的0.5%水楊苷檸檬酸緩沖液，1號管加1mL的DNS溶液作為空白對照，將3支試管同時在50 ℃水浴中預(yù)熱5～10 min，加酶液0.5 mL，搖勻，置沸水浴5 min，冷卻后用蒸餾水定容至10 mL，混勻，于540 nm處測A值。將每小時分解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖（葡萄糖計）所需的酶量定義為1個酶活力單位u/mL。

2 結(jié)果分析

2.1 產(chǎn)酶的最適溫度

如圖1所示，當(dāng)溫度達到32 ℃時，酶活力達到最高，此后隨著溫度升高酶活力下降，說明菌株產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)溫度為32 ℃。

圖1 溫度對產(chǎn)酶的影響

2.2 產(chǎn)酶發(fā)酵的最適初始pH值

由圖2可知，pH在4.0時菌株產(chǎn)酶能力很低，當(dāng)pH達到6.0時產(chǎn)酶能力最高，當(dāng)pH為7.0時酶活力開始下降，表明該菌株在發(fā)酵初始pH為5.5～7時產(chǎn)酶能力均相對較強，該菌的最適產(chǎn)酶pH為6.0。

圖2 pH對產(chǎn)酶的影響

2.3 發(fā)酵周期

由圖3可知，菌株在最佳發(fā)酵條件下進行培養(yǎng)，隨著發(fā)酵時間的延長產(chǎn)酶能力逐漸提高，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)到84 h時，出現(xiàn)產(chǎn)酶最高峰，酶活力達1 345.63 u·mL-1，隨后隨著發(fā)酵培養(yǎng)時間的延長產(chǎn)酶能力逐漸下降，其最佳發(fā)酵培養(yǎng)時間為84 h。

3 結(jié)論與討論

（1）在最適固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，優(yōu)化米曲霉3042產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最佳培養(yǎng)條件，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)適宜培養(yǎng)條件為發(fā)酵培養(yǎng)溫度為32 ℃，發(fā)酵初始pH6.0，發(fā)酵培養(yǎng)時間為84 h。

（2）大豆異黃酮苷元有利于動物的吸收利用，在一定條件下，大豆異黃酮苷元含量在β-葡萄糖苷酶作用下顯著增加。因此，提高β-葡萄糖苷酶的酶活力，對利用其轉(zhuǎn)化結(jié)合型大豆異黃酮的研究具有重要的意義。