田數(shù)，李力群，鄭美玲，郭春生，葉亞軍，陳晨，趙怡凡，張峻松

1.內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

0 引言

氨基酸是煙草中重要的含氮化合物之一，對煙草的感官評吸品質(zhì)和吸煙者的健康有很大影響[1-5].在調(diào)制和醇化過程中，煙葉中的氨基酸會與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成一系列醛類、醇類、雜環(huán)類等對煙草香味有重要影響的化合物[6-10]. 在卷煙燃吸過程中，氨基酸則會產(chǎn)生燒焦羽毛的氣味，對煙氣吸味造成不良影響[11]. 一般認為，氨基酸含量過高，抽吸時刺激性強烈，而含量太低時，則煙氣勁頭不足，豐滿度差[12-15].

刺激性是指抽吸卷煙時煙氣對感官產(chǎn)生的一種不舒適感受，具體表現(xiàn)為對口腔的沖刺和撞擊，使舌面產(chǎn)生毛刺和辣感. 刺激性作為評價卷煙內(nèi)在品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，一直是行業(yè)內(nèi)研究的熱點[16]. 近年來，關(guān)于游離氨基酸與刺激性的關(guān)聯(lián)性已有多項研究成果. 王光耀等[17]研究發(fā)現(xiàn)，酰胺類游離氨基酸與卷煙刺激性存在極顯著正相關(guān)關(guān)系；鄧國賓等[12]通過主成分分析及相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，酪氨酸、蛋氨酸與卷煙刺激性呈顯著正相關(guān)關(guān)系；殷延齊等[11]研究發(fā)現(xiàn)，不同品牌卷煙中各種氨基酸的含量分布對卷煙刺激性的評價有一定參考價值. 但目前尚未見到基于卷煙中游離氨基酸含量構(gòu)建評價模型來預(yù)測卷煙刺激性指標(biāo)的研究報道. 鑒于此，本研究擬以市場上12種不同風(fēng)格的卷煙為研究對象，采用高效液相色譜法對其游離氨基酸進行測定，利用主成分分析法建立一種基于游離氨基酸含量的卷煙刺激性評價模型，通過對卷煙抽吸時刺激性大小的預(yù)測優(yōu)化制備工藝，提升卷煙內(nèi)在品質(zhì).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

購買市售的12種不同風(fēng)格卷煙，分別是綿柔香(C1)、自然本香(C2)、烤甜香(C3)、清甜香(C4)、酒香(C5)、樹苔香(C6)、清香(C7)、焦甜香(C8)、復(fù)合香(C9)、淡雅香(C10)、本草香(C11)、奶甜香(C12).

天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu),以上試劑純度均≥99%，三乙胺、氫氧化鈉、鹽酸、冰乙酸(分析純)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；醋酸鈉、鄰苯二甲醛(純度為99%)，甲醇、四氫呋喃、乙腈(色譜純)，四硼酸鈉(優(yōu)級純)，購自天津市富宇精細化工有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制樣品溶液制備：將剝離后的卷煙煙絲于40 ℃條件下干燥2 h，利用磨粉機粉碎、過40目篩后混合均勻，密封儲存. 稱取粉碎后的煙末2.0 g(精確至0.000 1 g)于50 mL容量瓶中，用0.1 mol/mL的鹽酸溶液定容后超聲萃取20 min，再以9000 r/min的轉(zhuǎn)速高速離心20 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，即得樣品溶液.

氨基酸工作液的配制：分別稱取16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，以0.1 mol/mL的鹽酸溶液配制濃度為2.5 μmol/mL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液;移取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制濃度分別為4 nmol/mL、20 nmol/mL、50 nmol/mL、125 nmol/mL、250 nmol/mL、2500 nmol/mL的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液.

衍生化試劑的配制：稱取鄰苯二甲醛固體5 mg于2 mL色譜瓶中，加入0.1 mL甲醇，再加入1 mL 濃度為0.4 mol/L的硼酸緩沖液(pH=10.4)，充分振蕩溶解，再加入20 μL 3-巰基丙酸，混勻后置于4 ℃的冰箱中,備用.

1.2.2 高效液相色譜分析條件流動相A：稱取2.494 g醋酸鈉溶于適量水中，加入200 μL三乙胺，用體積分數(shù)為1%的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，再加入3 mL四氫呋喃，定容至1 L，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，備用. 流動相B：稱取13.608 g醋酸鈉溶于適量水中，用體積分數(shù)為1%的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，定容至1 L；取醋酸鈉溶液200 mL，分別加入400 mL甲醇、400 mL乙氰，混勻后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，備用.

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫40 ℃，流速為1 mL/min，進樣量10 μL；熒光檢測器激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長450 nm.流動相洗脫程序：0～0.5 min，0%～1%流動相B；0.5～17 min，1%～7%流動相B；17～21 min，7%～10%流動相B；21～30 min，10%～13%流動相B；34～37 min，13%～100%流動相B；37～42 min，100%流動相B；42～45 min，100%～0%流動相B；45～55 min，100%流動相A.

樣品溶液和氨基酸工作液衍生化反應(yīng)由自動進樣器完成，自動進樣程序參照馮雷等[18]的方法進行.

1.2.3 卷煙感官評吸參照《卷煙 第4部分 感官技術(shù)要求》(GB 5604.4—2005)[19]，組織內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司技術(shù)中心評吸委員會7名成員進行評吸，對刺激性指標(biāo)進行打分. 滿分20分，分值越高,表明刺激性越小.

1.3 統(tǒng)計分析方法

對實驗數(shù)據(jù)進行整理，利用SPSS 25.0進行相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析.

從此，他們搬到東泉嶺茶樓來住了。林燕已經(jīng)長成一個小姑娘了，跟紅琴小時候一模一樣，看著林燕，風(fēng)影的心中就隱隱作痛，林間微涼的風(fēng)吹拂著他們，他仿佛進入了一個迷蒙的意境，一個關(guān)于小和尚與小女孩的純美記憶。他做夢也不會想到，那個天使一般的小女孩紅琴，有朝一日會成為這個混沌世界的祭品。他什么話也沒有說，眼睛清澈如水，似有淚光閃爍，一朵孤云從深谷飄起，也映入了他的眼簾。隨后，他的眼中便水汽氤氳了。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸含量與刺激性關(guān)系模型

2.1.1 游離氨基酸含量與刺激性的差異性分析對工作標(biāo)準(zhǔn)溶液進行色譜測定，以各氨基酸濃度(X)為橫坐標(biāo)，各組分響應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標(biāo)建立回歸方程，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間及回歸方程見表1. 由表1可知，16種氨基酸在4～2500 nmol/mL濃度范圍內(nèi)均線性良好(R2≥0.99)，可以滿足卷煙煙絲中16種氨基酸的檢測分析要求.

表1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間及回歸方程Table 1 Retention time and regression equation of amino acid standards

不同風(fēng)格卷煙中游離氨基酸含量分析結(jié)果如表2所示. 由表2可知，在12種卷煙樣品中均檢測到上述16種游離氨基酸，不同風(fēng)格卷煙中游離氨基酸含量差異明顯. 從游離氨基酸的總含量來看，其變化范圍為852.09～1 810.22 μg/g. 其中C7中游離氨基酸總含量最高，為1 810.22 μg/g，C4(1 739.75 μg/g)和C1(1 721.98 μg/g)次之，C1卷煙的葉組配方以四川煙葉為主要原料，而C4和C7卷煙的葉組配方以云南煙葉為主要原料. 這兩個產(chǎn)區(qū)煙葉中多數(shù)游離氨基酸含量中等偏高，但丙氨酸含量較高，這與袁帥等[20]的研究結(jié)果一致. C5卷煙以貴州煙區(qū)煙葉為主要原料，該煙區(qū)煙葉游離氨基酸含量較低[20]，因此C5卷煙中游離氨基酸總含量最低，為852.09 μg/g. 從各種游離氨基酸的含量來看，不同風(fēng)格卷煙中Asp含量均大于其余15種氨基酸含量，占氨基酸總量的21.76%～29.90%，這與殷延齊等[11]的研究結(jié)果基本一致；Gly、Lys含量在各類型卷煙中均未超過1%；C11中Met的含量明顯高于其他類型卷煙.

表2 不同風(fēng)格卷煙中游離氨基酸含量Table 2 Free amino acid contents in different styles of cigarettes μg/g

卷煙感官評吸刺激性得分結(jié)果如表3所示. 由表3可知，C5、C6和C9卷煙刺激性指標(biāo)得分為18.14～19.36，基本感受不到刺激性；C2、C3、C4、C8、C10、C11、C12刺激性指標(biāo)得分為16.00～17.57，略有刺激性；C1和C7刺激性指標(biāo)得分分別為15.57和15.00，刺激性較強.

表3 卷煙刺激性感官評吸得分結(jié)果Table 3 Sensory evaluation score of cigarette irritation 分

2.1.2 游離氨基酸含量與刺激性的相關(guān)性分析對12種風(fēng)格卷煙的16種游離氨基酸與刺激性指標(biāo)得分進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4. 由表4可見，各氨基酸指標(biāo)之間既有正相關(guān)又有負相關(guān)，絕大多數(shù)相關(guān)關(guān)系的絕對值大于0.5，表明指標(biāo)間具有較強的相關(guān)性[21].特別地，Asp與Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Tyr、Phe、Ile、Lys存在極顯著(P<0.01)正相關(guān)，與Val、Trp和Leu存在顯著(P<0.05)正相關(guān).Met與其他氨基酸均不存在顯著相關(guān)性(P≥0.05).Ile與Phe呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達0.968，高于其他所有相關(guān)系數(shù). 游離氨基酸總含量與刺激性指標(biāo)得分之間呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)，表明游離氨基酸含量越高，刺激性指標(biāo)得分越低，卷煙刺激性越大，這與殷延齊等[11]的研究結(jié)果相似. 另外，除Met外，其余氨基酸均與刺激性得分之間呈現(xiàn)顯著負相關(guān)性，說明氨基酸含量與刺激性得分的原始指標(biāo)之間存在較多的共性，直接采用原始指標(biāo)進行聚類分析會造成信息的重疊，影響結(jié)果的客觀性，因此要先對原始指標(biāo)進行降維[22].

表4 不同風(fēng)格卷煙游離氨基酸與刺激性指標(biāo)得分間相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between free amino acids and irritation index scores in different styles of cigarettes

2.1.3 游離氨基酸主成分分析及模型的建立對不同風(fēng)格卷煙的16種氨基酸進行主成分分析，得到第一主成分的特征值和貢獻率分別為13.00和81.23%，第二主成分的特征值和貢獻率分別為1.24和7.73%，兩個主成分的累積貢獻率達到88.96%，可以用這兩個主成分描述游離氨基酸的整體水平.

由主成分載荷矩陣(見表5)可知，第一主成分主要反映Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Tyr、Val、Trp、Phe、Ile、Lys、Leu共15種游離氨基酸指標(biāo)的信息，當(dāng)?shù)谝恢鞒煞值梅衷礁邥r，說明這15種游離氨基酸含量越高；Met在第二主成分上的載荷值大于0.9，即第二主成分主要反映Met含量指標(biāo)的信息，且當(dāng)?shù)诙鞒煞值梅衷礁邥r，說明Met游離氨基酸含量越高.

表5 主成分載荷矩陣Table 5 Principal component load matrix

以16種游離氨基酸含量為初始自變量，按順序分別記為X1～X16，根據(jù)各主成分的載荷向量除以各主成分特征值的算術(shù)平方根，得出兩個主成分的方程表達式如下；F1=0.240X1+0.267X2+0.266X3+

0.263X4+0.268X5+0.273X6+0.272X7+

0.257X8+0.266X9+0.238X10+0.033X11+

0.261X12+0.266X13+0.260X14+0.252X15+

0.214X16

F2=-0.170X1+0.061X2+0.112X3-

0.119X4-0.074X5+0.066X6+0.094X7+

0.106X8+0.136X9-0.250X10+0.873X11+

0.052X12-0.152X13-0.147X14+0.136X15+

0.003X16

以第一、二主成分貢獻率大小為分配系數(shù)，對兩個主成分得分進行加權(quán)求和，可得F=0.913F1+0.087F2.不同風(fēng)格卷煙游離氨基酸含量的綜合得分(F)及排名如表6所示. 游離氨基酸含量與卷煙刺激性大小呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系，即游離氨基酸含量綜合得分越高表示該卷煙刺激性越大，因此,以前述函數(shù)作為綜合評價模型預(yù)測卷煙刺激性大小.

由表6可知，第一、二主成分得分最高的分別是C7和C11. 從不同風(fēng)格卷煙游離氨基酸主成分綜合得分排名可知，C7綜合評分最高，C5最低，表明不同風(fēng)格卷煙的游離氨基酸含量存在差異性.預(yù)測C5刺激性最高、C6次之、最后是C7. 12種卷煙游離氨基酸平均綜合得分為0，在平均得分附近的有C12、C3、C10、C11、C8和C2，綜合得分為-1.395～0.720；遠大于平均得分的有C1、C4和C7，綜合得分為4.598～5.134；遠低于平均得分的有C9、C6和C5，綜合得分分別為-3.036、-3.830和-4.391.

表6 不同風(fēng)格卷煙游離氨基酸 含量的綜合得分及排名Table 6 Comprehensive score and ranking of free amino acid content in different styles of cigarettes

2.2 模型驗證

2.2.1 基于卷煙游離氨基酸聚類分析的模型驗證將12種不同風(fēng)格卷煙的16種氨基酸含量作為變量，利用SPSS 25.0軟件對其進行聚類分析. 采用Ward法，選擇歐氏距離進行分析，得到不同風(fēng)格卷煙的氨基酸含量樹狀聚類圖(見圖1). 由圖1可知，在歐式距離為2.5時，12種卷煙可分為5類，C2、C8、C10、C3、C12聚為一類，結(jié)合氨基酸總量(表2)和刺激性得分結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，該類卷煙游離氨基酸總含量適中，略有刺激性；C5、C6和C9聚為一類，該類卷煙游離氨基酸總含量較低，基本感受不到刺激性；C1、C7聚為一類，該類卷煙游離氨基酸總含量較高，刺激性較強；C4聚為一類；C11聚為一類. 聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果基本一致，這也驗證了綜合評價模型的可靠性.

圖1 不同風(fēng)格卷煙游離氨基酸含量樹狀聚類圖Fig.1 The tree cluster diagram of free amino acids content in different styles of cigarettes

2.2.2 基于卷煙刺激性感官評價的模型驗證基于前期卷煙感官評吸得到的刺激性指標(biāo)得分評價結(jié)果，利用Pearson相關(guān)性分析法，將兩種分值進行對比分析，結(jié)果如表7所示. 由表7可知，兩種方法呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為-0.87，該結(jié)果可以進一步驗證該模型的可靠性. 感官評吸得到的刺激性指標(biāo)平均得分與刺激性指標(biāo)模型綜合得分在排序上存在一定的差異性，可能是受到評吸人員和環(huán)境的影響，造成兩者結(jié)果存在一定偏差.

表7 感官評吸結(jié)果與模型評價結(jié)果對比Table 7 Comparison of sensory evaluation results and model evaluation results

3 結(jié)論

本文利用高效液相色譜法測定了12種風(fēng)格卷煙中游離氨基酸的含量，通過差異性分析、相關(guān)性分析、主成分分析建立基于游離氨基酸卷煙刺激性綜合評價模型，并通過聚類分析法和刺激性感官評價對該模型進行驗證. 結(jié)果表明：12種卷煙中游離氨基酸在含量上存在較大差異，Asp在各卷煙中含量最高；建立了綜合評價模型F=0.913F1+0.087F2，通過聚類分析可將12種卷煙分為5類，與綜合評價模型預(yù)測結(jié)果基本一致；12種卷煙刺激性感官評價得分排序與綜合評價模型預(yù)測的刺激性得分排序大體一致；以該模型計算不同類型卷煙游離氨基酸綜合評價得分，得分越高表示該卷煙刺激性越大，12種卷煙得分從低到高分別為C5