孕激素通過FOXO1對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制

劉維華，鐘燕燕，鄭 洪

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是女性生殖系統中死亡率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅女性的生命健康。據最新數據顯示，2018年，全球新確診出29.5萬多例卵巢癌患者，超過18萬名女性因該病死亡[1]。盡管手術切除聯合鉑類化療的治療方案取得了一定的治療效果，但由于該病早期癥狀不明顯，多數患者確診時已為伴有轉移晚期，總體治愈率仍然很低[2]。因此，探究影響卵巢癌細胞發(fā)生發(fā)展的作用機制是有必要的。

卵巢是孕激素的主要靶器官，流行病學調查結果顯示[3]，口服避孕藥、妊娠(尤其多胎妊娠)及哺乳等可起到預防卵巢癌的作用。這些均表明孕激素對卵巢具有保護作用。FOXO1屬于叉頭框(Forkhead box,FOX)轉錄因子O亞家族的成員之一，是磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)與絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)/細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-rugulatedkinasea,ERK)等信號通路的共同下游分子[4]。而在腫瘤中，由于RAS、張力蛋白基因(Phosphatase and tensin homolog,PTEN)或PI3K等上游基因的突變，這些信號通路經常處于異常激活狀態(tài)，均可使FOXO1發(fā)生磷酸化而失活，促進腫瘤進展[5]。FOXO1在人類多種腫瘤如肺癌、結腸癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、子宮內膜癌、骨肉瘤等中表達降低，激活其表達可抑制腫瘤生長，因此被認為是一種重要的腫瘤抑制因子[6-9]。Diep等[10]研究表明，孕激素可通過孕激素受體B(Progesterone Receptor-B,PR-B)靶向FOXO1，誘導細胞周期抑制基因p21的表達，使細胞周期停滯于G0期，促進卵巢癌細胞衰老。這提示在卵巢癌中，孕激素可通過FOXO1對卵巢癌起到抑制作用。

Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤進展密切相關，在包括卵巢癌等許多實體腫瘤中均存在該通路的異常激活，其激活標志信號為β-catenin表達的明顯升高[11]。Wnt/β-catenin信號通路在維持細胞干性和與PI3K/AKT通路的串擾中起著關鍵作用[12]。因此，本實驗擬使用FOXO1抑制劑AS1842856抑制FOXO1的表達活性，在體外通過單獨或聯合應用孕激素和AS1842856檢測其對卵巢癌HO-8910細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并結合Western blot檢測FOXO1和β-catenin的蛋白表達情況，探索孕激素在卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲中的作用機制是否與調節(jié)FOXO1-β-catenin有關，以期為卵巢癌的激素治療和靶向治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人高級別漿液性卵巢癌HO-8910細胞株，購于江蘇齊氏生物科技有限公司。BI胎牛血清購于以色列Biological industries公司；孕激素購于美國Med Chem Express公司；FOXO1抑制劑AS1842856購于美國Selleck生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司；Transwell小室購于美國Corning公司；Matrigel基質膠購于美國BD Biosciences公司；兔抗人FOXO1單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人β-catenin單克隆抗體購于英國abcam公司；鼠抗人GAPDH單克隆抗體購于武漢三鷹Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清，1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，于恒溫 37℃、5%CO2濃度、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HO-8910細胞。實驗均選用對數生長期的HO-8910細胞進行，每組實驗重復3次。

1.2.2 CCK-8法分別檢測不同濃度孕激素和AS對HO-8910細胞增殖的影響 為了明確孕激素和FOXO1抑制劑AS1842856(AS)對卵巢癌HO-8910細胞體外生長情況的影響，并分別選擇一個適宜濃度進行后續(xù)單獨或聯合加藥實驗。本實驗參照前期研究設定的孕激素濃度范圍及相關參考文獻，選用不同濃度(0、2.5、5、10、20 μmol/L)的孕激素和不同濃度(0、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L)的AS分別作用于卵巢癌HO-8910細胞24、48、72 h，檢測其對細胞增殖活性的影響。收集制備HO-8910細胞懸液(5×104個/mL)，接種于96孔板中，100 μL/孔。待細胞貼壁后，加入含不同濃度孕激素和含不同濃度AS的完全培養(yǎng)基，分別以0 μmol/L的孕激素組和0 μmol/L的AS組為對照組，同時設置空白組，每組3個復孔。分別作用24、48、72 h后，加入100 μL/孔含10% CCK-8的檢測試劑，培養(yǎng)箱中溫育2～3 h，測定450 nm處的吸光度值(Optical density value，OD)。細胞存活率=(加藥組OD值﹣空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3 孕激素和AS單獨或聯合作用對各組HO-8910細胞的影響

1.2.3.1 實驗分組 實驗分4組：對照組(等量不含藥物的完全培養(yǎng)基)、孕激素(10 μmol/L)組、AS(1 μmol/L)組、AS(1 μmol/L)+孕激素(10 μmol/L)組，作用48 h。

1.2.3.2 CCK-8法檢測各組HO-8910細胞的增殖情況 除實驗分組的藥物作用濃度和作用時間不同外，其余步驟均同1.2.2。

1.2.3.3 Transwell實驗檢測各組HO-8910細胞的遷移和侵襲情況 細胞遷移實驗：Transwell小室的下室分別加入600 μL/孔的含10%血清的各組含藥培養(yǎng)基，上室加入100 μL/孔的不含血清的各組含藥細胞懸液(5×105個/mL)，每組3個復孔，作用48 h。固定，染色，倒置顯微鏡觀察拍照并隨機選取5個視野計數。細胞侵襲實驗：除用50 μL/孔的Matrigel基質膠包被膜上室面并水化外，其余步驟均與細胞遷移實驗相同。

1.2.3.4 Western blot檢測各組HO-8910細胞的FOXO1和β-catenin蛋白表達情況 分別收集各組藥物作用48 h后的細胞，加入裂解液，冰上裂解40 min，離心取上清，BCA法蛋白定量。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，蛋白上樣20 μg/孔，電泳，切膠，轉膜，封閉，孵育一抗FOXO1(1∶1 000)、β-catenin(1∶7 500)、GAPDH(1∶1 000)，4℃過夜。次日，TBST充分洗膜。室溫孵育二抗1.5 h，TBST充分洗膜。滴加ECL發(fā)光液，曝光顯影。Image J軟件分析圖像。

2 結果

2.1 不同濃度的孕激素和AS分別對卵巢癌HO-8910細胞增殖的影響 不同濃度(0、2.5、5、10、20 μmol/L)的孕激素和不同濃度(0、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L)的AS分別作用于HO-8910細胞24、48、72 h后，同一作用時間不同濃度之間的細胞存活率比較，分別以0 μmol/L孕激素組和0 μmol/L AS組為對照組，同一濃度不同作用時間之間的細胞存活率比較均以0 h的細胞存活率為對照，設為100.00%。結果顯示：(1)與對照組相比，除2.5 μmol/L孕激素作用24 h組無顯著差異(P>0.05)外，其余各組均顯示抑制作用(P<0.05)。孕激素濃度越高，作用時間越長，對細胞增殖的抑制作用越強。(2)與對照組相比，除4 μmol/L AS作用48 h，2 μmol/L AS作用72 h，4 μmol/L AS作用72 h時表現為抑制作用外，其余不同作用時間不同濃度的AS對HO-8910細胞均具有促進作用(P<0.05)，且在AS濃度為1 μmol/L時，促進作用最強。結合實驗結果，10 μmol/L孕激素作用48 h可明顯抑制HO-8910細胞的增殖，1 μmol/L AS作用48 h可明顯促進細胞增殖。因此，采用10 μmol/L孕激素和1 μmol/L AS單獨或聯合作用48 h進行后續(xù)實驗(見表1)。

表1 不同濃度的孕激素和AS分別對HO-8910細胞增殖的影響

2.2 孕激素和AS單獨或聯合作用對卵巢癌HO-8910細胞增殖的影響 與對照組相比，孕激素組細胞增殖活性減低(P<0.05)，AS組細胞增殖活性升高(P<0.05)，AS+孕激素組細胞增殖活性減低(P<0.05)。與孕激素組相比，AS+孕激素組細胞增殖活性升高(P<0.05)；與AS組相比，AS+孕激素組細胞增殖活性減低(P<0.05，見圖1)。

*：該組與對照組比較，P<0.05；#：該組與孕激素組、AS組比較，P均<0.05。圖1 各組HO-8910細胞的增殖情況

2.3 孕激素和AS單獨或聯合作用對卵巢癌HO-8910細胞遷移和侵襲的影響 將4組進行單因素方差分析，4組差異具有統計學意義，4組均數不完全相等(F=76.07,P<0.05),再進一步進行兩兩比較。與對照組相比，孕激素組細胞遷移和侵襲數量減少(P<0.05)，AS組細胞遷移和侵襲數量增多(P<0.05)，AS+孕激素組細胞遷移和侵襲數量減少(P<0.05)。與孕激素組相比，AS+孕激素組細胞遷移和侵襲數量增多(P<0.05)；與AS組相比，AS+孕激素組細胞遷移和侵襲數量減少(P<0.05,見圖2～3)。

*：該組與對照組比較，P<0.05；#：該組與孕激素組、AS組比較，P均<0.05。圖3 各組HO-8910細胞的遷移和侵襲細胞數量

2.4 孕激素和AS單獨或聯合作用對卵巢癌HO-8910細胞FOXO1和β-catenin蛋白表達的影響 與對照組相比，孕激素組FOXO1蛋白表達增多(P<0.05)，β-catenin蛋白表達減少(P<0.05)；AS組FOXO1蛋白表達減少(P<0.05)，β-catenin蛋白表達增多(P<0.05)；AS+孕激素組FOXO1蛋白表達減少(P<0.05)，β-catenin蛋白表達減少(P<0.05)。與孕激素組相比，AS+孕激素組的FOXO1蛋白表達減少(P<0.05)，β-catenin蛋白表達增多(P<0.05)。與AS組相比，AS+孕激素組的FOXO1蛋白表達無統計學差異(P>0.05)，β-catenin蛋白表達減少(P<0.05，見圖4～5)。

圖4 各組HO-8910細胞中FOXO1和β-catenin的蛋白表達情況

A： HO-8910細胞中FOXO1；B：β-catenin的蛋白相對表達量；*：該組與對照組相比，P<0.05；&：該組與孕激素組相比，P<0.05；#：該組與孕激素組、AS組相比，P均<0.05。圖5 各組HO-8910細胞中FOXO1和β-catenin的蛋白相對表達量

3 討論

本實驗結果顯示，孕激素濃度越高，作用時間越長，對卵巢癌HO-8910細胞增殖活性的抑制作用越強。這與沈倩倩等[13]的孕激素能抑制卵巢癌細胞的增殖，促進細胞凋亡的研究結果相符。據文獻報道[14-15]，FOXO1抑制劑AS在1 μmol/L時可顯著抑制FOXO1的轉錄活性及蛋白表達。本研究結果顯示，1 μmol/L AS作用48 h可明顯抑制HO-8910細胞中FOXO1的蛋白表達，與之相符。綜合實驗結果及聯合用藥的需要，故后續(xù)實驗擬用10 μmol/L孕激素及1 μmol/L AS單獨或聯合作用48 h檢測其對HO-8910細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

本實驗結果顯示，10 μmol/L孕激素可以顯著抑制卵巢癌HO-8910細胞的增殖、遷移和侵襲能力，這與傅優(yōu)等[16]研究結果相符。Jeon等[17]研究也顯示孕激素在卵巢癌細胞中具有抗增殖和抗轉移的作用，與本實驗結果相符。本實驗結果顯示，用1 μmol/L AS抑制FOXO1后，卵巢癌HO-8910細胞增殖、細胞遷移和侵襲能力均增強，這表明抑制FOXO1后可明顯降低FOXO1的腫瘤抑制作用。Paik等[18]關于基因工程小鼠模型(GEMMs)的研究表明，FOXO1，FOXO3和FOXO4的所有6個等位基因完全喪失會顯著誘導以胸腺淋巴瘤和血管瘤為特征的進行性癌癥，同樣說明FOXO1失活可消除其腫瘤抑制功能，與本實驗研究結果相符。

本實驗結果顯示，10 μmol/L孕激素作用于卵巢癌HO-8910細胞后，FOXO1的蛋白表達上調，表明孕激素可能具有誘導FOXO1蛋白表達的作用。Yin等[19]研究表明，孕激素可通過與PRs結合，抑制PI3K/AKT信號通路，上調核FOXO1的表達，抑制子宮內膜異位癥的發(fā)生發(fā)展，與本研究觀點相符。與只加入10 μmol/L孕激素相比，當加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，FOXO1蛋白表達減少，卵巢癌HO-8910細胞的增殖、遷移和侵襲能力都相對增強。該結果表明，孕激素可能通過FOXO1對卵巢癌HO-8910細胞的增殖、遷移和侵襲發(fā)揮抑制作用。與Diep等[10]的孕激素可通過PR-B靶向FOXO1，誘導卵巢癌細胞細胞周期阻滯，促進細胞衰老的研究結果相符。這提示在卵巢癌中，孕激素可通過FOXO1對卵巢癌起到抑制作用。與只加入1 μmol/L AS相比，加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，FOXO1蛋白表達未見明顯變化，卵巢癌HO-8910細胞的增殖、遷移和侵襲能力都相對減低，同時低于對照組，說明FOXO1抑制劑AS對FOXO1活性表達的抑制作用強于孕激素對FOXO1的誘導作用，同時孕激素可能還通過其他機制抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲。例如，有研究表明，孕激素可通過調節(jié)PI3K/AKT途徑增加nm23-H1表達并抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲[17]；孕激素可通過降低粘著斑激酶(FAK)和Src磷酸化，抑制卵巢癌細胞的遷移侵襲[20]等，可見孕激素抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展機制復雜，多種機制參與了卵巢癌進展。

經典Wnt/β-catenin信號通路是與腫瘤轉移密切相關的一條信號通路，在許多腫瘤中激活表達，β-catenin是該信號通路的關鍵調節(jié)分子[17]。本實驗結果顯示，10 μmol/L孕激素作用于卵巢癌HO-8910細胞后，β-catenin的蛋白表達下調，說明孕激素可能具有抑制β-catenin蛋白表達的作用。Nagendra等[21]的研究表明孕激素可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來抑制小鼠模型中漿液性卵巢癌細胞的生長，這與本研究結果相符。本實驗結果顯示，加入1 μmol/L AS后，β-catenin蛋白表達上調，表明在卵巢癌HO-8910細胞中抑制FOXO1可上調β-catenin的蛋白表達。Ling等[12]的研究發(fā)現，FOXO1過表達可抑制CCND1的表達抑制胰腺癌PDAC細胞周期從G0/G1到S的轉變，而CCND1是Wnt/β-catenin信號轉導的靶標，并表明FOXO1的下調導致Wnt/β-catenin信號通路活性增強，促進PDAC細胞增殖和上皮-間質轉化(EMT)。Lin等[22]的研究顯示，MiR-5188可直接靶向降低FOXO1的蛋白表達水平誘導β-catenin的激活，介導腫瘤干細胞的增殖，轉移，化學耐藥和c-Jun信號轉導。Zhang等[23]的研究結果表明，MiR-27a可通過靶向FOXO1活化Wnt/β-catenin信號通路促進卵巢癌細胞的EMT，均與本研究結果相符。與只加入1 μmol/L AS組相比，加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，β-catenin的蛋白表達量減少，說明孕激素還可能通過其它機制抑制卵巢癌HO-8910細胞β-catenin的蛋白表達。例如，Feng等[24]研究顯示，孕激素可通過調節(jié)H19和miR-152的表達來調節(jié)Wnt/β-catenin信號傳導途徑來改善子宮內膜息肉癥。與只加入10 μmol/L孕激素相比，加入1 μmol/L AS抑制FOXO1后再加入10 μmol/L孕激素，β-catenin的蛋白表達量增多，說明抑制FOXO1后，孕激素對β-catenin蛋白表達的抑制作用減弱，孕激素可能通過上調FOXO1抑制β-catenin的蛋白表達。Wang 等[25]研究表明，孕激素可通過誘導DKK1和FOXO1的表達，抑制Wnt/β-catenin信號傳導，從而起到維持子宮內膜穩(wěn)態(tài)，抑制子宮內膜癌進展的作用，與本研究結果相似。

綜上所述，本實驗結果表明，孕激素對卵巢癌HO-8910細胞的增殖、遷移和侵襲均具有抑制作用，該作用可能是孕激素通過促進FOXO1進而抑制β-catenin的蛋白表達實現的。然而，本實驗在一株細胞系中進行，結果相對較單一，仍需進一步增加細胞系或動物實驗來驗證實驗結果。同時孕激素受體有PR-A、PR-B、PGRMC1、PGRMC2等類型，它們在孕激素對卵巢癌細胞發(fā)揮作用中的作用及其機制如何仍有待探索，以更好地為卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機制研究和臨床治療提供理論基礎。