香蕉CASP家族全基因組鑒定與分析

季宇航, 張春渝, 李 丹, 賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

凱氏帶(Casparian strip)是被子植物中位于內(nèi)皮層細(xì)胞四周并呈帶狀環(huán)繞在內(nèi)皮層徑向壁和橫向壁上的結(jié)構(gòu)，控制皮層和維管柱之間的物質(zhì)運(yùn)輸[1]。植物根系吸收的水分和礦質(zhì)元素一般通過兩種途徑進(jìn)入細(xì)胞：一種是通過細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙的質(zhì)外體途徑；另一種是通過質(zhì)膜和原生質(zhì)的共質(zhì)體途徑。由于凱氏帶的存在和內(nèi)皮層細(xì)胞的物理結(jié)構(gòu)，水和礦質(zhì)元素不能從質(zhì)外體進(jìn)入細(xì)胞，所有的水分和無機(jī)鹽只有經(jīng)過內(nèi)皮層的原生質(zhì)體才能進(jìn)入維管柱[2]。凱氏帶蛋白(Casparian strip membrane domain proteins, CASP)是特異性出現(xiàn)在凱氏帶形成區(qū)域的膜蛋白[3]，對凱氏帶的形成起著至關(guān)重要的作用。目前，凱氏帶基因在一些物種中已有研究。Roppolo et al[3]發(fā)現(xiàn)擬南芥的5個凱氏帶蛋白存在功能冗余的現(xiàn)象，例如CASP1-1異常卻不影響凱氏帶的阻滯功能，推測凱氏帶的形成是多基因形成的復(fù)合體共同作用完成的[4]。Wang et al[5]在水稻根內(nèi)胚層細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，OsCASP1基因能在水稻根內(nèi)與其同源基因發(fā)生互作合成復(fù)合物從而影響凱氏帶的形成。OsCASP1～OsCASP5基因中僅有OsCASP1參與凱氏帶的形成過程，對水稻根中礦質(zhì)元素，尤其是鈣和硅的吸收起作用[6]。除此之外，凱氏帶蛋白還參與了植物耐寒、鹽脅迫等生命過程[7-8]。丁長慶[9]研究表明，西瓜CICASPL及其同源基因AtCASPL4CI在低溫脅迫下都能夠被誘導(dǎo)表達(dá)，二者能夠負(fù)調(diào)控植株的低溫抗性。

香蕉(Musaspp.)是熱帶、亞熱帶廣泛種植的水果，對溫度的變化極其敏感，耐低溫能力差。低溫逆境對香蕉的產(chǎn)量與品質(zhì)產(chǎn)生巨大的影響。目前，尚未見有關(guān)香蕉CASP基因的系統(tǒng)分析及其在低溫下表達(dá)情況的報(bào)道。本研究以香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中A、B基因組的CASP家族基因數(shù)據(jù)為種子序列，通過生物信息學(xué)分析手段對香蕉全基因組CASP家族基因進(jìn)行鑒定，并結(jié)合香蕉低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對CASP在低溫下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，旨在為香蕉CASP基因家族功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用的香蕉基因組序列來源于香蕉基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http：//banana-genome-hub.southgreen.fr/)，所用擬南芥、水稻的參考序列分別從TAIR(http：//www.arabidopsis.org/)和Phytozome(http：//www.phytozome.net/)網(wǎng)站下載。

1.2 香蕉CASP家族成員基本信息及理化性質(zhì)的獲得

基于香蕉基因組數(shù)據(jù)庫下載了CASP家族基因CDS序列、氨基酸序列、基因結(jié)構(gòu)注釋信息文件以及全基因組序列，通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上的Blast軟件(E=1e-5)在線篩選香蕉A、B基因組中的CASP基因家族成員。通過Pfam、CDD進(jìn)行成員保守結(jié)構(gòu)域的檢測，將得到的結(jié)果在Tbtools軟件[10]中進(jìn)行可視化后進(jìn)一步篩選。

將香蕉A、B基因組的CASP基因的氨基酸序列分別輸入到Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)軟件進(jìn)行在線分析，從而得到該基因家族的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果。

1.3 香蕉CASP基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

將香蕉基因數(shù)據(jù)庫上下載的氨基酸序列文件導(dǎo)入NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行CDD搜索，用Tbtools軟件將得到的結(jié)果進(jìn)行可視化。根據(jù)香蕉基因組數(shù)據(jù)庫下載的基因注釋文件，采用Tbtools軟件分別對香蕉A、B基因組的CASP家族基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

1.4 構(gòu)建香蕉基因組CASP家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹

用MEGA 7.0的Clustal W對香蕉A、B基因組的CASP基因進(jìn)行多重序列比對，而后調(diào)整默認(rèn)參數(shù)將自展法系數(shù)(bootstrap)調(diào)整為1 000，并采用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建擬南芥、水稻與香蕉A、B基因組CASP成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 香蕉CASP家族的啟動子順式作用元件預(yù)測分析

將香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中的CASP家族基因序列導(dǎo)入Tbtools軟件，提取各成員轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp的序列作為啟動子序列，采用Plantcare軟件進(jìn)行CASP家族成員的順式作用元件預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉CASP家族成員基本信息及理化性質(zhì)分析

2.1.1 A基因組 香蕉CASP家族經(jīng)Blast多重篩選后得到61個成員。其中，A基因組有44個，根據(jù)命名法編號為MaCASP01～MaCASP44。44位成員的CDS長度介于459～858 bp之間，相對分子質(zhì)量介于38.9～72.6 kU之間，等電點(diǎn)介于5.05～5.22之間。

2.1.2 B基因組 香蕉B基因組中共有17個CASP成員，根據(jù)命名法編號為MbCASP01～MbCASP17。17個成員的CDS長度介于240～996 bp之間，相對分子質(zhì)量介于19.8～266.6 kU之間，等電點(diǎn)位于5.04～5.34之間。

2.2 香蕉CASP家族基因結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域分析

2.2.1 A基因組 香蕉CASP家族成員在基因結(jié)構(gòu)上多表現(xiàn)為內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)。其中，A基因組中CASP家族成員的基因大小在1～12 kb之間，內(nèi)含子1～3個，外顯子2～4個(圖1A)。MaCASP06、MaCASP07、MaCASP08、MaCASP26和MaCASP41的內(nèi)含子均為1個，MaCASP12、MaCASP18以及MaCASP22的內(nèi)含子有3個，其余基因的內(nèi)含子均為2個。除了MaCASP19，其余成員單個外顯子在基因組上的跨度都較小。此外，MaCASP16不存在保守結(jié)構(gòu)域，其余成員都至少存在1個保守結(jié)構(gòu)域，主要為DUF588和MARVEL保守結(jié)構(gòu)域(圖1B)。

A.基因結(jié)構(gòu)；B.保守結(jié)構(gòu)域。圖1 香蕉A基因組CASP家族成員的基因結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域Figure 1 Gene structure and conserved domain of CASP family members in banana A genome

2.2.2 B基因組 由圖2A可知，B基因組中CASP家族成員的基因大小在0.5～4.5 kb之間，內(nèi)含子0～7個，外顯子1～8個。MbCASP01、MbCASP02、MbCASP05、MbCASP09、MbCASP10、MbCASP11和MbCASP16的單個內(nèi)含子長度較大，且MbCASP11的內(nèi)含子數(shù)目最多。香蕉B基因組的CASP家族成員蛋白分布中除MbCASP03、MbCASP09以外，其余蛋白主要含有DUF588和MARVEL保守結(jié)構(gòu)域(圖2B)。此外，B基因組中MbCASP04、MbCASP05、MbCASP07與MbCASP17的保守結(jié)構(gòu)域長度較短，可能由于蛋白的保守結(jié)構(gòu)域有缺失。

A.基因結(jié)構(gòu)；B.保守結(jié)構(gòu)域。圖2 香蕉B基因組CASP家族成員的基因結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域Figure 2 Gene structure and conserved domain of CASP family members in banana B genome

2.3 構(gòu)建香蕉CASP家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用MEGA 7.0對香蕉A、B基因組以及水稻、擬南芥等3個物種共計(jì)113條CASP基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建(圖3)。參考擬南芥和水稻的聚類分析，根據(jù)基因的結(jié)構(gòu)特征及同源性分析可將系統(tǒng)進(jìn)化樹中的香蕉A、B基因組的CASP家族成員大致分為5組。由圖3可以看出，香蕉A、B基因組和水稻、擬南芥的CASP基因在各組中均有分布，分布在同一個組中的基因具有較近的親緣性。

圖3 香蕉A(Ma)、B(Mb)基因組以及水稻(Os)、擬南芥(At)CASP家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic trees of CASP genes in banana A genome (Ma), banana B (Mb) genome , rice (Os) and Arabidopsis (At)

2.4 香蕉CASP基因家族成員啟動子順式作用元件分析

2.4.1 A基因組 對啟動子順式作用元件進(jìn)行分析是了解基因家族的重要方式[11]。本研究利用PlantCare在線軟件預(yù)測香蕉CASP家族的啟動子順式作用元件。從圖4可見，A基因組中CASP家族成員存在16種順式作用元件，其中光響應(yīng)元件最多。此外，還有眾多功能各異的特異型元件，比如影響玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)、種子特異性調(diào)節(jié)、水楊酸響應(yīng)、低溫響應(yīng)、茉莉酸甲酯響應(yīng)、參與晝夜節(jié)律控制、赤霉素響應(yīng)、胚乳表達(dá)、干旱誘導(dǎo)性、細(xì)胞周期調(diào)控、生長素響應(yīng)、缺氧特異性誘導(dǎo)、脫落酸響應(yīng)以及MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)等順式作用元件。各成員包含的元件在種類和數(shù)目上不盡相同，這種差異意味著各成員參與信號通路的能力及生物學(xué)功能可能不同[12]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MaCASP01、MaCASP02、MaCASP08、MaCASP11、MaCASP18、MaCASP19、MaCASP22、MaCASP24、MaCASP25和MaCASP36等多個基因上含有影響低溫調(diào)控的順式作用元件，表明香蕉A基因中CASP家族成員可能參與抗寒的逆境機(jī)制調(diào)節(jié)過程。此外，約40%的基因中含有影響干旱調(diào)控的順式作用元件，說明A基因組中CASP家族基因可能在抗旱逆境調(diào)節(jié)中起作用。

圖4 香蕉A基因組CASP家族的順式作用元件Figure 4 Cis-acting elements of CASP family in banana A genome

2.4.2 B基因組 經(jīng)篩選，B基因組中CASP家族成員存在11個主要順式作用元件(圖5)。與A基因組不同的是，B基因組中存在影響類黃酮生物合成基因調(diào)控和分生組織表達(dá)的元件。MbCASP01中含有3個生長素反應(yīng)元件，暗示著該基因可能在生長素反應(yīng)中發(fā)揮作用。MbCASP12、MbCASP13、MbCASP14、MbCASP16和MbCASP17中只包含光響應(yīng)元件，說明這5個基因可能主要參與光響應(yīng)。MbCASP1、MbCASP3、MbCASP4、MbCASP6、MbCASP7、MbCASP9和MbCASP11都含有3種以上的順式作用元件，表明這些基因可能在植物的生理調(diào)控上起重要的作用。MbCASP04和MbCASP15等基因含有低溫響應(yīng)元件，表明這些基因可能參與香蕉的低溫逆境響應(yīng)過程。約30%存在參與干旱調(diào)節(jié)的響應(yīng)元件，暗示著這些基因可能與抗旱機(jī)制調(diào)節(jié)相關(guān)。

圖5 香蕉B基因組CASP家族的順式作用元件Figure 5 Cis-acting elements of CASP family in banana B genome

2.5 香蕉CASP家族在低溫下的表達(dá)分析

通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對香蕉CASP的低溫表達(dá)情況分析表明，在13 ℃下，4個成員(MaCASP20、MaCASP26、MaCASP27、MaCASP44)的表達(dá)量較28 ℃顯著升高；6個成員(MaCASP21、MaCASP19、MaCASP32、MaCASP43、MaCASP11、MaCASP16)在4 ℃時呈特異表達(dá)；MaCASP10在0 ℃時呈現(xiàn)特異表達(dá)(圖6)。以上表明，這些成員在低溫下可能發(fā)揮作用。

圖6 香蕉CASP家族成員在不同低溫處理下的表達(dá)分析Figure 6 Expression analysis of CASP gene family members under different low temperature treatments in banana

3 討論

3.1 香蕉CASP家族可能具有功能多樣性

MYB轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控木質(zhì)部的形成影響凱氏帶的結(jié)構(gòu)從而在植物的形態(tài)建成、生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用[13]。凱氏帶能夠阻斷植物中物質(zhì)的被動運(yùn)輸[14]，其功能與結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。香蕉A、B基因組的CASP家族基因都含有大量的MYB結(jié)合位點(diǎn)，猜測其可能間接影響凱氏帶的結(jié)構(gòu)。根據(jù)前人研究，CASP家族作為廣泛存在于被子植物物質(zhì)運(yùn)輸途徑的家族，對凱氏帶的形成發(fā)揮了重要作用[4-7]。此外，香蕉CASP基因家族中還含有其他眾多類型的順式作用元件，其中光響應(yīng)元件數(shù)量最多，可以判斷CASP家族基因?qū)円构?jié)律調(diào)控有較大的影響。基因中還包括許多激素、生長素反應(yīng)的元件，說明香蕉CASP基因家族可能參與了植物的多項(xiàng)生命過程。

3.2 CASP家族在香蕉A、B基因組及不同物種中具有序列差異性

從基礎(chǔ)理化性質(zhì)來看，相較于A基因組，B基因組中的CASP家族編碼氨基酸的數(shù)目跨度更大，相對分子質(zhì)量差異也比較顯著。此外，MaCASPs的結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)含子、外顯子跨度小且具有較強(qiáng)的連續(xù)性。MbCASPs則在結(jié)構(gòu)上有所缺失，不同基因的內(nèi)含子與外顯子數(shù)目差異較大。從順式作用元件分析可以看出，兩者都具有較多類型的響應(yīng)元件，但不同于A基因組的是，B基因組中CASP基因可能與類黃酮等生物合成有關(guān)。

CASP家族在不同的物種中也存在差異。相較于水稻、擬南芥的CASP家族成員數(shù)量，香蕉CASP成員數(shù)量較多，A基因組有44個、B基因組有17個。猜測香蕉CASP家族基因的成員數(shù)比其他植物多的原因可能與其經(jīng)歷了3次全基因組復(fù)制有關(guān)[15]。CASP蛋白在不同的物種中也存在保守結(jié)構(gòu)域上的差異。在擬南芥、香蕉中存在CASPL(MARVEL)結(jié)構(gòu)域，而目前在水稻中并未發(fā)現(xiàn)相似的保守結(jié)構(gòu)域。說明CASP基因家族成員在不同物種中存在一定的差異。

3.3 香蕉CASP家族可能參與逆境脅迫過程

從A、B基因組的元件類型可以看出，CASP家族基因?qū)δ婢痴{(diào)控元件有較強(qiáng)烈的應(yīng)答，推測可能參與多種抗逆境反應(yīng)。Yang et al[7]研究發(fā)現(xiàn)，西瓜中存在編碼冷誘導(dǎo)膜蛋白的ClCASPL基因，該基因與擬南芥的類CASP基因(AtCASPL4C1)存在較高的同源性，且都對植物的耐寒性起到一定的作用。劉煒?gòu)O[16]研究表明，香蕉中存在4種抗寒重疊基因，對抗逆境脅迫產(chǎn)生顯著影響。香蕉A、B基因組的CASP家族中同樣存在低溫響應(yīng)順式作用元件，說明可能參與了低溫脅迫的響應(yīng)。分析低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，MaCASP的一些成員可能在低溫誘導(dǎo)下特異表達(dá)。說明它們可能在香蕉的低溫響應(yīng)中起作用，具體功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。