辣椒子葉離體再生及組織細胞學分析

高 藝,魏紹琦,匡雪梅,邱義蘭

(湖南師范大學生命科學學院作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點實驗室,中國湖南長沙410081)

辣椒屬茄科,富含維生素和多種礦質(zhì)元素等營養(yǎng)成分,同時具有藥用價值,是一種深受人們喜愛的重要的蔬菜作物和調(diào)味品,在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。采用傳統(tǒng)育種方法選育優(yōu)良辣椒品種耗時耗力,而且易造成作物遺傳多樣性的下降和有益基因的流失。在高效離體再生體系基礎(chǔ)上開展的轉(zhuǎn)基因技術(shù),是定向改良辣椒目標性狀和開展功能基因組學研究的有力工具,但其巨大潛力的發(fā)揮依賴于高效離體培養(yǎng)再生體系的建立。辣椒屬于頑拗型離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化的植物[1～4]。自Gunay于1978年首次開展辣椒組培工作至今四十余年,相繼有關(guān)于探索辣椒離體再生的文獻報道。據(jù)報道,辣椒離體再生的成功取決于辣椒基因型、培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、植物生長調(diào)節(jié)劑濃度與組合、生長室光溫條件、外植體類型等[4～6]。然而,當前辣椒離體再生技術(shù)主要停留在芽誘導階段,仍然存在芽難以伸長、生根困難等問題。為了探索辣椒離體再生不定芽的伸長,一些研究者通過添加GA3誘導不定芽伸長,但芽的伸長效率低,且存在基因型依賴等問題[4,7～8]。因此,辣椒通過組織培養(yǎng)獲得再生體系的技術(shù)一直未獲得重大突破。這限制了辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和基因工程在辣椒遺傳改良上的應用,故亟待建立高效、穩(wěn)定的辣椒離體再生體系。此外,雖然有關(guān)辣椒子葉離體再生的組織細胞學研究有零星的報道[9～10],但對其起源和發(fā)育過程缺乏系統(tǒng)的研究。在本研究中,我們選取辣椒骨干親本8214B子葉為實驗材料,建立了一種適于辣椒離體再生的方法,同時對其發(fā)生發(fā)育過程進行了細胞學研究,為辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立、進一步開展辣椒基因功能的驗證和應用基因工程技術(shù)對辣椒遺傳改良的有效應用等方面的工作奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料來自湖南省蔬菜研究所創(chuàng)制的辣椒骨干親本8214B。該材料具有抗逆強、配合力高、適應廣等優(yōu)勢,已成功育出多個優(yōu)良的辣椒新品種,并在我國大面積推廣,是我國應用范圍最廣的骨干親本之一[11]。

外植體選用辣椒無菌苗子葉。

1.2 無菌苗培養(yǎng)

挑選健康無病菌的辣椒8214B種子,用純凈水浸種約48 h后轉(zhuǎn)入超凈工作臺中進行表面消毒處理。先用75%乙醇對辣椒種子消毒60 s,然后用0.1%升汞消毒10 min,接著用無菌水沖洗4次,每次2 min,最后將種子接種于MB培養(yǎng)基(MS大量元素+MS微量元素+MS鐵鹽+B5有機成分,添加3%白糖和0.5%瓊脂粉,pH=5.8)上進行光照培養(yǎng)(溫度25℃±2℃ ,光強2 500 lx,光周期14 h光照/10 h黑暗,下同)。約10 d,種子開始萌發(fā),生長7 d后形成無菌苗。

1.3 子葉離體再生的誘導

選取即將展開或剛展開的無菌苗子葉,用鋒利的無菌刀片把子葉(帶葉柄)切下,去除葉尖,將兩端各有切口的子葉接種于誘導培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)(溫度25℃±2℃),子葉腹面朝上、背面朝下接觸培養(yǎng)基。誘導培養(yǎng)基以MB為基本培養(yǎng)基,添加IAA(0.05 mg/L)與不同濃度配比的6-BA(0 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、7.0 mg/L、9.0 mg/L)和/或 ZT(0 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、7.0 mg/L、9.0 mg/L)組合(pH=5.8),每個組合接種子葉不超過20個,每個組合設(shè)4次重復。暗培養(yǎng)20 d后觀察離體子葉再生的誘導和生長情況,統(tǒng)計再生誘導率。

離體子葉再生誘導率(%)=誘導再生的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%,下同。

1.4 子葉離體再生的組織細胞學觀察

植物材料選取8214B帶柄子葉外植體,釆用前面優(yōu)化的最適誘導培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對子葉進行離體培養(yǎng)(1對子葉/瓶),每3 d取樣1次,重復4次,共取樣10次,進行石蠟切片制作[12],光學顯微鏡(Olympua-bx51,日本)觀察拍照并分析結(jié)果。

1.5 離體子葉不定芽的伸長

1.5.1 GA3對不定芽伸長的影響

將子葉離體再生誘導形成的葉狀體置于不同濃度GA3配比的誘導培養(yǎng)基中進行光照培養(yǎng),10 d繼代一次,20 d后觀察不定芽伸長情況,并統(tǒng)計不定芽的伸長頻率。誘導不定芽伸長的培養(yǎng)基以MB為基本培養(yǎng)基,在上述獲得的適宜誘導培養(yǎng)基的激素組合的基礎(chǔ)上添加不同濃度配比的GA3(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L),每個組合接種10個再生誘導形成葉狀體的離體子葉,每瓶1個離體子葉,設(shè)4次重復。

不定芽伸長率(%)=誘導不定芽伸長的子葉數(shù)/接種的子葉總數(shù)×100%,下同。

1.5.2 刪減葉狀體對不定芽伸長的影響

用鋒利的無菌刀片切除葉狀體,只留1～2對呈對生狀的長條形葉狀體,在伸長培養(yǎng)基中進行光照培養(yǎng),7～8 d繼代一次,20 d后觀察不定芽伸長情況,并統(tǒng)計不定芽的伸長頻率。伸長培養(yǎng)基配方:MB為基本培養(yǎng)基,添加IAA(0.05 mg/L)與不同濃度配比的 6-BA(1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、7.0 mg/L、9.0 mg/L)和/或 ZT(1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、7.0 mg/L、9.0 mg/L)組合(pH=5.8)。每個處理接種6對子葉,每瓶1對子葉,重復4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體子葉的再生誘導

辣椒離體子葉在再生誘導過程發(fā)生了一系列的形態(tài)變化。離體子葉先進行暗培養(yǎng):暗培養(yǎng)3 d時可見子葉由碧綠轉(zhuǎn)為黃綠；暗培養(yǎng)5 d時子葉增大增厚,兩端切口處開始形成愈傷組織；暗培養(yǎng)10 d時子葉體積進一步增大,在葉柄端切口可見淺黃色透明狀愈傷組織,葉尖端切口形成白色愈傷組織；暗培養(yǎng)21 d時子葉葉柄端切口處誘導再生形成黃色葉狀體(圖1A)。隨后,經(jīng)暗培養(yǎng)的離體子葉見光培養(yǎng),7 d后子葉顏色由淺黃色轉(zhuǎn)為綠色,在子葉背面形成白色愈傷組織,葉柄端切口處再生的葉狀體轉(zhuǎn)綠,且體積明顯增大(圖1B)。

圖1 辣椒離體子葉在再生誘導過程中的形態(tài)變化(Bars=0.2 cm)(A)暗培養(yǎng)21 d的離體子葉,葉柄端切口處再生黃色葉狀體,葉尖端切口再生白色愈傷組織；(B)暗培養(yǎng)21 d后再光照培養(yǎng)7 d的離體子葉,子葉及葉柄端再生的葉狀體轉(zhuǎn)綠且體積明顯增大。Fig.1 Morphological changes of cotyledon explants during induction of in vitro regeneration(Bars=0.2 cm)(A)Cotyledon explants cultured in vitro in darkness for 21 days.Light yellow leafy structures can be seen at the petiole end and white calli at the opposite end；(B)Cotyledon explants cultured in darkness for 21 days and then under light for 7 days.The color of cotyledons changed from light yellow to green,and leafy structures significantly enlarged and their color changed from yellow to green.

外源激素對辣椒離體子葉再生誘導的效果見表1。從表1中可看出,帶柄子葉是一種很容易誘導再生的外植體,單獨添加6-BA和ZT或者不同濃度6-BA和ZT的組合均能100%誘導帶柄子葉葉柄端切口再生形成葉狀體,但不能形成可正常伸長的不定芽,其再生形成的葉狀體的狀態(tài)存在差異。單獨添加1.0～9.0 mg/L 6-BA,帶柄子葉的葉柄端切口分化的葉狀體呈玫瑰花瓣狀,且數(shù)量較多；1.0～4.0 mg/L 6-BA條件下子葉形成的愈傷組織相對少,葉狀體生長緩慢,而5.0～9.0 mg/L 6-BA條件下子葉形成的愈傷組織較多,葉狀體生長較快。單獨添加不同濃度ZT誘導子葉再生的葉狀體形態(tài)存在明顯差異:低濃度ZT(1.0～3.0 mg/L)條件下形成的葉狀體短小呈玫瑰花瓣狀,其數(shù)量也少；ZT濃度增加至5.0～9.0 mg/L時,子葉葉柄端切口處形成的葉狀體較大,大部分葉狀體呈玫瑰花瓣狀,少部分呈長條形。然而,由于ZT誘導子葉形成的愈傷組織少,葉狀體生長緩慢。不同濃度6-BA和ZT組合能100%誘導子葉葉柄端切口再生形成葉狀體,且數(shù)量較多,但是不同濃度組合誘導再生的葉狀體狀態(tài)及其生長存在差異:低濃度6-BA和低濃度ZT組合誘導的葉狀體的體積小呈玫瑰花瓣狀,數(shù)量較少,生長緩慢,隨著6-BA和ZT濃度的增加,誘導的葉狀體體積較大且數(shù)量多,當6-BA≥5.0 mg/L時,由于子葉形成較多的愈傷組織,葉狀體生長較快。3.0～9.0 mg/L ZT和5.0～9.0 mg/L 6-BA組合均能使子葉再生較多的葉狀體,大部分葉狀體呈玫瑰花瓣狀,少部分呈長條形(包括極少數(shù)對生的長條形),且葉狀體生長快,因此該濃度組合適宜于子葉離體再生的誘導。

表1 不同濃度ZT和/或6-BA配比對辣椒離體子葉再生的影響Table 1 Effects of different concentrations of ZT and/or 6-BA on in vitro regeneration of cotyledons in pepper

2.2 離體子葉再生的組織細胞學觀察

辣椒子葉由表皮、皮層和維管組織組成。表皮包括上表皮和下表皮,兩者均由單層細胞緊密排列。皮層分為柵欄組織和海綿組織,柵欄組織靠近上表皮,細胞呈柱狀緊密排列,海綿組織細胞形狀不規(guī)則,排列疏松。維管束散布在皮層中,由大維管束和小維管束組成。培養(yǎng)3～3.5 d后,離體子葉葉柄端切口處的上表皮以及與維管束之間近腹面一側(cè)的薄壁細胞去分化,細胞分裂活躍,尤其是上表皮及其內(nèi)側(cè)薄壁細胞染色較深,具有大的細胞核和濃厚的細胞質(zhì)(圖2A,B)；此時,葉柄端切口附近的細胞未去分化,細胞分裂不活躍(圖2C)。培養(yǎng)5～7 d后,離體子葉葉柄端切口處上表皮及其內(nèi)側(cè)薄壁細胞脫分化并分裂形成分生細胞團(圖2D),此時葉柄端切口附近的上表皮內(nèi)側(cè)薄壁細胞也發(fā)生脫分化并進行活躍的細胞分裂,形成染色較深的分生細胞團(圖2E)；分生細胞團的形成具有時空分布特征,它們在上表皮不同部位先后形成(圖2F)。當培養(yǎng)8～11 d時,分生組織細胞團明顯增大,但未見典型的芽分化,隨著分生組織細胞團的增大其分化形成葉狀體。在子葉離體培養(yǎng)過程中形成兩種分生細胞團:一種是單個分生細胞團,在分裂和分化過程中呈球形和心形(圖2G),其隨著體積的增大最后分化形成長條形的葉狀體(圖3H)；另一種類型是在分裂和分化過程中幾個相鄰的分生細胞團連在一起,它們最終形成花瓣狀的葉狀體(圖2I,J)。

圖2 辣椒子葉葉柄端離體再生的組織細胞學觀察(Bars=50 μm)(A)離體培養(yǎng)3 d的子葉切口處,上表皮及與維管束之間腹面一側(cè)薄壁細胞染色較深；(B)圖A的局部放大,上表皮及內(nèi)側(cè)薄壁細胞質(zhì)濃厚,細胞核大；(C)離體培養(yǎng)3.5 d的子葉近切口處,表皮及薄壁細胞未見脫分化；(D)離體培養(yǎng)5.5 d的子葉切口處,上表皮及內(nèi)側(cè)薄壁細胞脫分化,分裂活躍開始形成分生細胞團；(E)離體培養(yǎng)6.5 d的子葉近切口處,誘導形成的分生細胞團；(F)離體培養(yǎng)6.5 d的子葉切口處,上表皮不同部位先后形成分生細胞團；(G)離體培養(yǎng)7.5 d的子葉誘導形成的單個分生細胞團呈球形和心形；(H)離體培養(yǎng)10.5 d的子葉誘導形成的分生細胞團分化成長條形葉狀體；(I)離體培養(yǎng)10.5 d的子葉誘導形成的相鄰分生細胞團連在一起；(J)離體培養(yǎng)11 d的子葉誘導形成的分生細胞團分化成花瓣狀葉狀體。Fig.2 Histocytological observation of in vitro regeneration of cotyledons in pepper(Bars=50 μm)(A)The incision of cotyledons cultured in vitro for 3 days.Some cells,including upper epidermal ones and the parenchyma ones between the upper epidermis and the vascular bundle,were deeply stained；(B)The local enlargement of Fig.A.The upper epidermal cells and their adjacent parenchyma ones had dense cytoplasm and a large nucleus；(C)A part next to the incision of cotyledons cultured in vitro for 3.5 days.The epidermal and parenchyma cells did not dedifferentiate；(D)The incision of cotyledons cultured in vitro for 5.5 days.The upper epidermal cells and their inside parenchyma ones dedifferentiated,which divided actively and began to form the meristematic cell mass；(E)A part next to the incision of cotyledons cultured in vitro for 6.5 days.The formation of meristematic cell mass was induced；(F)The incision of cotyledons cultured in vitro for 6.5 days.The meristematic cell masses were successively formed from different parts of the upper epidermis；(G)Cotyledons cultured in vitro for 7.5 days.The single meristem cell mass was sphere-or heart-shaped；(H)Cotyledons cultured in vitro for 10.5 days.The meristematic cell mass differentiated into a long strip-shaped leafy structure；(I)Cotyledons cultured in vitro for 10.5 days.The adjacent meristematic cell masses connected together；(J)Cotyledons cultured in vitro for 11 days.The meristematic cell mass differentiated into a rosetteshaped leafy structure.

2.3 離體子葉再生芽的伸長誘導

2.3.1 GA3對離體子葉再生芽伸長的影響

辣椒離體子葉在誘導培養(yǎng)基上可誘導再生形成不同形態(tài)的葉狀體,約98%的子葉離體再生的葉狀體數(shù)量多且大部分呈玫瑰花瓣狀,僅有約2%的子葉形成的葉狀體數(shù)量少且呈長條形。用無菌刀片將葉狀體從離體子葉上切下,置于添加不同濃度GA3的誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),結(jié)果表明:當離體子葉再生的葉狀體數(shù)量多且呈玫瑰花瓣狀時,在添加1.0～2.0 mg/L GA3的誘導培養(yǎng)基中生長7 d后,葉狀體呈淡綠色,葉明顯伸長且變薄,但是未形成伸長的再生芽(圖3A),繼續(xù)生長7 d后,子葉愈傷組織褐化,葉狀體脫落；在添加3.0 mg/L GA3的誘導培養(yǎng)基中生長7 d后,葉狀體易形成水漬狀,葉明顯伸長,但也未形成伸長的再生芽。當離體子葉再生的葉狀體呈對生狀、長條形且數(shù)量少(為1～3 對)時,在添加 1.0～2.0 mg/L GA3的誘導培養(yǎng)基中生長7 d后,其再生芽明顯伸長,葉柄及葉片也伸長,葉片變薄呈淡綠色(圖3B)；3.0 mg/L GA3誘導培養(yǎng)的葉狀體的再生芽也能明顯伸長,但是易形成水漬狀。因此,1.0～2.0 mg/L GA3對離體子葉再生形成的數(shù)量少且呈長條形對生的葉狀體的再生芽伸長具有明顯的促進作用,但是對玫瑰花瓣狀葉狀體及非對生葉狀體再生芽的伸長作用不明顯。

圖3 GA3對辣椒子葉葉狀體再生芽伸長的影響(Bars=0.2 cm)(A)在添加2.0 mg/L GA3的誘導培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)7 d后,花瓣狀葉狀體再生芽未見伸長；(B)在添加2.0 mg/L GA3的誘導培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)7 d后,對生葉狀體的再生芽明顯伸長。Fig.3 Effects of GA3on the elongation of regenerated buds from leafy structures in cotyledon explants of pepper(Bars=0.2 cm)(A)Rosette-shaped leafy structures cultured under light for 7 days in the induction medium with 2.0 mg/L GA3.The regenerated buds did not elongate；(B)An opposite strip-shaped leafy structure cultured under light for 7 days in the induction medium with 2.0 mg/L GA3.The regenerated bud obviously elongated.

2.3.2 刪減葉狀體對離體子葉再生芽伸長的影響

辣椒離體子葉在適宜的誘導培養(yǎng)基上再生形成的葉狀體未刪減直接在伸長培養(yǎng)基中繼續(xù)生長,未見再生芽的伸長(圖4A)。用鋒利的無菌刀片將葉狀體刪減,只留1～2對呈對生的長條形葉狀體,刪減葉狀體在伸長培養(yǎng)基中生長2周后,再生芽明顯伸長,葉片碧綠呈長橢圓形,莖粗壯(圖4B)。伸長培養(yǎng)基中不同濃度配比的ZT和BA對再生芽伸長的影響見表2。從表2中可以看出:1.0 mg/L ZT與1.0～9.0 mg/L 6-BA組合能使再生芽伸長率≤40%；隨著ZT濃度的增加,葉狀體再生芽的伸長率明顯升高,3.0～7.0 mg/L ZT 與 5.0～9.0 mg/L 6-BA組合能使再生芽伸長率高于67%；5.0～7.0 mg/L ZT與7.0 mg/L 6-BA組合培養(yǎng)的再生芽伸長率最高,為88%～90%,顯著高于其他組合,是適宜于再生芽伸長培養(yǎng)基中的激素組合。經(jīng)刪減僅存1～2對呈對生狀的長條葉狀體在適宜的伸長培養(yǎng)基上生長約15 d后,再生芽伸長4～5 cm,為3～4葉1心的生長階段。

表2 不同濃度配比的ZT和BA對再生芽伸長的影響Table 2 Effects of different concentrations of ZT and/or 6-BA on the elongation of regenerated buds in pepper

圖4 刪減葉狀體對辣椒子葉葉狀體再生芽伸長的影響(Bars=0.2 cm)(A)未刪減的葉狀體在伸長培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)2周后未見再生芽伸長；(B)經(jīng)刪減僅剩1～2對對生的長條形葉狀體在伸長培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)2周后再生芽明顯伸長。Fig.4 Effect of pruning the leafy structures on the elongation of regenerated buds in cotyledon explants of pepper(Bars=0.2 cm)(A)Leafy structures not pruned and cultured under light for two weeks in the elongation medium.No buds elongated；(B)Leafy structures cultured under light for two weeks in the elongation medium after the rosette-like ones were pruned out and only 1～2 pairs of opposite strip-shaped ones remained.The bud obviously elongated.

3 討論

3.1 辣椒子葉的離體再生

辣椒屬于離體再生困難的植物,其外植體常常分化為葉狀體,葉狀體的芽難以伸長會限制根的形成,使其不能形成完整植株,影響離體再生體系的建立,進而影響辣椒遺傳轉(zhuǎn)化的研究。辣椒子葉常被用作離體再生的外植體,其愈傷組織的誘導率高于莖尖、上胚軸、下胚軸等其他外植體。據(jù)報道,處于分化狀態(tài)的辣椒子葉回復到分裂狀態(tài)并開始快速的分裂分化需要適宜的外源激素,細胞分裂素6-BA搭配生長素IAA可成功誘導辣椒子葉再生,但不定芽伸長困難是限制該離體再生技術(shù)體系建立的瓶頸[4,13]。在本研究中,辣椒帶柄子葉是一種離體再生率非常高的外植體,生長素IAA與細胞分裂素6-BA和/或ZT搭配可100%誘導子葉再生形成葉狀體,但葉狀體的狀態(tài)與細胞分裂素的類型及其濃度密切相關(guān):6-BA主要誘導離體子葉葉柄端切口玫瑰花瓣狀葉狀體形成,ZT誘導再生的葉狀體包括玫瑰花瓣狀和長條形,而切口端愈傷組織的形成與6-BA密切相關(guān)。愈傷組織的快速生長有利于從培養(yǎng)基中獲得包括植物激素在內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)以供葉狀體的生長。本文的研究結(jié)果顯示,在辣椒離體子葉再生過程中,5.0～9.0 mg/L 6-BA 與 3.0～9.0 mg/L ZT配比組合,使離體子葉再生形成的葉狀體大部分呈玫瑰花瓣狀,少部分呈正常長條形,且生長速度較快。

不定芽的伸長是辣椒離體再生成苗的關(guān)鍵。大多數(shù)學者認為,GA3在辣椒不定芽伸長過程中是必需的,可促進不定芽伸長[4,7～9]。有研究者在辣椒子葉離體再生過程中發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中添加椰子水和AgNO3對芽的伸長有促進作用[14]。此外,有研究者發(fā)現(xiàn),及時切割分離葉叢或者膨大的葉狀體也有利于獲得更多的伸長芽,推測其可能與葉叢的通氣、光照狀況有關(guān)[15]。在本研究中,GA3對離體子葉再生形成的數(shù)量少且呈對生狀的長條形葉狀體的再生芽伸長具有明顯的促進作用,可使其形成葉色淡綠的纖細再生芽,但它們卻難以生根。與此不同,GA3對花瓣狀葉狀體及非對生狀葉狀體的芽伸長的作用不明顯?；谝陨闲畔?我們創(chuàng)立了一種簡單易行的能使再生芽伸長的方法:刪減葉狀體至僅存留1～2對對生狀態(tài)的長條形葉狀體。結(jié)果顯示,經(jīng)刪減的葉狀體在添加外源激素6-BA、ZT和IAA的培養(yǎng)基上被成功誘導再生芽伸長,形成葉色碧綠、健壯的再生芽,它們極易生根,形成根系發(fā)達、生長健壯的苗,經(jīng)煉苗移栽后,成活率高達100%。因此,辣椒離體再生不定芽的伸長與誘導再生的葉狀體狀態(tài)及其數(shù)量緊密相關(guān)。

3.2 辣椒子葉離體再生誘導的組織細胞學研究

在植物離體培養(yǎng)中,外植體由特定部位的細胞先啟動分裂形成愈傷組織產(chǎn)生胚性細胞,分化形成帶有原套和原體的生長錐等不定芽早期結(jié)構(gòu)或者原胚等體細胞胚的早期結(jié)構(gòu),這些早期結(jié)構(gòu)經(jīng)過一系列發(fā)育過程最終形成不定芽或者體細胞胚[12,16]。據(jù)報道,辣椒子葉離體培養(yǎng)誘導葉狀體由子葉葉柄端切口處直接誘導的畸形凸起發(fā)育而來,它們難以形成正常的芽,推測這種畸形發(fā)育的葉狀體可能與分生組織退化有關(guān),而不是現(xiàn)有分生組織的芽發(fā)育缺陷[9]。在本研究中,辣椒離體子葉葉柄端誘導再生形成葉狀體,大部分葉狀體呈玫瑰花瓣狀,少部分呈長條形(其中極少數(shù)呈對生狀),未見正常芽的分化。組織細胞學分析顯示,子葉葉柄端再生的愈傷組織起源于上表皮及其內(nèi)側(cè)的薄壁細胞,通過細胞分裂和分化形成分生細胞團,這些分生細胞團的形成具有特定的時空特征,它們相繼突出上表皮。然而,分生細胞團未見生長錐等不定芽早期結(jié)構(gòu)的分化,不能直接形成芽,而是與周圍的愈傷組織細胞一起形成葉狀體。值得一提的是,我們觀察到極少數(shù)呈球型和心型的單獨的分生細胞團,它們可能繼續(xù)分化形成對生狀的葉狀體。在添加外源細胞分裂素6-BA和ZT以及生長素IAA的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,不管GA3的添加與否,均能成功誘導對生狀葉狀體的再生芽明顯伸長,卻不能誘導非對生狀的葉狀體再生芽伸長。因此,辣椒子葉誘導再生過程中葉狀體的形成可能是其分生組織的芽發(fā)育缺陷,而非分生組織的退化所致；對生的葉狀體的芽在誘導過程中能形成,但處于生長停滯而非退化狀態(tài),隨著葉狀體的刪減,營養(yǎng)物質(zhì)和激素的集中使芽能快速生長伸長。