陸天天，王 寧，高曉冬

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

哺乳動物細胞中，蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中完成，N-糖鏈結(jié)構(gòu)依次經(jīng)高甘露糖型、雜合型、最后生成成熟形態(tài)的復(fù)合型糖鏈，該過程對糖蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、半衰期和分子識別功能等具有關(guān)鍵作用[1]。β-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶I（GnT-I）是N-糖鏈加工過程中的重要蛋白質(zhì)，它是一個定位在高爾基體上的膜蛋白，功能為以UDPGlcNAc為供體，向M5GN2寡糖的核心五糖結(jié)構(gòu)中α1-3連接的甘露糖上添加一個 β1-2連接的GlcNAc[2-3]，該步驟是N-糖鏈由高甘露糖型向雜合型或復(fù)合型轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟[4-5]。

人源 GnT-I（hGnT-I）由 445 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為50 900，1990年成功篩選到其基因MGAT1[2]。GnT-I蛋白已經(jīng)成功在哺乳動物細胞[2]以及大腸桿菌中完成可溶性表達[6-7]，目前市售GnT-I來自Novus Biologicals公司[8]，為哺乳動物細胞體系表達的可溶性GnT-I蛋白。但哺乳動物細胞蛋白質(zhì)表達量低，體系構(gòu)建昂貴，導(dǎo)致該商業(yè)蛋白質(zhì)產(chǎn)品價格很高，一定程度上阻礙了GnT-I的進一步研究和技術(shù)開發(fā)。原核表達體系雖然蛋白質(zhì)產(chǎn)量高，但由于hGnT-I是帶有一個跨膜域的膜蛋白，采用原核系統(tǒng)表達可能產(chǎn)生蛋白質(zhì)降解、形成包涵體、所表達蛋白質(zhì)無活性等問題?，F(xiàn)有報道中的原核表達案例，均在GnT-I上融合了一段較長的蛋白質(zhì)標(biāo)簽，如Seki等人報道在該蛋白質(zhì)N端融合麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）以輔助其功能性表達與純化[7]，雖然得到了具有活性的蛋白質(zhì)，但大部分蛋白質(zhì)形成包涵體存在于沉淀里，大大降低了其應(yīng)用性。

在本研究中，作者構(gòu)建了用于表達截除N端跨膜域的重組hGnT-I的質(zhì)粒，將其導(dǎo)入含有稀有密碼子的大腸桿菌Rosetta DE3菌株中進行可溶性表達，隨后優(yōu)化了誘導(dǎo)表達條件并對純化的蛋白質(zhì)進行了活性研究。作者完成了重組hGnT-I大量功能性表達體系的建立，為進一步研究該蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其在糖鏈合成中的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌菌種Rosetta DE3和表達載體pET28a質(zhì)粒：購于德國Novagen公司；人基因組文庫：購于美國Invitrogen公司；引物合成及基因測序：由華大基因完成。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉 20 g/L（固體培養(yǎng)基），121℃滅菌20 min后備用；

TB培養(yǎng)基：酵母提取物24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，磷酸氫二鉀9.4 g/L，磷酸二氫鉀2.2 g/L，甘油4 mL/L，121℃滅菌20 min后備用。

1.1.3 主要試劑 高速高保真PCR酶、限制性內(nèi)切酶 BamH I和 Hind III、DNA Ligation Kit： 購于日本TaKaRa公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）：購于美國Sigma公司；氯霉素、卡那霉素：購于美國Gibco 公司；鎳親和小柱（HisTrap HP，1 mL）：購于美國GE Healthcare公司；免疫印跡檢測所用抗體Anti-His Mouse IgG和 Goat Anti-Mouse HRP：購于碧云天生物技術(shù)；熒光標(biāo)記的糖鏈M3GN2-Asn-Fmoc和GN2M3GN2-Asn-Fmoc：獲贈于日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所（AIST）；核苷酸單糖 UDP-GlcNAc：購于青島曙格公司；β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶 （β-N-actylglucosiminidase S）：購于美國NEB公司；其他常用試劑均購于中國國藥集團。

1.1.4 主要儀器 高效液相色譜儀 （Waters 2695）和熒光檢測器（Waters 2475）：美國沃特世公司；色譜柱（Amide，150 mm×4.6 mm，3 μm）：安捷倫科技有限公司；蛋白質(zhì)電泳以及免疫印跡轉(zhuǎn)移槽：美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 MGAT1基因的克隆及重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM的構(gòu)建 根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫人源MGAT1基因編碼序列，結(jié)合UniPort數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)GnT-I跨膜區(qū)域的預(yù)測，人源MGAT1基因編碼序列長1 335 bp，前87 bp編碼一段面向胞質(zhì)的片段以及跨膜域，故從第88 bp開始設(shè)計PCR引物，并在5′端分別引入BamH I和Hind III酶切位點，引物序列見表1。以人基因組文庫中包含MGAT1基因的單克隆質(zhì)粒為模板進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳鑒定并進行PCR產(chǎn)物純化，得到目的基因片段。將目的基因和pET28a空載質(zhì)粒分別用BamH I和Hind III進行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠回收后以20 ng目的基因、10 ng pET28a、5 μL Ligation Mix體系在25℃連接15 min后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)SOC培養(yǎng)基在37℃預(yù)培養(yǎng)45 min后，涂布于LB/Kan+/Cm+（卡那霉素50 μg/mL，氯霉素 34 μg/mL）平板上進行篩選。 12 h后從平板挑取單克隆進行菌落PCR驗證，將檢定陽性的單克隆擴增并且提取質(zhì)粒，命名為pET28a-MGAT1ΔTM。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in the study

1.2.2 重組hGnT-I蛋白的誘導(dǎo)表達 將pET28a-MGAT1ΔTM重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta DE3感受態(tài)細胞中，涂布于LB/Kan+/Cm+平板上，于37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于5 mL LB/Kan+/Cm+（卡那霉素 50 μg/mL，氯霉素 34 μg/mL） 液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)12 h；后將培養(yǎng)基以1∶100體積比接入200 mL TB/Kan+/Cm+（抗生素質(zhì)量濃度同上）液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至OD600為0.8時，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至16℃搖床冷卻1 h，加入終濃度為100 μmol/L的IPTG，16℃誘導(dǎo)表達12 h。表達完成后于4℃、9 000 g離心3 min，收集菌體，棄盡培養(yǎng)液后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重組hGnT-I蛋白表達條件的優(yōu)化 以1.2.2重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達為背景對蛋白質(zhì)的表達條件進行優(yōu)化。當(dāng)重組菌擴大培養(yǎng)至OD600達到0.8時，降溫至16℃后，加入 100 μmol/L的 IPTG，分別在 0、2、4、6、8、10、12、16 h 對菌液進行取樣，采用免疫印跡法對不同誘導(dǎo)時間的蛋白質(zhì)表達水平進行檢測；采用相同的方法表達蛋白質(zhì)，加入不同濃度的 IPTG（10、50、100、200、500、1 000 μmol/L），培養(yǎng)10 h后對菌液進行取樣，采用免疫印跡法對加入不同濃度誘導(dǎo)劑的樣品進行蛋白質(zhì)表達水平檢測。

1.2.4 重組hGnT-I蛋白的純化 將冷凍保存的菌體置于冰水中解凍15 min，加入15 mL的重懸緩沖液 （25 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）重懸菌體，超聲波破碎菌體10 min，于4℃、9 000 g離心45 min，收集上清液蛋白質(zhì)。將上清液用注射器上樣至用重懸緩沖液平衡的鎳親和層析小柱，并用含不同濃度咪唑（20、60、250 mmol/L）的重懸緩沖液洗脫，收集洗脫液，檢測目的蛋白質(zhì)。用30 000超濾離心管過濾含有重組hGnT-I（His-hGnT-IΔTM）蛋白的洗脫液，并加入25 mmol/L HEPES-NaOH（pH 7.4）洗滌3次，得到濃縮蛋白質(zhì)液，置于-80℃冰箱備用。

1.2.5 重組hGnT-I蛋白的活性檢測 糖基化反應(yīng)（總體積 50 μL） 各組分如下：1 μmol/L M5GN2-Asn-Fmoc，0.1 mmol/L UDP-GlcNAc，10 mmol/L MgCl2，0.1 mg/mL His-hGnT-IΔTM 蛋白，50 mmol/L MES-NaOH（pH 6.0）。反應(yīng)體系在37℃下孵育1 h，18 000 g離心5 min，取上清液進行HPLC檢測。流動相 A：乙腈；流動相 B：0.1 mol/L NH4OAc。梯度：0～5 min，85%B；5～35 min，85%～50%B；35～40 min，50%～30%B；40～45 min，30%～85%B。 熒光檢測器激發(fā)波長（ex）：295 nm；發(fā)射波長（em）：315 nm；流量：1.0 mL/min；柱溫 40 ℃。

1.2.6 重組hGnT-I蛋白的底物特異性檢測 底物特異性檢測時，除將底物更換為M3GN2-Asn-Fmoc外[11]，使用的反應(yīng)條件和檢測方法與活性檢測相同，其中考慮到非天然底物的特異性問題，可以適當(dāng)延長反應(yīng)孵育時間。

1.2.7 產(chǎn)物的酶切驗證 對1.2.5和1.2.6中的反應(yīng)體系進行產(chǎn)物驗證，方法如下：50 μL糖基化反應(yīng)體系于100℃加熱5 min，取44 μL與β-N-乙酰氨基葡糖苷酶[12]（1 μL）和 10×GlycoBuffer（5 μL）混合，37℃孵育12 h，18 000 g離心5 min，取上清液用HPLC檢測產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 hGnT-I蛋白跨膜域結(jié)構(gòu)分析

TMHMM跨膜域預(yù)測圖譜見圖1?？梢钥闯觯琱GnT-I在N端有一個跨膜域結(jié)構(gòu)，結(jié)合UniPort蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的模擬預(yù)測可知，跨膜區(qū)域位于7～29位氨基酸，而1～6位氨基酸位于胞質(zhì)側(cè)。本研究設(shè)計截除前87 bp編碼1～29位氨基酸的序列，只表達包含高爾基體腔內(nèi)側(cè)可溶性片段的hGnT-IΔTM。

圖1 hGnT-I蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.1 Predicted transmembrane domain of hGnT-I

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM的構(gòu)建

表達質(zhì)粒選用多克隆區(qū)域前后都有6×His標(biāo)簽的原核表達載體pET28a，在蛋白質(zhì)N端融合了一個6×His標(biāo)簽以進行后續(xù)純化工作，重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM 見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTMFig.2 Recombinant expression plasmid pET28a-MGAT1ΔTM

2.2.1 基因的擴增 PCR產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳分析，13 00 bp左右有明顯條帶，而截除前87 bp的目的基因MGAT1ΔTM片段長度為1 248 bp，與預(yù)期大小一致，見圖3。

圖3 MGAT1ΔTM目的基因PCR擴增結(jié)果電泳Fig.3 MGAT1ΔTM gene PCR amplification

2.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM菌落PCR驗證及測序 經(jīng)菌落PCR驗證，所得質(zhì)粒中至少3個單克隆擴增出1 300 bp左右的目的片段，見圖4。挑取該3個陽性菌落進行擴增與質(zhì)粒提取和測序，測序結(jié)果與Genbank中去除前87 bp的MGAT1基因編碼區(qū)域一致，表明重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM構(gòu)建成功。

圖4 pET28a-MGAT1ΔTM重組質(zhì)粒菌落PCR驗證Fig.4 Colony PCR for pET28a-MGAT1ΔTM plasmid construction

2.3 His-hGnT-IΔTM蛋白的表達與純化

2.3.1 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達和純化 構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta DE3中誘導(dǎo)12 h后，收集菌體進行超聲波破碎，離心得到上清液；將上清液用鎳親和層析柱純化，收集含不同濃度咪唑（20、60、250 mmol/L）緩沖液的洗脫液。對不同蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果見圖5。與未加入IPTG誘導(dǎo)的細胞裂解液相比，誘導(dǎo)后的樣品在42 800左右位置出現(xiàn)誘導(dǎo)前樣品未出現(xiàn)的條帶，表明重組hGnT-I蛋白可溶性表達成功，相對分子質(zhì)量約為42 800，產(chǎn)率為7.5 g/L，見圖5。

圖5 重組蛋白His-hGnT-IΔTM的表達與純化Fig.5 Expression and purification of recombinant HishGnT-IΔTM protein

經(jīng)過SDS-PAGE及考馬斯亮藍染色驗證，目的蛋白質(zhì)集中于含250 mmol/L咪唑的洗脫液中。將該部分洗脫液收集并用超濾離心管過濾濃縮，通過反復(fù)用HEPES-NaOH緩沖液清洗后得到終質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的重組hGnT-I蛋白。

2.3.2 重組蛋白質(zhì)表達條件的優(yōu)化 收集不同誘導(dǎo)條件下的菌體進行破碎裂解，直接將細胞裂解液作為樣品進行免疫印跡法檢測蛋白質(zhì)表達程度，其中第一抗體為Mouse Anti-His IgG，第二抗體為Goat Anti-mouse IgG，HRP。結(jié)果表明，在誘導(dǎo)開始2 h后，蛋白質(zhì)開始逐漸表達，直到10 h后表達量基本趨于一致，12 h后蛋白質(zhì)表達量不再變化；采用優(yōu)化過誘導(dǎo)時間10 h的進一步對加入的誘導(dǎo)劑濃度進行優(yōu)化，結(jié)果表明，加入100 μmol/L IPTG比加入50 μmol/L可以使蛋白質(zhì)表達量成倍增加，然而加入更高濃度的誘導(dǎo)劑并不能提高蛋白質(zhì)的表達量，見圖6。

圖6 重組hGnT-I蛋白表達條件的優(yōu)化Fig.6 Optimization of the expression condition of hGnT-I protein

2.4 重組hGnT-I蛋白的性質(zhì)鑒定

首先采用與天然底物類似的帶熒光標(biāo)簽的N-糖鏈M5GN2-Asn-Fmoc作為重組hGnT-I蛋白的底物，確認了其體外活性，見圖7。Stanly等人也于1990年報道hGnT-I蛋白在體外可以識別M3GN2，因此也檢測了重組蛋白對非天然底物M3GN2-Asn-Fmoc的特異性，確認其可以作為重組hGnT-I的反應(yīng)底物，見圖8。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酶切驗證為目標(biāo)產(chǎn)物。

圖7 重組hGnT-I蛋白對底物M5GN2-Asn-Fmoc的活性檢測Fig.7 hGnT-I protein activity against M5GN2-Asn-Fmoc

圖8 重組hGnT-I蛋白對底物M3GN2-Asn-Fmoc的活性檢測Fig.8 hGnT-I protein activity against M3GN2-Asn-Fmoc

2.4.1 重組蛋白質(zhì)活性檢測 以M5GN2-Asn-Fmoc為底物，體外糖基化反應(yīng)體系離心取上清液后進行HPLC檢測，結(jié)果見圖7。反應(yīng)體系中推測的糖鏈產(chǎn)物GNM5GN2-Asn-Fmoc較起始底物M5GN2-Asn-Fmoc有明顯的偏移，間隔時間約1.2 min。說明重組hGnT-I蛋白成功以UDP-GlcNAc為糖基供體、M5GN2-Asn-Fmoc為受體進行了糖基化反應(yīng)，生成了加上1個GlcNAc的產(chǎn)物糖鏈GNM5GN2-Asn-Fmoc，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為100%。

2.4.2 重組蛋白底物特異性檢測 以M3GN2-Asn-Fmoc為底物經(jīng)過1 h或2 h反應(yīng)，從圖8中可以看到，1 h反應(yīng)體系中除了底物糖鏈M3GN2-Asn-Fmoc以外，還出現(xiàn)了添加了1個GlcNAc的產(chǎn)物GNM3GN2-Asn-Fmoc，而在延長孵育時間至2 h的樣品中則只能檢測到產(chǎn)物GNM3GN2-Asn-Fmoc。與標(biāo)準(zhǔn)糖鏈GN2M3GN2-Asn-Fmoc相比，該產(chǎn)物在HPLC中的洗脫時間較短，符合氨基柱以化合物極性大小正向洗脫的順序，說明重組hGnT-I蛋白可以識別非天然底物M3GN2-Asn-Fmoc，但該酶促反應(yīng)的效率低于天然底物。

2.4.3 反應(yīng)產(chǎn)物的酶切驗證 將反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)高溫滅活后，加入β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，經(jīng)過12 h水解后對水解產(chǎn)物進行HPLC檢測。結(jié)果顯示，糖鏈產(chǎn)物GNM5GN2-Asn-Fmoc和GNM3GN2-Asn-Fmoc在糖苷酶的水解作用下，形成了未加上GlcNAc的底物M5GN2-Asn-Fmoc和M3GN2-Asn-Fmoc。該結(jié)果證明重組hGnT-I蛋白催化的糖基化反應(yīng)為向寡糖底物添加β糖苷鍵連接的N-乙酰葡糖胺。

3 結(jié) 語

作者成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-MGAT1ΔTM，利用大腸桿菌表達體系實現(xiàn)了截除跨膜域的hGnT-I的大量可溶性表達，并在鎳柱純化后對該蛋白質(zhì)進行了體外活性測試。研究結(jié)果表明，該重組蛋白質(zhì)對天然底物類似物M5GN2-Asn-Fmoc和非天然底物M3GN2-Asn-Fmoc均具有活性。通過對反應(yīng)產(chǎn)物進行酶切驗證，證明糖基化產(chǎn)物為一個由β糖苷鍵連接的N-乙酰葡糖胺，說明該重組蛋白質(zhì)的體外活性與體內(nèi)活性一致。本研究克服了人源膜蛋白在原核體系表達易降解、易失活的難點，提供了大量獲得活性重組hGnT-I蛋白的方法，為進一步研究其酶學(xué)性質(zhì)以及糖鏈酶法合成相關(guān)技術(shù)提供了新的方法。