陳 亮，劉雪松，張 蕾，沈思思，蘭世捷，李 丹，苗 艷，馮萬宇，黃寶銀，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161000)

林可霉素(lincomycin)是由鏈霉菌產(chǎn)生的一種林可胺類堿性抗生素，分子式為C18H34N2O6S[1]。林可霉素對于細菌產(chǎn)生抗菌效果的作用機理是林可霉素與細菌的核蛋白體50 S亞基結合，抑制肽?；D移酶，阻礙了蛋白質的合成，從而達到相應的抗菌效果[2-3]。林可霉素屬于窄譜抗菌藥物，主要對化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌以及肺炎鏈球菌等革蘭氏陽性菌的抗菌效果較強。對于部分厭氧菌，如破傷風梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌以及雙歧桿菌等有良好的效果。但對革蘭氏陰性菌無抗菌效果[4]。林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的藥動學數(shù)據(jù)還沒有報道過。因此，本文探究了林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的藥動學數(shù)據(jù)，以期為林可霉素在安格斯牛上的使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 安格斯牛5頭，160 kg～200 kg，購于齊齊哈爾周邊牧場。

1.1.2 藥品及試劑 林可霉素對照品，中國獸藥監(jiān)察所產(chǎn)品；硼砂以及色譜級磷酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；色譜級甲醇以及乙腈，北京迪科馬科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 LC20-AT液相色譜儀、SPD-M20A二級陣列管檢測器、InertSustainC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 結合相關文獻，確定了高效液相色譜測定林可霉素的檢測方法。0.05 mol/L硼砂溶液(用85%磷酸溶液調節(jié)pH至6.1)-甲醇(1∶1)為流動相，流速為1 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為214 nm[4]。

1.2.2 血漿樣品處理 精密吸取1 mL血漿，向其加入2 mL乙腈，充分渦旋1 min。12 000 r/min離心10 min，移取上清液到10 mL離心管中，60℃氮氣吹干，用1 mL流動相進行定容，過膜后檢測。

1.2.3 血漿標準曲線的制作 試驗標準曲線制作采用外標法。將不含藥物的血漿按照1.2.2的方法進行前處理，以獲得空白血漿基質。取5根離心管，各管內(nèi)加入900 μL空白血漿基質。將林可霉素稀釋成適當濃度，各管分別加入100 μL相應濃度的藥物，渦旋均勻，使基質加標濃度為5 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL。按照1.2.1的方法進行測定。求得標準曲線回歸方程和相關系數(shù)(R)。

1.2.4 方法學驗證 將林可霉素加入到空白血漿中，使空白血漿中含有林可霉素濃度為5 ng/mL、50 ng/mL、500 ng/mL。按照1.2.2的方法進行前處理。按照1.2.1的方法進行濃度測定。將經(jīng)過前處理的血漿樣品的分析峰面積與標準曲線中的藥物峰面積進行比較。做5個重復，共做3個批次，不同批次間隔1 d，分別計算回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.2.5 藥物代謝動力學試驗設計 本試驗以5 mg/kg的劑量進行肌肉注射給藥。給藥后分別于0.17 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h靜脈采血3 mL置于肝素鈉采血管中，以3 500 r/min離心10 min，取血漿于-20℃中保存。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理以及統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用SPSS軟件中的方差分析處理，藥物代謝動力學模擬及參數(shù)計算采用Winnonlin 5.2.1軟件進行處理。

2 結果

2.1 方法專屬性

根據(jù)1.2.1的檢測方法和1.2.2的血漿前處理方法，林可霉素在標液、基質加標以及采集的樣品中能在色譜柱上得到良好的分離、保留。該方法對林可霉素響應值高，藥物周圍無雜質峰干擾。林可霉素出峰時間為10.65 min～10.75 min，在不同批次間分析物出峰時間有細微差別。

圖1 林可霉素標準品色譜圖

圖2 空白血漿色譜圖

2.2 標準曲線

以定量色譜峰面積為縱坐標，以藥物濃度為橫坐標，建立標準曲線。林可霉素的標準曲線方程為：y=1.060 5x-2.157 6，相關系數(shù)為0.998 3。表明林可霉素在5 ng/mL～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

圖3 血漿樣品色譜圖

2.3 方法學驗證

試驗數(shù)據(jù)表明林可霉素在血漿中回收率為91%～101%。批間精密度為2.34%～3.56%，批內(nèi)精密度為1.57%～3.69%。檢測限(LOD)、定量限 (LOQ)分別為5 ng/mL和10 ng/mL。

2.4 藥物代謝動力學

經(jīng)過高效液相色測定藥物濃度后，藥時曲線如圖4以所示。血漿中藥物濃度如表1所示，經(jīng)過Winnonlin軟件分析后的藥物代謝動力學參數(shù)如表2所示。結果分析表明，林可霉素在安格斯牛體內(nèi)吸收較快，代謝較慢，達峰濃度較高。

表1 血漿中藥物濃度

表2 林可霉素藥動學參數(shù)

圖4 藥時曲線

3 討論

林可霉素在不同基質中的檢測方法眾多，其中包括了高效液相色譜法、膠體金免疫層析法、氣相色譜法、質譜法以及光譜法等[5]。本試驗方法采用了HPLC-DAD方法，并且簡化了樣品前處理的方法。通過本方法得出的標準曲線線性關系良好、方法專屬性強，并且林可霉素周圍無雜質峰干擾。應用該方法可以有效測定血液中林可霉素的含量。

本次試驗測定的林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的藥動學參數(shù)中，達峰時間(Tmax)為0.37 h，表明達峰時間較快，林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的吸收較快。達峰濃度(Cmax)為6.12 μg/mL，說明林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的濃度較高。本次試驗中，林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的消除半衰期(T1/2β)為3.75 h，與范惠敏等測定的在豬體內(nèi)的3.38 h、Sreedharan等測定的在水牛體內(nèi)的3.3 h、Albarellos等在貓體內(nèi)測定的3.56 h相近，低于吳海港等測定的環(huán)丙沙星-林可霉素長效注射液在豬體內(nèi)的10.74 h，高于Abo-EL-Sooud等測定的在山羊體內(nèi)的1.44 h。本次試驗測得林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的平均滯留時間(MRT)為3.78 h，與在豬體內(nèi)的3.52 h相似，低于在水牛體內(nèi)的4.32 h，但高于山羊的1.19 h。這些數(shù)據(jù)說明林可霉素在不同動物體內(nèi)的藥動學數(shù)據(jù)具有種屬差異性。林可霉素的抗菌譜與大環(huán)內(nèi)酯類藥物的抗菌譜相似，國外的一項研究表明，林可霉素血藥濃度達到2～2.8 μg/mL時，對細菌有較為明顯的抗菌效果[11]。在臨床應用時，林可霉素經(jīng)常與其他藥物聯(lián)合配伍使用，既是為了防止細菌耐藥性的產(chǎn)生，也是為了抗混合感染中對林可霉素敏感性低或無敏感性的細菌。林可霉素與大觀霉素的配伍較常見。許多研究報道稱，這兩種藥的配伍使用可以補充兩種藥物的短板，對治療細菌以及支原體疾病有著良好的效果，兩種藥物聯(lián)合使用的抗菌效果要優(yōu)于單藥的使用[4,12-13]。

藥動-藥效學同步模型是一種可以通過科學計算得出某種藥物對于不同的動物的合理用藥劑量的模型[14-15]。這個模型主要包括了兩個部分，一個是藥動學研究部分，另一個是藥效學研究部分。本試驗首次測出了林可霉素在安格斯牛體內(nèi)的藥動學數(shù)據(jù)，為林可霉素治療安格斯牛疾病提供了依據(jù)，也可以應用相應的藥動學數(shù)據(jù)為林可霉素的合理用藥提供參考數(shù)據(jù)，防止耐藥性的產(chǎn)生。