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      6 種食用玫瑰染色體核型分析及基因組大小測定

      2021-11-13 01:27:26段登文
      湖南農(nóng)業(yè)科學 2021年8期
      關(guān)鍵詞:平陰大馬士革核型

      段登文,許 彬,孟 靜

      (云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院,云南 昆明 650201)

      食用玫瑰為薔薇科薔薇屬植物,不僅具有較高的觀賞價值,而且具有藥用價值和經(jīng)濟價值,同時也是世界馳名的香料、配料。我國食用玫瑰種植具有悠久的歷史,山東平陰、甘肅苦水、新疆和田、貴州安順、云南八街等地均種植不同品種的食用玫瑰[1]。隨著研究的擴展和深入,食用玫瑰品種越來越多,且以其為原料的產(chǎn)品也層出不窮,逐漸成為一種消費新時尚。其中,較為常見的油食兼用品種有平陰1號、四季玫瑰、大馬士革等[2];而金邊、墨紅、滇紅等具有生長勢強、抗病蟲害中等、產(chǎn)量高的優(yōu)點,并且花瓣可食用,也可用于加工薰茶、制醬、釀酒等[3]。

      染色體特征對研究植物系統(tǒng)演化、親緣關(guān)系、物種起源、進化與分類及雜種染色體鑒定具有重要意義。薔薇屬植物染色體基數(shù)為7[4-5],且染色體倍性復雜多樣,從二倍體到八倍體不等,有些還存在混倍體[6],復雜多樣的染色體組型雖然為品種選育提供了豐富的種質(zhì)資源,但是也出現(xiàn)了因雜交不親和而導致育種周期長等問題。因此,為了更好地利用種質(zhì)資源,更有效地培育食用玫瑰新品種,研究種質(zhì)資源染色體核型等細胞學特征尤為必要[7-9]。

      基因組大小或稱C 值,是指一個物種的配子體細胞核中染色體未進行復制時的DNA 含量。C 值是一個很重要的植物學特征,是植物學家進行種群進化、物種分類和生態(tài)學研究的有效依據(jù)[10]。迄今為止,測定基因組大小的方法主要有3 種:孚耳根微顯影、基因組測序法以及流式細胞術(shù)(FCM)[11]。其中,流式細胞術(shù)具有高效率、準確度高、樣品制備方便、分析快等特點,是測定植物基因組大小的首選方法。以往報道中,吳鈺瀅等[12]、李詩琦等[13]和丁曉六等[14]利用流式細胞術(shù)成功測定出部分薔薇屬植物的基因組大小,并推測其倍性水平。

      目前,國內(nèi)外關(guān)于食用玫瑰的研究較多,主要集中于栽培技術(shù)[15-16]、色素[17-18]、玫瑰精油及有機成分[19-21]等方面,而關(guān)于染色體核型分析及基因組大小的文獻較少[22-25]。該研究采用常規(guī)壓片法對6 種食用玫瑰品種進行染色體壓片,觀察其染色體形態(tài),進行核型分析,并采用流式細胞術(shù)測定核DNA 含量與基因組大小,為食用玫瑰引種、培育和改良工作以及開發(fā)新品種提供參考與理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗材料

      供試材料為平陰1 號、四季玫瑰、金邊、墨紅、大馬士革和滇紅這6 種食用玫瑰品種,均種植于云南農(nóng)業(yè)大學苗圃內(nèi)。

      1.2 試驗方法

      1.2.1 染色體制片上午8:00—10:00,取無病蟲害的頂芽2~5 mm,輕輕刮除外表皮及絨毛,在蒸餾水中用刀片切至薄片,置于濃度為0.002 mol/L 的8-羥基喹啉溶液中,放入0~4℃的冰箱中預處理2~3 h,蒸餾水清洗4~5 次后用配制的卡諾固定液(V無水乙醇∶V冰醋酸= 3 ∶1)固定8~24 h,再次洗凈,放入5 mol/L HCl 中常溫解離10 min。漂洗后放置于載玻片中央,滴加1 滴改良的苯酚品紅染液染色2 h,吸去多余染色液,用帶橡皮擦的鉛筆輕敲蓋玻片,使細胞分散均勻,將壓片放于60℃烘箱處理5~8 min,以減少水分對觀察的影響。將處理過的壓片放在低倍光學顯微鏡下,選取分散較好的區(qū)域,調(diào)至100 倍鏡下選取30個分散良好、染色體形態(tài)清晰的分裂中期細胞進行拍照及分析。

      1.2.2 流式細胞術(shù)取樣品嫩葉約1 g,蒸餾水洗凈表面的塵土,濾紙吸干后放入預冷的培養(yǎng)皿中,將樣品置于0.8 mL 預冷的mGb 解離液,用鋒利的刀片將組織迅速垂直切碎,使其在解離液中冰上靜置10 min,然后用400 目濾網(wǎng)過濾,得到細胞核懸浮液。采用適當體積且濃度均為50 μg/mL 預冷的碘化丙啶和RNAase 溶液,置于冰上避光染色0.5~1.0 h。將染色后的細胞核懸浮液樣品上 BD FACSCalibur 流式細胞儀檢測,采用488 nm 藍光激發(fā),檢測碘化丙啶的發(fā)射光熒光強度,每次檢測收集10 000 個顆粒,每個待測樣品設(shè)2 個重復,變異系數(shù)CV(%)控制在5%以內(nèi),使用Modifit 3.0 分析軟件作圖分析。以已明確的日本晴水稻及番茄為內(nèi)參,將待測樣品的熒光信號強度與其對比,判斷倍性并通過進一步計算得到基因組大小。

      1.3 數(shù)據(jù)分析

      選取良好分散的染色體用LAS EZ 軟件在Leica DM500 顯微鏡下捕獲圖像,利用Photoshop CS 6 進行圖片處理及配對,采用ImageJ1.80 進行染色體長短臂的測量,采用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)處理,分析染色體核型并建立染色體核型模式圖。使用ModiFit 3.0軟件分析得到流式細胞儀分析圖。按照李懋學等[26]提出的核型分析標準以及Levan 等[27]的兩點四區(qū)命名系統(tǒng)對染色體形態(tài)劃分歸類,染色體核型分類按Stebbins[28]的方法來進行,染色體核型不對稱系數(shù)按Arano[29]的方法計算。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 染色體數(shù)目及核型分析

      從圖1、圖2 可以看出,6 種食用玫瑰品種染色體基數(shù)x= 7。其中平陰1 號和四季玫瑰為二倍體,染色體數(shù)目均為2n= 2x= 14;金邊和墨紅是三倍體,染色體數(shù)目均為2n= 3x= 21;大馬士革和滇紅是四倍體,染色體數(shù)目均為2n= 4x= 28。進一步對染色體形態(tài)測量計算,得到染色體核型參數(shù)(表1)。6 種試材的染色體均靠中部和近中部著絲點區(qū),未發(fā)現(xiàn)隨體染色體,基本由m、sm 組成。核型不對稱系數(shù)范圍在55.19%~60.00%之間。其中,平陰1 號核型公式為2n=14 = 12m+2sm,核型不對稱系數(shù)為60%,1A 核型;四季玫瑰核型公式為2n= 2x= 12m+2sm,核型不對稱系數(shù)為57.00%,1B 核型;金邊核型公式為2n=3x= 21m,核型不對稱系數(shù)為55.19%,1B 核型;墨紅核型公式為2n= 3x= 17m+4sm,核型不對稱系數(shù)為57.30%,2C 核型;大馬士革核型公式為2n= 4x=26m+2sm,核型不對稱系數(shù)為56.07%,1B 核型;滇紅核型公式為2n=4x=24m+4sm,核型不對稱系數(shù)為56.68%,2B 核型。

      圖1 6 種食用玫瑰品種部分鏡檢圖。

      圖2 6 種食用玫瑰品種核型模式圖

      2.2 6 種食用玫瑰核DNA 含量與基因組大小

      對6 種食用玫瑰品種核DNA 含量以及基因組大小進行檢測,結(jié)果如圖3 所示,變異系數(shù)(CV)控制在5%以內(nèi)。由表2 可知,6 種食用玫瑰試材的2C值變化范圍為0.91~2.18 pg,1C 值變化范圍為0.45~0.73 pg,2C 值最小的為二倍體種平陰1 號,基因組大小為(444.07±16.12)Mbp,最大的是四倍體種墨紅,基因組大小為(1 066.75±2.97)Mbp。

      表2 6 種食用玫瑰品種核DNA 含量和基因組大小

      圖3 6 種食用玫瑰品種流式細胞分析圖。

      表 1 6 種食用玫瑰品種染色體參數(shù)

      3 結(jié)論與討論

      染色體數(shù)目及特征是重要的生物學數(shù)據(jù),同一物種或品種的染色體數(shù)目恒定,對于闡述植物進化程度和相近種親緣關(guān)系具有重要意義[30-31],研究染色體數(shù)目可以為食用玫瑰遠緣雜交親本的選擇提供依據(jù),在種質(zhì)創(chuàng)新方面也具有一定的參考價值。該研究分析了平陰1 號、四季玫瑰、金邊、墨紅、大馬士革、滇紅6 種食用玫瑰品種的倍性、核型分析參數(shù)、核DNA含量以及基因組大小。結(jié)果表明,6 種食用玫瑰品種染色體基數(shù)均為7,且未發(fā)現(xiàn)隨體染色體,這與前人研究結(jié)果一致[32]。四季玫瑰染色體核型為二倍體、1B 核型,與招雪晴[22]和馬雪[33]的研究結(jié)果一致;大馬士革為四倍體,與蹇洪英等[24]和Jian 等[25]的研究結(jié)果一致,但Roberts 等[34]的研究顯示該品種為三倍體,導致這種差異的原因可能是供試材料本身存在差異;其余4 種試材之前未見報道。依據(jù)Stebbins[28]的研究,在植物界中,高等植物染色體核型進化的基本走向是從對稱向不對稱發(fā)展的,在系統(tǒng)演化上具有相對對稱核型的植物比較古老或原始,而常見衍生或進化比較高級的植物具有不對稱核型。研究結(jié)果顯示,6 種食用玫瑰品種染色體核型不對稱系數(shù)由高到低依次為平陰1 號(60%)>墨紅(57.3%)>四季玫瑰(57%)>滇紅(56.68%)>大馬士革(56.07%)>金邊(55.19%),由此可知,金邊比較原始,平陰1號進化比較先進。

      對薔薇屬核DNA 含量、C 值和倍性水平進行大規(guī)模的估計,不但能為野生物種的分類和系統(tǒng)研究提供核學信息,而且還可為薔薇屬植物資源的育種和遺傳改良利用提供核學信息。對Jian 等[25]、Roberts 等[34]和Yokoya 等[35]關(guān)于薔薇屬1C 值的數(shù)據(jù)進行整理,發(fā)現(xiàn)二倍體種1C 值范圍為0.37~0.89 pg,三倍體種為0.51~0.76 pg,四倍體種為0.46~0.68 pg,該研究的6種食用玫瑰試材均處于上述范圍內(nèi)。平陰1 號與四季玫瑰都是利用雜交手段培育而成的玫瑰品種,其中平陰1 號母本為單瓣紅玫瑰(R. rugosa),父本為重瓣紅玫瑰(R.rugosa‘Plena’)[36];四季玫瑰母本為山刺玫(R.davuricaPall),父本為重瓣紅玫瑰[37]。雖然關(guān)于上述2 個品種的基因組大小還未有報道,但前人研究顯示玫瑰的1C 值為0.57 pg[34]和(0.58±0.07)pg[25],與該研究中平陰1 號[(0.45±0.02)pg]和四季玫瑰(0.51 pg)的數(shù)值相比偏高,導致這種偏差的原因可能是2個食用玫瑰品種雜交親本基因組偏小,也可能是供試材料之間的差異。Roberts 等[34]曾報道了大馬士革的1C 值為0.59 pg,高于該研究中大馬士革的1C 值(0.51 pg),推測產(chǎn)生偏差的原因可能是供試材料本身存在差異,也可能是因為地理條件和倍性水平不同而發(fā)生了雜交,導致其自身遺傳信息存在個體差異。

      食用玫瑰營養(yǎng)豐富、用途廣泛,具有很高的開發(fā)價值和廣闊的應用前景。國外食用玫瑰產(chǎn)業(yè)發(fā)展較好的有保加利亞、土耳其、印度和法國等,但隨著我國經(jīng)濟的快速增長,人民生活水平的不斷提高,我國已成為僅次于歐盟的第二大玫瑰消費地區(qū),食用玫瑰的地位和作用也日趨拓寬,滲透到社會生活的多個領(lǐng)域[38]。該研究采用常規(guī)壓片法,對6 種食用玫瑰品種染色體數(shù)目進行觀察與核型分析,在一定程度上為食用玫瑰品種的倍性與核型研究提供了參考,為后續(xù)食用玫瑰品種的種質(zhì)資源鑒定、系統(tǒng)演化研究及多樣性改良提供了基礎(chǔ)。此外,該研究利用流式細胞術(shù)快速測定了6 種試材的基因組大小,為后續(xù)AFLP 引物中選擇性堿基個數(shù)的確定提供了依據(jù),同時豐富了薔薇屬植物的C 值庫,并為薔薇屬其他物種基因組大小測定方法提供了借鑒。

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