發(fā)菜多糖的提取、純化及生物活性研究進(jìn)展

朱蓉靜，陳雪峰，劉 歡，孟廣燕，黨 玥

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）

多糖在自然界分布較為廣泛，其不僅是動(dòng)物、植物、藻類等有機(jī)體的重要組成成分，還具有抗炎、抗氧化、抗輻射、抗病毒、抗腫瘤、降血糖血脂、免疫調(diào)節(jié)、保肝、美容等多種活性功能[1-2]。近年來(lái)，藻類多糖的抗病毒、抗氧化和降血糖等功能逐漸被人們所發(fā)現(xiàn)。發(fā)菜（Nostoc flagelliforme，發(fā)狀念珠藻）與地木耳、葛仙米同屬于藍(lán)藻（Cyanobacteria），且都是陸生念珠藻（Nostoc），既可食用，也可作為藥用[3]。從《野菜博錄》等古書中可了解到，發(fā)菜歷來(lái)就是我國(guó)的傳統(tǒng)珍肴[3]，而且還具有消熱解毒、調(diào)理腸胃和降血壓等藥用功效[4]。發(fā)菜中含有多糖，鉀、鈣等元素以及蛋白質(zhì)等多種成分[5]。其中，多糖作為發(fā)菜中的重要活性成分之一，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤等活性功能，因此，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景[6-7]。本文主要對(duì)發(fā)菜多糖的提取、分離和純化、分析鑒定、生物合成以及生物活性的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為發(fā)菜多糖的深入研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 發(fā)菜多糖的提取、分離純化和分析鑒定

1.1 發(fā)菜多糖提取

為了進(jìn)一步研究發(fā)菜多糖的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和活性功能，首先需要采取合適且高效的方法提取發(fā)菜多糖。目前，發(fā)菜多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波法、絮凝純化法及酶法等。

1.1.1 熱水浸提法 熱水浸提法是一種傳統(tǒng)的多糖提取方法，也是研究中被使用最多的方法。由于發(fā)菜多糖易溶于熱水，故可利用該方法從發(fā)菜細(xì)胞中提取得到發(fā)菜多糖[8]。提取過(guò)程中，料水比、提取溫度和提取時(shí)長(zhǎng)等條件均會(huì)影響提取的效果。陳雪峰等[9]采用該方法提取發(fā)菜細(xì)胞中的發(fā)菜多糖時(shí)篩選出最佳實(shí)驗(yàn)條件，即料水比為1:120（g/mL），80 ℃條件下提取4 h，最終發(fā)菜多糖得率為5.8%。林永賢等[8]探究了不同料水比、提取溫度和時(shí)間以及提取次數(shù)條件下發(fā)菜多糖得率的大小，最終確定最佳工藝條件，即料水比為1:90（g/mL），在80 ℃條件下提取70 min，共提取3次，得到的發(fā)菜多糖得率為14.1%。對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，在料水比、溫度條件相近的情況下，通過(guò)減少每次提取的時(shí)間而增加提取的次數(shù)能使得發(fā)菜多糖的得率有所提高。但由于發(fā)菜中含有大量的葉綠素、藻藍(lán)素、小分子糖類和脂類物質(zhì)等雜質(zhì)，因此直接用熱水浸提法提取容易造成多糖得率總體較低，故可先利用石油醚脫除色素等雜質(zhì)分子，并用乙醇去除可溶性的小分子糖，再采用熱水浸提法，從而進(jìn)一步提高發(fā)菜多糖得率[10]。

1.1.2 酶解法 酶解法是利用蛋白酶等破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)促進(jìn)多糖的釋放，從而使得多糖提取率得以提高的一種多糖提取方法[11]。劉鼎闊等[12]在提取發(fā)菜多糖時(shí)，將發(fā)菜干粉脫脂后，先后利用胰蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)發(fā)菜樣品進(jìn)行水解。酶解法不僅提高發(fā)菜多糖的水解度，而且得到的多糖分子量較小，也避免化學(xué)法提取過(guò)程中產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)殘留和污染。

1.1.3 超聲波法 超聲波法是一種新型天然物質(zhì)提取方法，利用該方法提取發(fā)菜多糖的原理是利用超聲波的強(qiáng)烈振動(dòng)使發(fā)菜細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞[13]，使多糖等物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)被釋放出來(lái)，從而提高多糖的提取效率。盡管與其他方法相比較超聲波法具有低能耗、高效率的優(yōu)點(diǎn)[14]，但研究發(fā)現(xiàn)提取過(guò)程中超聲時(shí)間越長(zhǎng)越容易使多糖降解[15]，不但會(huì)導(dǎo)致多糖提取率降低，還會(huì)影響多糖的生理活性，因此，利用超聲波法提取多糖時(shí)還應(yīng)盡量減短時(shí)間[16]。李卓等[17]在提取發(fā)菜多糖時(shí)采用超聲波法，并用水為提取溶劑，通過(guò)探究料液比、提取溫度和時(shí)間以及超聲波功率四種因素對(duì)發(fā)菜多糖提取率的影響，確定了最適條件，即料液比為1:50（g/mL），在100 W的超聲波功率和60 ℃的溫度條件下提取20 min后，發(fā)菜多糖的提取率為7.369%。

1.1.4 絮凝純化技術(shù) 絮凝純化技術(shù)主要通過(guò)高分子絮凝劑對(duì)固體微粒及大分子雜質(zhì)進(jìn)行沉淀，從而同時(shí)達(dá)到提取和純化目的[18]。使用該方法不僅能夠降低生產(chǎn)成本，而且提取步驟簡(jiǎn)易方便、安全，效率較高[19]，還能有效去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分子，有效保留所需成分[20]。作為一種新型技術(shù)，絮凝純化技術(shù)近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于多糖等有效成分的提取純化中。其中，殼聚糖是絮凝純化過(guò)程中較為常用的一種絮凝劑，其來(lái)源廣泛，安全無(wú)毒性，且同時(shí)具備吸附絮凝和電中和絮凝作用[21]。張喜峰等[18]利用殼聚糖作絮凝劑，對(duì)樣品溶液進(jìn)行絮凝提取純化，探究在不同的多糖提取液pH、殼聚糖用量以及絮凝溫度和時(shí)間條件下發(fā)菜多糖保留率的大小，并最終確定了最佳條件，即多糖提取液pH為7，殼聚糖用量為1.5 mg/mL，40 ℃條件下提取60 min，發(fā)菜多糖的保留率達(dá)到了90.3%，蛋白質(zhì)去除率達(dá)到了75.1%，且與傳統(tǒng)的熱水浸提法得到的多糖相比，絮凝提取純化的多糖在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)體外自由基的清除能力有所提高。由此可見，使用該方法的提取純化效果較為理想。

1.2 發(fā)菜多糖的分離和純化

經(jīng)過(guò)初步提取得到的粗多糖中通常含有多種雜質(zhì)分子，因此還需要進(jìn)行蛋白質(zhì)、色素、脂類物質(zhì)及無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)的去除，并采用柱層析法達(dá)到進(jìn)一步純化的目的。

1.2.1 除蛋白 去除發(fā)菜粗多糖中的蛋白質(zhì)最常用的方法是Sevag法和三氯乙酸法[9]。Sevag法較三氯乙酸法更加溫和，需要重復(fù)多次才能達(dá)到較好的除雜效果，且多次處理還容易造成多糖損失。陳雪峰等[9]采用Sevag法除蛋白時(shí)，共重復(fù)處理4次才使得CHCl3與水的界面無(wú)蛋白質(zhì)沉淀。梁文裕等[10]比較兩種方法時(shí)發(fā)現(xiàn)Sevag法試劑用量大，重復(fù)次數(shù)多，耗時(shí)耗力，故最終采用了更快速簡(jiǎn)便的三氯乙酸法，使發(fā)菜粗多糖的蛋白質(zhì)含量由7.508 mg/mL降至0.173 mg/mL，蛋白質(zhì)去除率為97.7%，達(dá)到了較好的除雜效果。三氯乙酸法相對(duì)Sevag法除蛋白作用更強(qiáng)，但在采用該法時(shí)應(yīng)注意控制三氯乙酸的濃度，防止其對(duì)發(fā)菜多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用。

1.2.2 除色素、脫脂 發(fā)菜粗多糖中的藻藍(lán)素、葉綠素等色素分子可利用石油醚除去[10]，此外，利用柱層析法也可在純化的過(guò)程中去除色素分子[9]。對(duì)于脫脂，石油醚除了能脫色素外還具有脫脂的作用[10]。CO2超臨界萃取技術(shù)作為一種新型分離純化技術(shù)，也能夠高效分離脂類物質(zhì)，該方法不但具有簡(jiǎn)單易操作、高效率、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，還能有效保留發(fā)菜多糖的有效成分，是一種理想的發(fā)菜粗多糖脫脂除雜方法[22]。劉鼎闊等[12]采用CO2超臨界萃取技術(shù)對(duì)發(fā)菜多糖進(jìn)行脫脂時(shí)，將萃取溫度設(shè)置為58 ℃，萃取壓強(qiáng)設(shè)置為35 MPa，該條件下靜態(tài)萃取l0 min后設(shè)置CO2流量為15 L/h，再動(dòng)態(tài)萃取125 min，除雜效果較好。

1.2.3 透析法 利用透析法分離純化時(shí)需要選擇一種合適的透析膜[23]，陳雪峰等[9]在利用該方法純化發(fā)菜多糖時(shí)，對(duì)大小適宜的選擇性半透膜中的多糖樣品濃縮液用去離子水進(jìn)行透析、除雜，經(jīng)過(guò)48 h后得到了純化后的發(fā)菜多糖。利用透析法在去除無(wú)機(jī)鹽的同時(shí)，還可除去像單糖等小分子雜質(zhì)，從而提高發(fā)菜多糖的純度[11]。

1.2.4 柱層析法 常用于分離純化發(fā)菜多糖的柱層析法主要有離子交換柱層析法和凝膠柱層析法。陳雪峰等[9]在研究中將發(fā)菜胞外粗多糖依次通過(guò)DEAE-52纖維素離子交換柱和Sephadex G-100凝膠柱，最終分離純化得到一種酸性多糖，并對(duì)莢膜粗多糖用同樣的方法進(jìn)行了分離純化，得到了兩種酸性多糖和一種中性多糖。秦韶燕[24]對(duì)自養(yǎng)發(fā)菜的多糖進(jìn)行分離純化時(shí)，以多糖得率和蛋白質(zhì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)比較了發(fā)菜多糖分別經(jīng)過(guò)4種不同類型的樹脂的（DEAE-Cellulose、DEAE52、DEAE01和DEAESephroseCL-6B）分離純化效果，結(jié)果顯示，相對(duì)于其他三種樹脂，DEAE-Cellulose對(duì)發(fā)菜多糖的分離純化效果是最理想的。除了樹脂類型之外，洗脫劑和洗脫方式的差異也都會(huì)造成離子交換樹脂分離純化效果的不同，因此，秦韶燕等[25]在采用DEAE-Cellulose對(duì)發(fā)菜多糖進(jìn)行分離純化時(shí)探究了DEAE離子交換色譜純化的最佳條件。結(jié)果表明，采用OH-型離子交換樹脂，并在洗脫劑NaCl濃度為0.2 mol/L時(shí)，多糖純度達(dá)到81.02%，較原來(lái)提高了近50%，效果最佳。

1.3 發(fā)菜多糖的分析鑒定

1.3.1 含量測(cè)定 在發(fā)菜多糖含量測(cè)定的研究中通常使用的方法為苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法[9-10]。相對(duì)于其他方法，這兩種方法具有操作簡(jiǎn)易、檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，因此在各類研究中被廣泛應(yīng)用[26-27]。白雪娟等[28]為確定合適的水溶性發(fā)菜多糖含量測(cè)定方法，對(duì)比了苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。結(jié)果表明，這兩種方法的測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性均較好，但在一定程度上均會(huì)受發(fā)菜培養(yǎng)基中添加的無(wú)機(jī)鹽離子的影響，因此在測(cè)定培養(yǎng)液中多糖的含量前應(yīng)先去除鹽離子。此外，相對(duì)于蒽酮-硫酸法，苯酚-硫酸法更適用于多糖含量較少的樣品的測(cè)定。

1.3.2 純度鑒定 多糖作為高分子化合物，即便是純品，其微觀結(jié)構(gòu)相對(duì)來(lái)說(shuō)也無(wú)法達(dá)到均一程度，因此在純度鑒定過(guò)程中，無(wú)法用常用的化合物純度標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷多糖純度的大小[29-30]。一般用于鑒定多糖純度的方法有柱色譜法、超離心法、紫外檢測(cè)法、比旋度和電泳法等[26]。發(fā)菜多糖的純度鑒定常用的方法為凝膠柱層析法和紫外光譜分析法。例如，秦韶燕[24]將純化得到的發(fā)菜多糖進(jìn)行凝膠過(guò)濾，得到的凝膠柱洗脫曲線是單一的對(duì)稱峰，則說(shuō)明該發(fā)菜多糖的分子量大小是相對(duì)均一的。于海峰等[31]對(duì)純化得到的發(fā)菜多糖進(jìn)行紫外光譜分析，且紫外光譜圖顯示在260以及280 nm處均無(wú)吸收峰，則說(shuō)明該多糖樣品沒有蛋白和核酸雜質(zhì)包含其中，純度相對(duì)較高。

1.3.3 分子量測(cè)定 在多糖分子量測(cè)定研究中一般采用高效液相色譜法、凝膠色譜法以及滲透壓法[26]。測(cè)定發(fā)菜多糖的分子量時(shí)通常采用高效液相色譜法[32]。此外，采用凝膠過(guò)濾法也可以方便快捷地測(cè)定發(fā)菜多糖的分子量[33]。目前已確定的部分發(fā)菜多糖分子量見表1。于海峰等[31]采用高效液相色譜法對(duì)分離純化得到的兩種多糖的表觀分子量進(jìn)行了測(cè)定和分析，結(jié)果如表1中所示，其中野生發(fā)菜多糖NFPS0的表觀分子量與液體懸浮培養(yǎng)發(fā)菜多糖NFPS2的表觀分子量在同一數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)，差異很小，且與Kenji等[32]報(bào)道的野生發(fā)菜多糖Nostoflan分子量也在同一數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)。

1.3.4 結(jié)構(gòu)測(cè)定 多糖的結(jié)構(gòu)是其活性功能的基礎(chǔ)，因此多糖結(jié)構(gòu)的測(cè)定對(duì)于研究其生物活性具有重要作用。對(duì)于多糖的初級(jí)結(jié)構(gòu)（即一級(jí)結(jié)構(gòu)）和高級(jí)結(jié)構(gòu)（包括二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)），在測(cè)定時(shí)所采用的方法是不同的。一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定主要有三個(gè)方面，即糖苷建的構(gòu)型、單糖的組成和數(shù)量（或比例）[35-36]。通常可利用三氟乙酸將發(fā)菜多糖完全酸水解后，再采用高效液相色譜或氣相色譜法進(jìn)行單糖組成的測(cè)定和分析[36]。目前已確定的部分發(fā)菜多糖的單糖組成及比例見表1。如表1所示，于海峰等[31]、Kenji等[32]以及Huang等[34]測(cè)得的野生發(fā)菜多糖組成均一致。此外，發(fā)菜多糖的結(jié)構(gòu)與培養(yǎng)環(huán)境有密切聯(lián)系。路苗等[35]研究鹽脅迫對(duì)發(fā)菜多糖結(jié)構(gòu)的影響時(shí)，利用柱前衍生高效液相色譜定性定量分析了發(fā)菜胞外多糖的單糖組成和摩爾比例，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)條件和鹽脅迫培養(yǎng)條件下，發(fā)菜細(xì)胞多糖的單糖組成種類一致，但對(duì)應(yīng)的比例差異明顯，如表1所示，鹽脅迫培養(yǎng)條件下葡萄糖和木糖的含量降低，而甘露糖、鼠李糖、半乳糖及葡萄糖醛酸含量提高。逆境條件下發(fā)菜多糖的單糖組成比例發(fā)生改變，這實(shí)際上也是發(fā)菜細(xì)胞對(duì)逆境脅迫的一種抵御方式。對(duì)于發(fā)菜多糖的糖苷鍵構(gòu)型，通常需要經(jīng)過(guò)酶解、高碘酸氧化、剛果紅實(shí)驗(yàn)、元素分析及紅外光譜分析等來(lái)進(jìn)行研究分析[24]。秦韶燕等[24]在分析發(fā)菜多糖的糖苷鍵時(shí)，通過(guò)剛果紅實(shí)驗(yàn)證明了發(fā)菜多糖具有有序的三螺旋結(jié)構(gòu)，并采用高碘酸鈉氧化法證明了該發(fā)菜多糖中包含了1→6、1→2或1→4糖苷鍵，同時(shí)也可能有1→3糖苷鍵。此外，還通過(guò)酶解反應(yīng)證明了發(fā)菜多糖中有 β-(1→4)糖苷鍵，而沒有α-糖苷鍵，此結(jié)果與于海峰[31]通過(guò)紅外光譜分析得到的發(fā)菜多糖只含有β-糖苷鍵的結(jié)果一致。通常具β-螺旋型立體結(jié)構(gòu)的多糖其活性要高于α-螺旋型立體結(jié)構(gòu)，而且發(fā)菜多糖的抗腫瘤活性也與其β-螺旋型的立體結(jié)構(gòu)特征有關(guān)。對(duì)于高級(jí)結(jié)構(gòu)，通常采用核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）、原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope，AFM）等進(jìn)行測(cè)定。其中，利用AFM可進(jìn)行多糖分子表面形貌的觀察，用于觀察發(fā)菜多糖的三維結(jié)構(gòu)[31]。

表1 發(fā)菜多糖的單糖組成及分子量Table 1 Monosaccharide composition and molecular weight of Nostoc flagelliforme polysaccharides

2 發(fā)菜多糖的生物合成研究進(jìn)展

在我國(guó)，發(fā)菜主要分布于西北地區(qū)，且主要生長(zhǎng)在干旱和半干旱區(qū)域[37]，具有防風(fēng)固沙的作用，是沙漠地區(qū)的主要生物固氮資源和生態(tài)系統(tǒng)的重要維護(hù)者。研究表明，發(fā)菜生長(zhǎng)環(huán)境的生態(tài)因子很有特性，光照條件、溫度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等因素均會(huì)影響發(fā)菜的生長(zhǎng)[37-38]。而發(fā)菜多糖作為發(fā)菜生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌的一種重要抗性物質(zhì)，其產(chǎn)量也會(huì)隨環(huán)境因素改變而發(fā)生變化[39]。盡管發(fā)菜對(duì)輻射、干旱等有很強(qiáng)的抗逆性，但在自然條件下生長(zhǎng)極為緩慢，年生長(zhǎng)率不高于10%[40]。再加上為獲取經(jīng)濟(jì)利益而對(duì)發(fā)菜的過(guò)度開采，使得發(fā)菜的自然資源越來(lái)越少，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。因此，為了提高發(fā)菜多糖的產(chǎn)量，研究者采用多種人工培養(yǎng)方式，對(duì)發(fā)菜多糖合成的影響因素及生物合成機(jī)制進(jìn)行了研究，并取得了一定的進(jìn)展。

2.1 發(fā)菜多糖合成的影響因素

2.1.1 溫度 溫度作為發(fā)菜生命活動(dòng)的一個(gè)重要限制因子，能夠直接影響發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝過(guò)程，從而影響多糖的合成[39]。畢永紅等[39]和于海峰等[41]在研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)速率受溫度變化的影響極大，同時(shí)，溫度對(duì)發(fā)菜胞外多糖的合成和分泌量也有顯著影響，且高溫和低溫條件均不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，但能夠提高單位質(zhì)量發(fā)菜多糖的產(chǎn)量。Yu等[42]發(fā)現(xiàn)發(fā)菜細(xì)胞在25 ℃條件下生長(zhǎng)良好，但相對(duì)較低和較高的溫度條件更有利于發(fā)菜多糖的積累。

2.1.2 光照條件

2.1.2.1 光照強(qiáng)度 在發(fā)菜培養(yǎng)過(guò)程中，光照強(qiáng)度能夠直接影響其光合作用，從而影響發(fā)菜的生物量和多糖合成[43-45]。郭偉[43]研究不同光照強(qiáng)度對(duì)發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)菜多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，光照強(qiáng)度的增加有利于發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)菜多糖的合成，且將光強(qiáng)設(shè)置為60 μmol·m-2·s-1時(shí)，發(fā)菜多糖的產(chǎn)量最高，為0.7 mg/L。

2.1.2.2 光照周期 光照周期的變化通過(guò)影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細(xì)胞內(nèi)有機(jī)物的代謝等來(lái)影響胞外多糖的合成[44]。郭偉[43]通過(guò)研究不同光照周期對(duì)發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)菜多糖產(chǎn)量的影響發(fā)現(xiàn)，連續(xù)光照更有利于發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)速率的提高和多糖的積累。

2.1.2.3 光質(zhì) 不同種類微藻對(duì)不同光質(zhì)的敏感程度不同，使得合成和分泌的多糖量也不同，例如，研究發(fā)現(xiàn)螺旋藻（Spirulina platensis）在綠光條件下多糖產(chǎn)量最高，在其他光照條件下產(chǎn)量相對(duì)較少[46]，而對(duì)于發(fā)菜，Han等[47-48]在研究不同種類光源對(duì)發(fā)菜多糖合成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于白色熒光，發(fā)菜細(xì)胞在紅光、藍(lán)光和紅藍(lán)混合光三種條件下能產(chǎn)生更多的發(fā)菜胞外多糖。

2.1.3 主要營(yíng)養(yǎng)物

2.1.3.1 碳源 發(fā)菜是一種光合自養(yǎng)型生物，自然條件下可以以大氣中的CO2和碳酸鹽為碳源[49]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜還可在異養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，即在無(wú)光照的環(huán)境中，發(fā)菜可通過(guò)分解代謝培養(yǎng)基中外加的葡萄糖來(lái)滿足其生長(zhǎng)活動(dòng)所需[49]。Yu[50]在BG-11培養(yǎng)基中分別添加了四種不同的碳源，即果糖、葡萄糖、木糖和蔗糖，且通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)菜處于只有葡萄糖碳源時(shí)，且同時(shí)添加了乙酸鹽的條件下時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)量和多糖產(chǎn)量均顯著提高。此外，韓培培等[49]研究發(fā)現(xiàn)，將葡萄糖設(shè)為發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)基中的唯一碳源，并采用異養(yǎng)流加的培養(yǎng)方法，能夠有效提高發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)量和多糖的產(chǎn)量。

2.1.3.2 氮源 氮元素是藻類生長(zhǎng)代謝所需的重要營(yíng)養(yǎng)因子，不同種類和濃度的氮源會(huì)影響藻類蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)的合成[51]。于海峰等[41]在探究不同氮鹽條件對(duì)發(fā)菜胞外多糖累積的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，硝酸鈉較硫酸銨和尿素更有利于發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)和胞外多糖的合成，且提高培養(yǎng)基中硝酸鈉的濃度可使發(fā)菜多糖的產(chǎn)量增加，但在硝酸鈉的最佳濃度（2.5 g/L）條件下，多糖的產(chǎn)量與無(wú)氮條件下基本一致。湯俊等[51]也通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，氮源的缺乏雖然不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，但會(huì)在一定程度上促進(jìn)胞外多糖的合成。畢永紅等[39]通過(guò)對(duì)照試驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)，氮元素的缺乏會(huì)導(dǎo)致發(fā)菜胞外多糖的合成和分泌量下降?？傊?，盡管發(fā)菜具有一定的固氮能力，也能在氮源缺乏的條件下通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞胞外多糖的分泌實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)角度考慮，適宜、足夠的氮源對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝是必需的。

2.1.3.3 磷源 磷元素同樣是微藻生長(zhǎng)代謝所需的一種營(yíng)養(yǎng)成分，一定濃度的磷源有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和胞外多糖的合成[39]。Yu[50]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，盡管磷酸鹽對(duì)特定細(xì)胞胞外多糖的產(chǎn)量影響很小，但在BG-11培養(yǎng)基中加入KH2PO4時(shí)，發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和胞外多糖的積累量均有所提高。

2.1.3.4 其他因素 采用不同的人工培養(yǎng)方式培養(yǎng)發(fā)菜，其細(xì)胞的生長(zhǎng)和多糖的合成會(huì)受到不同因素的影響。目前，發(fā)菜的人工培養(yǎng)按照培養(yǎng)基形式的不同可分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)[6]。對(duì)于液體培養(yǎng)，除了以上提到的溫度、光照、碳源和氮源外，培養(yǎng)基的pH[42]、攪拌速率[52]等其他因素也會(huì)影響發(fā)菜的細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖的合成[53]；對(duì)于固體培養(yǎng)，除了營(yíng)養(yǎng)成分、溫度等因素外，固體基質(zhì)的材料、濕潤(rùn)性等因素也會(huì)對(duì)發(fā)菜多糖的合成和分泌產(chǎn)生影響[54-56]。

2.2 發(fā)菜多糖的生物合成機(jī)制

發(fā)菜多糖的合成是由多種因子共同參與完成的[57]，其合成機(jī)制較為復(fù)雜。因此，對(duì)發(fā)菜多糖的生物合成途徑、相關(guān)酶和基因等的研究對(duì)于其合成機(jī)制的全面揭示具有重要作用。

2.2.1 生物合成途徑 研究表明，盡管不同種類多糖的結(jié)構(gòu)形式有差異，但其合成過(guò)程幾乎相同[58]，主要包含前體核苷酸糖的合成、糖重復(fù)單元的組裝延伸和聚合、多糖的修飾和輸出三步[6]。

當(dāng)細(xì)胞將培養(yǎng)基中的碳源物質(zhì)吸收至體內(nèi)后，能通過(guò)多條代謝途徑生成能量ATP和多種前體物質(zhì)等供細(xì)胞生長(zhǎng)代謝利用[59]。其中，細(xì)胞在代謝過(guò)程中對(duì)于葡萄糖-6-磷酸的利用量很大，且利用其生成的各種核苷酸糖，經(jīng)活化后可作為前體物質(zhì)參與合成細(xì)胞胞外多糖[6]。通常，糖核苷酸供體在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下能與細(xì)胞膜上的受體物質(zhì)結(jié)合，形成Und-PP-己糖，再在多種特異性糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下完成對(duì)糖重復(fù)單元的組裝過(guò)程[6]。其中，糖基轉(zhuǎn)移酶既是多糖組裝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，同時(shí)也是整個(gè)多糖合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，目前已經(jīng)在多種生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量不同種類的糖基轉(zhuǎn)移酶，而且相關(guān)的研究還在進(jìn)行當(dāng)中。李歐[59]通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)了Paenibacillus elgiiB69中的六個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因，并確定了這六種糖基轉(zhuǎn)移酶各自的催化功能，為多糖生物合成機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。

組裝后，重復(fù)單元開始進(jìn)行延伸和聚合。在大多數(shù)胞外多糖的合成過(guò)程中，糖重復(fù)單元的延伸和聚合都是最關(guān)鍵的一個(gè)步驟[58]，其按機(jī)制可分為Wzy途徑、合酶途徑以及ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑[6]。但是大多數(shù)為Wzy途徑[59]，即Und-p-p-重復(fù)單元在Wzy聚合酶的作用下聚合形成長(zhǎng)鏈多糖后，便會(huì)從與其相連的載體上按一定順序轉(zhuǎn)移到新的Und-p-p-重復(fù)單元上，再進(jìn)行聚合。而且在Wzy途徑中，多糖的運(yùn)輸是在Wzx、Wzy等酶的共同作用下完成的。

2.2.2 生物合成途徑的相關(guān)酶和基因的研究 研究表明，高鹽度[60]、高光強(qiáng)[39]等逆境條件能夠刺激發(fā)菜細(xì)胞產(chǎn)生和分泌胞外多糖，甚至能使得發(fā)菜細(xì)胞通過(guò)改變多糖的單糖組成來(lái)抵抗逆境脅迫[61-62]。隨著基因工程等技術(shù)的發(fā)展，一些研究者為了探究逆境條件下發(fā)菜多糖產(chǎn)量提高的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制，改變了發(fā)菜細(xì)胞的培養(yǎng)條件來(lái)刺激多糖的產(chǎn)生，并與正常條件下的發(fā)菜樣品進(jìn)行比較，再經(jīng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等分析，從而篩選出與發(fā)菜多糖合成相關(guān)的差異表達(dá)基因或蛋白，分析這些差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)對(duì)發(fā)菜多糖合成調(diào)控的作用對(duì)于發(fā)菜多糖合成機(jī)制的進(jìn)一步研究具有十分重要作用[6]。

陳雪峰課題組的前期相關(guān)研究表明，在鹽脅迫條件下時(shí)，發(fā)菜細(xì)胞通過(guò)提高胞外多糖的分泌量來(lái)抵御高鹽離子滲入和水分滲出，并保護(hù)細(xì)胞[5,60]。據(jù)此，范華[6]、陳雪峰等[57]在研究中發(fā)現(xiàn)鹽脅迫條件下糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄水平提高，促進(jìn)了發(fā)菜多糖前體物質(zhì)的合成，從分子層面證明了鹽脅迫下發(fā)菜胞外多糖產(chǎn)量的增加。范華[6]分別對(duì)鹽脅迫條件和正常培養(yǎng)條件下的發(fā)菜進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，共篩選出了五種基因，分別為多糖輸出蛋白基因（PEP）、GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因（GMD）和三種糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因（GT1、GT2、GT3），再利用基因工程技術(shù)對(duì)這五個(gè)基因進(jìn)行克隆與表達(dá)，為發(fā)菜多糖合成機(jī)制的繼續(xù)研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

Han等[47-48]研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于白色熒光，發(fā)菜細(xì)胞在紅光、藍(lán)光和紅藍(lán)混合光三種條件下能產(chǎn)生更多的胞外多糖，并采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法獲得大量差異表達(dá)蛋白。對(duì)參與多糖合成的差異表達(dá)蛋白分析后發(fā)現(xiàn)，三種光照條件下多糖合成的調(diào)節(jié)機(jī)制相同，即通過(guò)促進(jìn)糖核苷酸的合成來(lái)促進(jìn)多糖的產(chǎn)生[63]。而且轉(zhuǎn)錄組學(xué)等分析結(jié)果表明，這三種光照條件下的糖核苷酸酶和糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平均有所提高，故說(shuō)明發(fā)菜細(xì)胞在這三種條件下通過(guò)促進(jìn)糖核苷酸和糖重復(fù)單元的合成來(lái)促進(jìn)多糖的產(chǎn)生[64]。

目前，發(fā)菜細(xì)胞的抗逆境響應(yīng)機(jī)制和多糖的合成機(jī)制還在進(jìn)一步研究中。全面了解發(fā)菜多糖合成相關(guān)的酶和基因有助于構(gòu)建高產(chǎn)多糖的發(fā)菜藻種，從而實(shí)現(xiàn)發(fā)菜多糖的大規(guī)模批量生產(chǎn)，以滿足消費(fèi)者不斷增長(zhǎng)的食用、醫(yī)用等需求[63]。

3 發(fā)菜多糖的生物活性

近年來(lái)的多項(xiàng)研究表明，發(fā)菜多糖具有抗氧化、抑菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等多種活性功能。因此，發(fā)菜多糖在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸被開發(fā)、應(yīng)用，有著良好的發(fā)展前景[33]。

3.1 抗氧化

正常條件下，機(jī)體能夠使得自由基的產(chǎn)生與清除過(guò)程維持在一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中，但是一旦當(dāng)機(jī)體遇到有害刺激時(shí)，這種平衡狀態(tài)就會(huì)被破壞，使得自由基增多，便會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害甚至導(dǎo)致多種疾病出現(xiàn)，例如引起炎癥、形成腫瘤等[11]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜多糖可以有效清除多種自由基，具有較好的體外抗氧化活性。湯俊等[65]就發(fā)菜多糖、葛仙米多糖和地木耳多糖對(duì)三種不同自由基的清除能力大小分別進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，三種多糖對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基的清除作用均較明顯，但是對(duì)DPPH自由基的清除作用均不明顯，其中發(fā)菜多糖對(duì)羥自由基的清除效果較其他兩種多糖是最強(qiáng)的，清除率最高為74.3%。陳雪峰等[66]分別研究了發(fā)菜的胞外多糖和莢膜多糖的抗氧化性。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，超氧陰離子自由基、DPPH和羥自由基均能被發(fā)菜胞外多糖與莢膜多糖有效清除，而且胞外多糖較莢膜多糖的清除能力更強(qiáng)。研究還發(fā)現(xiàn)，野生型發(fā)菜的胞外多糖與人工液體培養(yǎng)的發(fā)菜多糖純化物相比抗氧化性更強(qiáng)，這可能與發(fā)菜多糖的空間結(jié)構(gòu)在經(jīng)過(guò)分離、純化等操作后發(fā)生了改變有關(guān)，而且純化后的發(fā)菜多糖失去了原來(lái)不同多糖化合物之間的協(xié)同作用，因此使得抗氧化活性降低[67]。目前對(duì)發(fā)菜多糖體外抗氧化的研究較多，而對(duì)發(fā)菜多糖體內(nèi)抗氧化的研究還較少。符宏磊等[68]利用小鼠實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)小鼠血清中的CAT、SOD等酶類的活性來(lái)評(píng)價(jià)發(fā)菜多糖的體內(nèi)抗氧化性，研究發(fā)現(xiàn)高劑量的野生發(fā)菜多糖與低劑量的人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖均能顯著提高CAT和SOD的活性，說(shuō)明發(fā)菜多糖可通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮其抗氧化作用。

3.2 免疫調(diào)節(jié)

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜多糖能夠提高免疫細(xì)胞和免疫器官的功能，因此，對(duì)體內(nèi)、體外免疫均具有一定的調(diào)節(jié)作用[69]。

3.2.1 體外免疫調(diào)節(jié) 脾臟作為機(jī)體的一大重要器官，能夠直接反映出機(jī)體免疫功能的好壞。因此，體外試驗(yàn)經(jīng)常通過(guò)檢測(cè)脾臟中脾淋巴細(xì)胞的體外增殖、轉(zhuǎn)化活性來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體免疫水平的高低，故可作為體外免疫活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)[70]。杜潔[70]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜多糖在一定范圍內(nèi)能夠作用于小鼠的脾淋巴細(xì)胞，從而提高其體外免疫功能。朱蓓茹[69]將發(fā)菜多糖純化物進(jìn)行了硫酸化修飾和硒化修飾，且脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)等評(píng)價(jià)指標(biāo)顯示，分子修飾后發(fā)菜多糖的體外免疫活性較分子修飾前有所提高，且硫酸化修飾的發(fā)菜多糖較硒化修飾多糖而言，免疫調(diào)節(jié)活性更強(qiáng)。

3.2.2 體內(nèi)免疫調(diào)節(jié) 體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)包括特異性和非特異性免疫，是免疫系統(tǒng)所包含的脾臟、胸腺等各個(gè)環(huán)節(jié)相互配合的過(guò)程。體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)都對(duì)免疫調(diào)節(jié)和維持機(jī)體健康有重要作用[71]。且胸腺和脾臟能夠直接影響機(jī)體免疫功能的好壞，因此，可以利用胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體免疫能力的好壞[69]。杜潔[70]經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的發(fā)菜多糖能夠顯著提高小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，說(shuō)明發(fā)菜多糖能在一定程度上提高機(jī)體的免疫功能。侯茂霞等[72]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜多糖對(duì)小鼠特異性免疫功能的提高沒有顯著作用，但可通過(guò)作用于非特異性免疫細(xì)胞來(lái)間接提升小鼠的免疫能力。

3.3 抑菌抗炎

目前，已經(jīng)有多種藻類多糖被證明具有抑菌性和抗炎作用[73]。杜潔[70]和郭金英等[73]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜多糖能在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌以及紅曲霉等多種微生物菌種的活性起到抑制作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜多糖能夠?qū)τ啥妆胶徒遣娌四z引起的小鼠耳部和足部炎癥起到一定的減緩作用[73]。目前，對(duì)發(fā)菜多糖抗炎作用的相關(guān)研究相對(duì)較少，還在進(jìn)一步的研究當(dāng)中。

3.4 抗病毒

研究表明，發(fā)菜多糖具有一定的抗病毒性，能夠通過(guò)阻斷病毒對(duì)宿主細(xì)胞吸附的過(guò)程，從而保護(hù)宿主細(xì)胞避免受到病毒的攻擊。Kenji等[32]發(fā)現(xiàn)分離純化得到的發(fā)菜多糖能阻止HSV-1、HSV-2和甲型流感病毒等包膜病毒與細(xì)胞的識(shí)別和吸附，起到較強(qiáng)的抗病毒作用。而且盡管發(fā)菜多糖不能阻斷已經(jīng)結(jié)合在宿主細(xì)胞上的病毒的滲透[74]，但在病毒對(duì)宿主細(xì)胞作用的初期，病毒與細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程能夠被發(fā)菜多糖阻斷，從而降低細(xì)胞被感染的概率。此外，由于該發(fā)菜多糖不具有抗凝血酶活性，因而不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生副作用[32]。因此，發(fā)菜多糖將來(lái)可作為一種有效的抗病毒藥物被開發(fā)利用。

3.5 抗腫瘤

發(fā)菜多糖作為一種新型生物活性多糖，具有一定的體外腫瘤抑制活性[75]。蘇振宏等[76]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜原植體和細(xì)胞產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2都具有抑制作用，而且在作用過(guò)程中Caspase-3酶活性明顯得到了提髙，由此可說(shuō)明發(fā)菜多糖很可能是通過(guò)使線粒體發(fā)生凋亡而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞活性的目的的[76]。路苗[60]在探究鹽脅迫條件對(duì)發(fā)菜胞外多糖抗腫瘤活性的影響時(shí)，考慮到胞外多糖主要在人體腸道中發(fā)揮功能的特點(diǎn)，選擇了人結(jié)腸癌HT-29和LoVo細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，鹽脅迫和正常培養(yǎng)條件下的發(fā)菜胞外多糖都能有效阻止腫瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程，且鹽脅迫條件較正常條件的發(fā)菜多糖作用更強(qiáng)。

4 展望

近年來(lái)，發(fā)菜多糖抗氧化、抗病毒和抑菌抗炎等生物活性逐漸被發(fā)現(xiàn)，在食品、藥品等領(lǐng)域具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。雖然國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)對(duì)發(fā)菜多糖進(jìn)行了一系列研究，但還存在一些問(wèn)題，例如：發(fā)菜多糖的提取率較低；不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜多糖的組成各異，生物活性也有一定的差異；對(duì)于發(fā)菜多糖的合成機(jī)制還未完全了解。因此，還需要通過(guò)結(jié)合新型技術(shù)等方式提高發(fā)菜多糖的提取率，深入研究發(fā)菜多糖結(jié)構(gòu)與功能活性的關(guān)系，探究發(fā)菜多糖降血糖血脂以及調(diào)節(jié)腸道菌群的功能，并繼續(xù)篩選與發(fā)菜多糖合成相關(guān)的蛋白質(zhì)和基因，不斷了解發(fā)菜多糖的整個(gè)代謝調(diào)控機(jī)制，為發(fā)菜多糖在食品、化妝品以及醫(yī)藥等方面的開發(fā)應(yīng)用提供更加全面、系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)。