崔雙慧 朱夢云 郝澤宇 王劍鋒 李娜 許澈

后發(fā)性白內(nèi)障 (posterior capsular opacification, PCO) 是白內(nèi)障患者手術(shù)后常見的并發(fā)癥，影響患者視功能的恢復(fù)，可造成嚴(yán)重的視力損害。術(shù)后殘存的晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells, LECs)的增殖、移行、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是PCO發(fā)生的原因[1]。目前臨床上尚無有效的方法預(yù)防PCO。康柏西普是一種可溶性的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受體誘導(dǎo)劑，玻璃體腔內(nèi)注射常用于治療眼內(nèi)新生血管性疾病，在眼內(nèi)應(yīng)用的安全性和有效性已得到證實[2]。有研究顯示,VEGF可促進(jìn)LECs的增殖[3]。白內(nèi)障手術(shù)破壞了晶狀體前囊膜的屏障功能，使LECs能夠與房水以及玻璃體腔注射的物質(zhì)直接接觸[4]，因此，玻璃體腔內(nèi)注射康柏西普可能影響LECs的功能。本實驗觀察不同濃度的抗VEGF藥物康柏西普對LECs增殖的影響及其相關(guān)機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療PCO提供理論支持。

資料與方法

一、材料與試劑

人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司，康柏西普購自成都康弘生物科技有限公司，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司，MTT試劑、Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，一抗Bax、Bcl-2相關(guān)蛋白購自Proteintech公司，山羊抗兔二抗購自北京中山金橋有限公司。

二、方法

分組：分為對照組(0 mg/ml)和四個不同濃度的康柏西普，康柏西普的濃度分別是(0.1 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml)。

細(xì)胞培養(yǎng)：在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下，用含15%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞傳代周期為2～3 d，對照組不加康柏西普，康柏西普組加入不同濃度的康柏西普，實驗用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.MTT法檢測細(xì)胞存活率：收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5萬/孔接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后第2天更換培養(yǎng)基并加入不同濃度的康柏西普，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，取出96孔板，各孔均加入20 ulMTT溶液,孵育4 h,4 h后取出96孔板，棄舊的培養(yǎng)基，各孔均加入150 ulDMSO,酶標(biāo)儀上震蕩10 min，檢測OD-490 nm各孔的吸光值,同時設(shè)置調(diào)零組，計算存活率。細(xì)胞存活率=(實驗組OD值-調(diào)零組OD值)/(對照組OD值-調(diào)零組OD值)×100%。

2.Annexin V/PI染色檢測細(xì)胞凋亡率：收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，以20萬/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，第二天更換培養(yǎng)基并加入不同濃度的康柏西普，72 h收集各組的舊培養(yǎng)液于15 ml離心管中，PBS洗滌細(xì)胞，收集PBS至各自的離心管中，用不含EDTA胰酶500 ml消化細(xì)胞約3 min，將細(xì)胞懸液移至15 ml離心管中，離心后棄上清，用1 mlPBS重懸細(xì)胞，計數(shù)后，每組取20萬細(xì)胞于對應(yīng)編號的1.5 ml離心管中，離心后棄上清，分別加入200 ul結(jié)合液重懸細(xì)胞，按照凋亡試劑盒說明進(jìn)行染色，避光孵育20 min，300目過濾網(wǎng)過濾，進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

3.Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax和bcl-2的表達(dá)水平：收集對數(shù)生長期期的細(xì)胞，以20萬/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，第二天更換培養(yǎng)基并不同濃度的康柏西普，培養(yǎng)至72 h時提蛋白，BCA檢測蛋白濃度，煮蛋白，計算蛋白上樣量(20 ug體系)。配膠，蛋白上樣，電泳約1.5 h，轉(zhuǎn)膜1.5 h,脫脂牛奶封閉2 h,洗膜，孵一抗，4 ℃搖床過夜，洗膜，孵二抗，37 ℃恒溫水浴箱孵育2 h，洗膜，曝光。曝光結(jié)束后得到目的條帶，分析凋亡促進(jìn)蛋白Bax、凋亡抑制蛋白bcl-2的相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

結(jié) 果

一、MTT法檢測不同濃度康柏西普對LECs存活率的影響

MTT法結(jié)果顯示康柏西普作用于SRA01/04細(xì)胞24、48、72 h，在相同時間點，隨著康柏西普濃度的增加，SRA01/04細(xì)胞的存活率逐漸降低。同一康柏西普作用濃度，隨著作用時間的延長，SRA01/04細(xì)胞的存活率亦呈逐漸降低的趨勢。在相同的時間點比較，0.1 mg/ ml組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),0.5 mg/ml組，1.0 mg/ml組，2.0 mg/ml組與對照組相比均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；進(jìn)一步行兩兩比較，結(jié)果顯示：2.0 mg/ml組SRA01/04細(xì)胞存活率<1.0 mg/ml組SRA01/04細(xì)胞存活率<0.5 mg/ml組SRA01/04細(xì)胞存活率<0.1 mg/ml組SRA01/04細(xì)胞存活率(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度的康柏西普對晶狀體上皮細(xì)胞存活率的影響

二、不同濃度的康柏西普對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示 不同濃度的康柏西普作用于SRA01/04細(xì)胞72 h后，細(xì)胞的凋亡率呈逐漸增加的趨勢，與對照組相比，均具有統(tǒng)計學(xué)意義。0.1 mg/ml組與對照組相比(P<0.05),0.5 mg/ml組，1.0 mg/ml組，2.0 mg/ml組與對照組相比具有顯著差異(P<0.001)。見表2，圖1。

表2 不同濃度的康柏西普對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率的影響

圖1 a示P<0.05與對照組和0.1 mg/ml組相比；b示P<0.05與0.5 mg/ml組相比；c示P<0.05與1.0 mg/ml組相比

三、不同濃度的康柏西普對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western Blot結(jié)果顯示 不同濃度的康柏西普作用于SRA01/04細(xì)胞72 h后，凋亡促進(jìn)蛋白Bax的表達(dá)水平均升高，0.1 mg/ml組與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，0.5 mg/ml組，1.0 mg/ml組，2.0 mg/ml組與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)水平隨著康柏西普濃度的增加逐漸下降，與對照組相比均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

討 論

PCO是引起白內(nèi)障患者術(shù)后視力再次下降的主要原因，其形成的主要機(jī)制是術(shù)后殘存的晶狀體上皮細(xì)胞的增殖，移行和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[5]。手術(shù)方式的改進(jìn)、人工晶狀體材料的選擇和形狀的改進(jìn)以及抗炎和抗代謝藥物的使用在一定程度上延緩了PCO的發(fā)生，但并未從根本上解決，且抗炎抗代謝藥物因其對眼內(nèi)其他組織的毒性，限制了在臨床上的應(yīng)用[6]。目前用于治療PCO的方式主要是釔鋁石榴石激光晶狀體囊切開術(shù)(Nd:YAG laser),其可能會引起眼壓升高、葡萄膜炎、人工晶狀體損害、視網(wǎng)膜脫離、黃斑囊樣水腫等并發(fā)癥[7]。因此，尋找預(yù)防和治療后發(fā)性白內(nèi)障的方法具有重要的意義。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測不同濃度康柏西普對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率的影響，與對照組相比，*示P<0.05,***示P<0.001

康柏西普是分子量為143KD的融合蛋白，可以結(jié)合VEGF-A的所有亞型、VEGF-B和胎盤生長因子(Placental growth factor , PGF)，影響其發(fā)揮相應(yīng)的作用。康柏西普在治療眼內(nèi)新生血管性疾病，脈絡(luò)膜新生血管及糖尿病視網(wǎng)膜變性伴黃斑水腫時，取得了很好的效果，其在眼內(nèi)應(yīng)用的安全性和有效性已被證明[2, 4, 8, 9]。Wang等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，高濃度和高頻率在兔的玻璃體腔內(nèi)注射康柏西普在短時間內(nèi)其對視網(wǎng)膜無明顯毒副作用，視網(wǎng)膜對其可耐受[10]。玻璃體腔內(nèi)注射康柏西普用于治療增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變時，可降低房水中VEGF和PIGF的水平，然而玻璃體腔內(nèi)PIGF的含量并未降低，其原因可能與玻璃體基質(zhì)有關(guān)[11]。Yao等[12]在玻璃體摘除的兔眼模型中研究發(fā)現(xiàn)，在兔眼玻璃體腔注射劑量為0.5 mg/眼的康柏西普后，注射眼房水中的康柏西普濃度僅可達(dá)到0.26±0.10 μg/ml。臨床上康柏玻璃體腔注射的劑量為0.5 mg/0.05 ml，因此，藥物到達(dá)房水中的濃度也將非常低，對LECs將產(chǎn)生何種影響尚未知。

晶狀體是不含血管的透明組織，處在相對缺氧的環(huán)境，這對于維持晶狀體的透明是非常重要的。研究顯示LECs表達(dá)VEGF和VEGFR，VEGF對晶狀體的發(fā)育具有重要作用。VEGF對LECs的增殖具有促進(jìn)作用，與VEGF的濃度呈劑量-效應(yīng)關(guān)系[3，13]。抗VEGF藥物康柏西普作為治療眼內(nèi)新生血管疾病的一線藥物，可以結(jié)合VEGF的多種亞型，玻璃體腔內(nèi)注射康柏西普可能對LECs產(chǎn)生一定的影響，從而影響PCO的形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著康柏西普濃度的增加，LECs的存活率逐漸降低。Jun等研究發(fā)現(xiàn)，抗VEGF藥物貝伐單抗在(0.1 mg/ml～2.0 mg/ml)對體外培養(yǎng)的永生化的晶狀體上皮細(xì)胞-B3的存活率、增殖具有促進(jìn)作用，且與濃度呈正相關(guān)，可能與本實驗所培養(yǎng)的細(xì)胞株不同、不同藥物的作用機(jī)制不同有關(guān)。有研究表明，血管內(nèi)皮因子受體拮抗劑阿替西尼對體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞FHL124的生長具有抑制作用[14]，本實驗結(jié)果也顯示康柏西普對LECs的增殖具有抑制作用。同時，本研究結(jié)果顯示0.1 mg/ml的康柏西普即可發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用(P<0.05)，隨著康柏西普濃度的升高，凋亡促進(jìn)蛋白Bax的表達(dá)水平升高，凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)量逐漸降低，說明康柏西普能夠促進(jìn)LECs的凋亡。

不同濃度的康柏西普均可促進(jìn)LECs的凋亡，Bax的表達(dá)升高，bcl-2的表達(dá)降低，但是低濃度時(0.1 mg/ml)，康柏西普對LECs的存活率無明顯影響，Bax的表達(dá)水平也無統(tǒng)計學(xué)意義。推測，在低濃度時細(xì)胞的凋亡率升高，可能與Bcl-2的水平降低有關(guān)，在濃度升高時，LECs的凋亡率升高，LECs增殖受到抑制，可能是Bax和Bcl-2共同發(fā)揮作用的結(jié)果。因此，康柏西普抑制LECs的增殖可能是通過促進(jìn)Bax的表達(dá)，抑制bcl-2的表達(dá)來實現(xiàn)的。

本實驗從不同的方面觀察不同濃度的康柏西普對LECs的影響，其可發(fā)揮抑制LECs增殖，促進(jìn)LECs凋亡的作用。本實驗的不足之處是未對影響LECs增殖和凋亡的其他因素進(jìn)行探討。另外，本實驗所用康柏西普濃度明顯高于臨床用藥時在房水中的濃度，臨床上是否可以通過提高用藥濃度抑制LECs增殖，以預(yù)防和治療PCO，有待進(jìn)一步研究。