宋立新，梁雨濤，張云霞，王慧格，許鵬飛，何 娟*，谷立峰

1.河南水利與環(huán)境職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450001

2.河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 鄭州 450001

3.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450000

谷物在生長、收割、晾曬、儲存的過程中易受到真菌毒素的污染[1]，其中黃曲霉毒素毒性極大，黃曲霉毒素B1被劃分為Ⅰ類天然致癌物[2]。因此，從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中有效地富集、分離并測定黃曲霉毒素的含量，是保障食品安全至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

目前針對黃曲霉毒素的檢測主要采用高效液相色譜法[3-5]，GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G 族的測定》對食品中黃曲霉毒素的樣品前處理使用的是免疫親和柱。免疫親和柱雖然特異性好，但是價格昂貴、只能一次性使用且儲存條件苛刻，因此，尋找一種替代免疫親和柱的材料成為研究重點(diǎn)。分子印跡技術(shù)是近些年發(fā)展起來的，能夠選擇性識別某一物質(zhì)(目標(biāo)分子)的一種富集技術(shù)[6-8]。該技術(shù)通過聚合反應(yīng)合成的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIPs)經(jīng)洗脫后，保留空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)[9]，這些位點(diǎn)與分析物相似，可選擇性吸附目標(biāo)物，從而達(dá)到純化的目的。隨著分子印跡技術(shù)的迅速發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，分子印跡-固相萃取常常被用在樣品前處理技術(shù)中[10-14]。

為避免使用價格昂貴、毒性大的黃曲霉毒素對操作人員的傷害，以及模板洗脫不完全所造成的誤差，可選擇與黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)類似但毒性小的槲皮素作為替代模板[15-17]。作者采用單因素和正交試驗對沉淀聚合法制備槲皮素分子印跡聚合物的合成條件進(jìn)行優(yōu)化。通過紅外光譜、掃描電鏡和粒度分布對聚合物的化學(xué)組成、外觀形態(tài)和粒徑尺寸進(jìn)行表征；通過等溫吸附和吸附量試驗支撐優(yōu)化結(jié)果，測定聚合物吸附性能。將聚合物作為吸附劑制備成固相萃取柱分離和富集發(fā)霉小麥中的黃曲霉毒素，分析小麥的霉變情況。

1 材料與方法

1.1 試劑

槲皮素(分析純)、丙烯酰胺(分析純)、甲醇(色譜純)：上海麥克林生化科技公司；黃曲霉毒素(AFG1、AFG2、AFB1、AFB2)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰乙酸、甲醇、乙醇：分析純，洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見光譜儀：日本島津公司；Nicolet Avatar 360紅外傅里葉紅外變換光譜儀：美國熱電公司；Sigma 300掃描電子顯微鏡：德國蔡司公司；Mastersizer 2000激光粒度儀：英國馬爾文公司； HPLC-2695高效液相色譜儀：美國沃特世公司；DF-101D集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 單因素和正交試驗

將模板與單體物質(zhì)的量之比(1∶ 5、1∶ 6、1∶ 7、1∶ 8)、模板與交聯(lián)劑物質(zhì)的量之比(1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30)、引發(fā)劑用量(1%、2%、3%、4%)、反應(yīng)溫度(80、84、88、92 ℃)、反應(yīng)時間(4、5、6、7 h)等作為考察因素，進(jìn)行單因素試驗。

在單因素試驗基礎(chǔ)上設(shè)計模板與單體物質(zhì)的量之比(A)、模板與交聯(lián)劑物質(zhì)的量之比(B)、引發(fā)劑用量(C)、反應(yīng)時間(D)四因素三水平正交試驗，對合成反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 槲皮素分子印跡聚合物的制備

稱取0.604 0 g(2 mmol)槲皮素、0.861 8 g(12 mmol)丙烯酰胺，加入20 mL乙醇作為反應(yīng)溶劑于50 mL錐形瓶中。超聲溶解15 min后，使其充分混合。然后加入7.54 mL(40 mmol)的EDMA、0.263 7 g的AIBN，封口，超聲處理5 min，使其全部溶解，將錐形瓶中的體系轉(zhuǎn)入250 mL三口燒瓶中，并添加130 mL乙醇溶劑，加磁子，于88 ℃油浴鍋中反應(yīng)5 h。抽濾，得黃色粉末物質(zhì)，即為槲皮素分子印跡聚合物(MIPs)。合成后，MIPs需經(jīng)洗脫將模板分子除去，洗脫液為甲醇與乙酸(體積比4∶ 1)混合液。

以同樣的合成方法與條件，在不添加槲皮素的情況下合成非印跡聚合物(non-molecularly imprinted polymers，NIPs)。

1.5 槲皮素分子印跡聚合物的表征

將制得的槲皮素分子印跡聚合物分別按傅里葉紅外變換光譜儀要求的KBr壓片法、掃描電子顯微鏡要求的噴金法、激光粒度儀的要求制樣后，進(jìn)行性能表征。

1.6 MIPs和NIPs吸附量的測定

配制不同質(zhì)量濃度(0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL)的槲皮素溶液,分別取6 mL于10個樣品管中，編號，向每個樣品管中加入10 mg MIPs，渦旋約15 s，靜置1 h后，過濾上清液，計算聚合物對模板分子的吸附量。按照以上步驟對NIPs的吸附量進(jìn)行測定。

式中：Q為吸附量，μg/mg；C0為吸附前質(zhì)量濃度，μg/mL；Cn為吸附后質(zhì)量濃度，μg/mL；V為吸附溶液的體積，mL；m為質(zhì)量聚合物(MIPs或NIPs)的質(zhì)量，mg。

1.7 吸附量隨時間的變化

配制100 mL質(zhì)量濃度為30 μg/mL的槲皮素溶液，取10個樣品管，每個樣品管中加入6 mL槲皮素溶液，再分別加入10 mg MIPs，搖動混勻，過濾，待測。這10個樣品液測定的時間分別為0.4、0.5、1、2、3、5、10、20、40 min,計算每個時間的吸附量，繪制吸附量隨時間的變化曲線。

1.8 SPE柱制備及使用

采用濕法裝柱法自制SPE小柱，100 mg的印跡聚合物放入含有3 mL甲醇的燒杯中，攪拌均勻，然后將其轉(zhuǎn)移到空的固相萃取柱中，固相萃取柱的兩端使用聚乙烯篩板進(jìn)行密封。柱子制備成功后，使用5 mL甲醇活化，并用10 mL去離子水進(jìn)行洗滌，待用。

參考GB/T 5009.22—2016并稍加修改。將15 mL提取液在自制SPE柱上樣，隨后用10 mL去離子水洗滌雜質(zhì)。用2 mL洗脫溶劑(V甲醇∶V去離子水=9∶ 1)，洗脫保留在SPE柱中的AFs，控制流速為2滴/s。用N2將洗脫液吹至接近干燥，然后溶于1 mL色譜級甲醇中，0.22 μm濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備液相色譜進(jìn)樣。

1.9 高效液相色譜法

液相色譜條件：色譜柱為C18柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相為甲醇-水(45∶ 55，V/V)；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫25 ℃；檢測器為熒光檢測器，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

1.10 實際樣品分析

稱取25 g小麥樣品于250 mL錐形瓶中，加入100 mL的提取液甲醇-水(V甲醇∶V水=7∶ 3)，使用搖床振蕩20 min。用普通濾紙進(jìn)行過濾，再移取濾液按8∶ 42進(jìn)行稀釋，稀釋液采用1%吐溫-20 和磷酸鹽緩沖液(10 mL的吐溫-20加入1 L 磷酸鹽緩沖液(pH=7.0，8 g NaCl，1.44 g磷酸氫二鈉，0.24 g磷酸二氫鉀，0.2 g氯化鉀，用990 mL的去離子水溶解，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值，最后稀釋至1 L))中。最后采用玻璃纖維濾紙過濾，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

在聚合物制備過程中，通過超聲處理使單體(丙烯酰胺)與模板分子(槲皮素)以氫鍵的方式進(jìn)行預(yù)聚合，在交聯(lián)劑和引發(fā)劑的作用下得到聚合物。然后利用有一定弱酸性的混合溶液將模板與單體間的氫鍵斷開，將模板分子洗去，此時的MIPs上保留了模板分子留下的空腔。該空腔在遇到與模板分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)時，可以實現(xiàn)對該物質(zhì)的吸附。因此，可以通過對模板分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行選擇，從而實現(xiàn)對目標(biāo)物分離和富集的目標(biāo)。

根據(jù)前人的研究成果[18-20]，將模板與單體的比例、模板與交聯(lián)劑的比例、引發(fā)劑用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等作為考察因素，進(jìn)行單因素試驗。反應(yīng)溫度主要是影響聚合物的轉(zhuǎn)化率，對聚合物的吸附性能影響不大，所以優(yōu)化后選擇合適的反應(yīng)溫度88 ℃。通過單因素試驗得到每個量的最佳值：A模板與單體比例1∶ 6、B模板與交聯(lián)劑比例1∶ 20、C引發(fā)劑用量3%、D反應(yīng)時間5 h。

2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上設(shè)計四因素三水平的正交試驗，以聚合物的吸附量為指標(biāo)，對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表1。

表1 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

由表1可知,極差RB>RD>RA>RC，可以判斷在聚合過程中，模板與交聯(lián)劑物質(zhì)的量之比對聚合物吸附性能的影響最大，其次是反應(yīng)時間，引發(fā)劑用量對聚合物吸附性能的影響最小。因此，通過正交試驗得到的聚合物合成優(yōu)化結(jié)果為模板、單體、交聯(lián)劑的物質(zhì)的量之比為1∶ 6∶ 20，引發(fā)劑用量3%，反應(yīng)聚合時間5 h。

2.3 聚合物的表征

2.3.1 紅外光譜

圖1 MIPs的紅外光譜圖

2.3.2 電鏡掃描

由圖2可知：聚合物由規(guī)則的球形顆粒團(tuán)聚組成，聚合物微球的粒徑大小均勻、合適且分布情況較為均勻。反應(yīng)得到的產(chǎn)物極具沉淀聚合方法的特點(diǎn)，聚合物的粒徑均勻、潔凈。此外，聚合物形貌清晰，表面呈現(xiàn)出疏松多孔的特征。聚合物有用作吸附材料的潛力。

圖2 MIPs掃描電鏡圖

2.3.3 粒度分析

如圖3所示，聚合物的粒度主要分布在1～10 μm，平均粒度為4 μm，粒徑分布均勻。聚合物顆粒在小于1 μm的范圍內(nèi)有分布是在聚合過程中反應(yīng)不完全引起的。為避免這些顆粒的存在對試驗造成的誤差，在后續(xù)試驗中合成的聚合物均經(jīng)過了輕度的漂洗，利用顆粒在水中的下沉速度不同進(jìn)行分離，棄去了產(chǎn)物中較細(xì)的顆粒。粒度分析結(jié)果與掃描電鏡結(jié)果相吻合，為印跡聚合物能夠作為固相萃取柱的填料奠定了基礎(chǔ)。

圖3 聚合物粒徑分布

2.4 吸附性能

2.4.1 等溫吸附

圖4為MIPs與NIPs分別對不同質(zhì)量濃度的槲皮素溶液的等溫吸附結(jié)果，MIPs吸附能力在各個質(zhì)量濃度的槲皮素溶液中均優(yōu)于NIPs，且隨著溶液質(zhì)量濃度的增加吸附量持續(xù)增大，符合吸附材料應(yīng)有的吸附性能。隨著槲皮素溶液質(zhì)量濃度的增加，MIPs的吸附性能相較NIPs更加優(yōu)越。MIPs和NIPs的吸附量隨著槲皮素溶液質(zhì)量濃度的增加都呈上升趨勢，且槲皮素質(zhì)量濃度為40 μg/mL時MIPs吸附量可達(dá)到12.76 μg/mg。

圖4 MIPs和NIPs的等溫吸附

2.4.2 吸附量隨時間的變化

聚合物在相同質(zhì)量濃度的槲皮素溶液中吸附量隨時間的變化如圖5所示。聚合物在吸附前期(0～10 min)，吸附量變化非?？?，隨著吸附時間的延長，聚合物對槲皮素的吸附量的增量明顯減緩。吸附時間延長到10 min以后，聚合物對槲皮素的吸附量進(jìn)入平穩(wěn)期，即吸附已經(jīng)達(dá)到了飽和。在該情況下，增加吸附時間對聚合物的吸附量影響不大，因此，在后續(xù)試驗中將吸附時間控制在10 min。

圖5 吸附量隨時間的變化

2.5 方法評價

以制得的分子印跡固相萃取柱對樣品進(jìn)行前處理，結(jié)合高效液相色譜建立方法，為驗證該方法的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，對方法的檢出限、定量限、線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度等性能參數(shù)進(jìn)行了評估。如表2所示，4種AFs的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.5～30 μg/kg，R2=0.999 1～0.999 6，線性良好，可用于對AFs的含量進(jìn)行定量計算。AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的檢出限分別為0.05、0.02、0.03、0.05 μg/kg,定量限分別為0.18、0.07、0.10、0.18 μg/kg。檢出限和定量限都遠(yuǎn)低于國家對食品中AFs的限量，自制SPE柱結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測器的方法可用于糧食中AFs的檢測。

表2 4種AFs檢測方法的檢出限、定量限和線性范圍

為驗證方法的可靠性，根據(jù)優(yōu)化好的SPE柱的固相萃取條件，設(shè)定加標(biāo)量5、10、25 μg/kg，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，并計算RSD。

由表3和表4可知,在加標(biāo)量5、10、25 μg/kg條件下，4種AFs的加標(biāo)回收率為92.5%～118.4%，RSD為3.14%～6.03%。RSD均小于國標(biāo)中規(guī)定的15%，說明自制的SPE柱用于糧食中4種AFs的檢測具有較好的回收率和準(zhǔn)確度，可用于實際樣品中AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的分析檢測。

表3 4種AFs的加標(biāo)回收率

表4 方法的精密度

2.6 實際樣品分析

將自制的分子印跡固相萃取柱對放置1 a以上的小麥樣品中的黃曲霉毒素進(jìn)行分離和純化，然后利用高效液相色譜法檢測洗脫液中黃曲霉毒素的質(zhì)量濃度，分析小麥的霉變情況。

對小麥中黃曲霉毒素進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6

圖6 小麥中黃曲霉毒素分析

所示。此時小麥中產(chǎn)生的毒素分別為AFG2、AFG1和AFB2，未產(chǎn)生AFB1。且AFG2、AFG1和AFB2的量分別為33.36、108.66、23.52 μg/kg。在實際樣品分析中，發(fā)現(xiàn)由于樣品放置環(huán)境和小麥自身的形態(tài)不同，小麥霉變的速度以及產(chǎn)生毒素的含量和霉變位置先后順序也各有差異。小麥表皮相對較厚，在放置過程前期不易發(fā)霉，后期一旦發(fā)霉，其霉變速度相比較前期會加快。

3 結(jié)論

沉淀聚合法制備MIPs的最佳條件為模板、單體、交聯(lián)劑的物質(zhì)的量之比為1∶6∶ 20，引發(fā)劑用量3%，反應(yīng)溫度88 ℃，反應(yīng)時間5 h。得到的MIPs通過紅外光譜儀、掃描電子顯微鏡和粒徑分布儀進(jìn)行表征，結(jié)果顯示成功合成分子印跡聚合物。MIPs粒徑均勻、吸附性能好，優(yōu)化條件下最大吸附量可達(dá)到12.76 μg/mg。以制得的MIPs為填料制備的固相萃取柱對實際樣品進(jìn)行前處理，結(jié)合高效液相色譜建立分析方法，并對方法的線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度等性能參數(shù)進(jìn)行了評價。該方法能夠用于糧食中痕量黃曲霉毒素的分離、純化和分析，為監(jiān)測糧食污染提供了一種新方法。