南極磷蝦蝦青素研究進(jìn)展

劉志東，馬德蓉，陳雪忠，黃洪亮，林娜，張忭忭*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 200093)

南極磷蝦Euhausiasuperba屬于節(jié)肢動(dòng)物門Arthropoda甲殼動(dòng)物綱Crustacea磷蝦目Euphausiacea磷蝦科Euphausiidae磷蝦屬Euphausia磷蝦種Euphausiasuperb。據(jù)評(píng)估，南極磷蝦現(xiàn)有生物資源量約為3.79億t[1]。南極海洋生物資源養(yǎng)護(hù)委員會(huì)(CCAMLR)規(guī)定每年南極磷蝦的預(yù)警捕撈限額為860萬(wàn)t[2]。南極磷蝦富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、蝦青素和甲殼素等物質(zhì)，并具有非常強(qiáng)的抗氧化活性。近年來(lái)，南極磷蝦已經(jīng)成為全球遠(yuǎn)洋漁業(yè)的重要捕撈、加工對(duì)象，南極磷蝦產(chǎn)品在飼料、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域均獲得了廣泛應(yīng)用。因此，南極磷蝦的高效開(kāi)發(fā)與高值利用具有打造海洋生物戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)的巨大潛力。

蝦青素Astaxanthin，又稱蝦黃素，是一種酮式類胡蘿卜素。由于蝦青素具有良好的功能特性，在水產(chǎn)飼料、保健品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用[3]。根據(jù)來(lái)源不同，蝦青素主要分為天然蝦青素和合成蝦青素，目前95%的蝦青素產(chǎn)品是合成蝦青素。隨著食品安全和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的提升、制備及應(yīng)用技術(shù)的進(jìn)步及天然蝦青素價(jià)格的下降，天然蝦青素正展現(xiàn)出更好的發(fā)展?jié)摿Α?017年蝦青素的市值已達(dá)到5.5億美元，預(yù)計(jì)2022年銷售額將達(dá)到8.0億美元，2025年有望達(dá)到10億美元[4]。學(xué)術(shù)界和企業(yè)界圍繞著蝦青素的來(lái)源、制備技術(shù)及產(chǎn)品應(yīng)用開(kāi)展了大量工作，取得了積極進(jìn)展。目前蝦青素產(chǎn)業(yè)也面臨著原料來(lái)源單一、制備方法亟待改進(jìn)、產(chǎn)品功能急需拓展等問(wèn)題。南極海域特殊的地理、氣候環(huán)境賦予了南極磷蝦獨(dú)特的功能特性，巨大的生物資源量賦予了南極磷蝦蝦青素穩(wěn)定的來(lái)源，因此，南極磷蝦可以作為潛在的蝦青素原料來(lái)源。此外，南極磷蝦漁業(yè)相較于其他遠(yuǎn)洋漁業(yè)作業(yè)環(huán)境更加苛刻、產(chǎn)業(yè)成本更高，這給南極磷蝦產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了更大的成本壓力[5]。亟待開(kāi)展以南極磷蝦蝦青素為代表的功效組分深度開(kāi)發(fā)利用，推動(dòng)南極磷蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本文系統(tǒng)綜述了南極磷蝦蝦青素研究進(jìn)展，旨在為南極磷蝦蝦青素的深度研究和開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)信息。

1 蝦青素概述

蝦青素(3,3′-二羥基-β,β′-胡蘿卜素-4,4′-二酮基)屬于烯萜類不飽和化合物，分子式為C40H52O4，分子量為596.84，結(jié)構(gòu)如圖1所示。蝦青素具有較長(zhǎng)的共軛雙鍵鏈，其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，屬于弱極性化合物。由于蝦青素化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同其存在多種異構(gòu)體(幾何和光學(xué))，最常見(jiàn)的蝦青素幾何異構(gòu)體主要有9-順式蝦青素、13-順式蝦青素和15-順式蝦青素[4]。研究表明，位于蝦青素共軛雙鍵鏈兩端的手性碳原子C-3和C-3′分別以R或S的形式存在，分別產(chǎn)生3種光學(xué)異構(gòu)體，即全順式(3S,3′S)、順-反式(3S,3′R)和全反式(3R,3′R)，其中(3S,3′S)和(3R,3′R)異構(gòu)體為鏡像(對(duì)映體)[6]。天然蝦青素主要存在于真菌(紅法夫酵母等)、藻類(雨生紅球藻、綠球藻等)、甲殼動(dòng)物和鮭魚(yú)等[7]生物中，其主要以游離蝦青素、蝦青素單酯和蝦青素雙酯的形式存在[8]。

圖1 蝦青素結(jié)構(gòu)及其立體異構(gòu)體[4]

蝦青素結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致其生物活性的不同。研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素雙酯與游離蝦青素、蝦青素單酯相比具有更強(qiáng)的親脂性，在腸道中的吸收更為活躍，生物利用效價(jià)更高[9]。自然環(huán)境中，蝦青素主要由微藻、細(xì)菌、植物和酵母等合成。由于絕大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)不能直接合成蝦青素，也不能把其他類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成蝦青素，只能通過(guò)食物攝入獲得。蝦青素也被稱為“超級(jí)維生素E”，主要是由于蝦青素的抗氧化活性是β-胡蘿卜素的10倍，是α-生育酚的100倍[10]。蝦青素具有良好的生物學(xué)功效，如抗氧化、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病、抗紫外線輻射、增強(qiáng)免疫能力、改善運(yùn)動(dòng)功能等[11]。蝦青素還是唯一能穿透血-腦(blood-brain)、血-視網(wǎng)膜(blood-retina)屏障的酮式類胡蘿卜素，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腦功能也會(huì)產(chǎn)生積極影響，因此，蝦青素可以作為一種功能因子應(yīng)用于不同領(lǐng)域。但現(xiàn)有蝦青素穩(wěn)定性差、生物利用度低，在一定程度上限制了其應(yīng)用。隨著人們食品安全意識(shí)的增強(qiáng)及對(duì)化學(xué)合成食品添加劑的擔(dān)憂，天然來(lái)源蝦青素受到了人們的廣泛關(guān)注。

2 南極磷蝦蝦青素

南極磷蝦蝦青素包括游離蝦青素、蝦青素單酯和蝦青素雙酯3種形式，主要以(3R,3′R)的形式存在[12]。南極磷蝦蝦青素的含量為30～40 μg/g。楊澍[13]研究發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦醋的脂肪酸主要以C20:5、C22:6和C18:1為主，含有少量的C16:0和C14:0。深入研究發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦蝦青素可以通過(guò)淬滅單線態(tài)氧和清除自由基發(fā)揮抗氧化活性；同時(shí)蝦青素分子兩端各連接有一個(gè)紫羅蘭酮環(huán)，每個(gè)紫羅酮環(huán)上含有羥基和酮基，這種獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)使其可以從內(nèi)到外與細(xì)胞膜相連，其多烯鏈可以捕獲細(xì)胞膜中的自由基，末端環(huán)可以清除細(xì)胞膜表面和內(nèi)部的自由基，表現(xiàn)出比其他類胡蘿卜素更好的生物活性[14-17]。但這種結(jié)構(gòu)也使蝦青素更容易受到光、熱、氧等的作用而遭到破壞，影響其穩(wěn)定性。南極磷蝦蝦青素的純品是暗紅棕色粉末，熔點(diǎn)為215～216 ℃；不溶于水，易溶于二氯甲燒、氯仿、二甲基亞砜、丙酮、苯、吡啶等有機(jī)溶劑，但在不同有機(jī)溶劑中的溶解度有差異。南極磷蝦蝦青素具有優(yōu)異的功能特性，巨大而相對(duì)穩(wěn)定的生物資源量，使其成為天然蝦青素開(kāi)發(fā)利用的良好選擇。

3 南極磷蝦蝦青素的制備方法

3.1 南極磷蝦蝦青素提取方法

目前，蝦青素的制備主要通過(guò)化學(xué)合成和天然提取兩種方法。化學(xué)合成蝦青素與天然蝦青素在異構(gòu)體含量、存在狀態(tài)、生物活性及應(yīng)用穩(wěn)定性等方面存在較大差異[4]。現(xiàn)有的蝦青素產(chǎn)品主要是化學(xué)合成蝦青素，約占蝦青素總量的95%，價(jià)格約為2 000 美元/kg，主要用于水產(chǎn)飼料領(lǐng)域；天然來(lái)源蝦青素的價(jià)格約為5 000 美元/kg，主要用于膳食補(bǔ)充、化妝品和食品添加劑等領(lǐng)域。蝦青素的國(guó)外生產(chǎn)企業(yè)主要有美國(guó)的Cyanotech公司和Mera制藥公司，日本的FUJI公司、YAMAHA集團(tuán)和Biogenic公司，印度的Bioprex公司和Parry公司，以色列的Algatech公司，瑞士的Roche公司，德國(guó)的BASF公司等；國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)主要有云南愛(ài)爾發(fā)生物技術(shù)股份有限公司、荊州市天然蝦青素有限公司和云南云彩金可生物技術(shù)有限公司等[4,7,18-19]。

目前，南極磷蝦蝦青素的提取方法主要包括有機(jī)溶劑法、酶解法和超臨界CO2萃取法等(表1)。

表1 南極磷蝦蝦青素提取方法

3.1.1 有機(jī)溶劑法 有機(jī)溶劑萃取法是目前蝦青素提取的主要方法，其優(yōu)點(diǎn)是得率較高。蝦青素為脂溶性色素，溶劑的選擇既要考慮蝦青素的溶解度又要考慮其極性。常用的有機(jī)溶劑主要有甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷、氯仿、二甲基亞砜等及這些溶劑的組合[20]。但有機(jī)溶劑提取法不足之處是有些溶劑具有毒性，存在一定的安全隱患。

宋素梅[21]以酶解后的南極磷蝦蝦殼殘?jiān)统恋頌樵希容^了不同有機(jī)溶劑對(duì)總類胡蘿卜素提取率的影響。結(jié)果表明，蝦殼殘?jiān)淖罴烟崛∪軇楸?，?yōu)化條件下總類胡蘿卜素提取率為15.6%；沉淀的最佳提取溶劑為乙醇，最佳提取條件下總類胡蘿卜素提取率為73.7%。此外，該研究者還分析了粗提液濃度、皂化溫度和堿濃度對(duì)游離蝦青素含量的影響，獲得了合適的皂化條件，優(yōu)化條件下游離蝦青素含量為55.75 μg/mL。于曉[22]以南極磷蝦蝦殼為材料，比較了不同有機(jī)溶劑的提取效果，確定以丙酮為提取劑，優(yōu)化條件下總類胡蘿卜素提取率為(350.71±12.06)μg/g，與丙酮浸提取率(228.90±6.76)μg/g相比提高了53.21%。此外，該研究者還以南極磷蝦粉為原料，以酵母菌為發(fā)酵劑，優(yōu)化條件下獲得的總類胡蘿卜素提取率為(191.91±4.09)μg/g，與丙酮浸提取率(228.90±6.76)μg/g相比提高了24.41%。張曉燕[23]以南極磷蝦蝦殼為原料，以二氯甲烷為提取劑，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，最佳提取條件下蝦青素提取率為131.56 μg/g。

有機(jī)溶劑直接萃取的效果較好，但耗時(shí)長(zhǎng)，需要輔助其他技術(shù)，常與超聲波萃取、超高壓萃取、微波萃取等方法聯(lián)用以提高萃取效率。孫來(lái)娣[24]以南極磷蝦粉為原料，采用二氯甲烷-甲醇作為提取劑，利用中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化蝦青素提取因素，最佳提取條件下蝦青素提取率為179.00 mg/kg。此外，有機(jī)溶劑通常具有較低的沸點(diǎn)，也可能會(huì)引起食品安全問(wèn)題。

3.1.2 酶解法 酶解法是一種環(huán)境友好的提取技術(shù)，具有能耗小、時(shí)間短、反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)；常用作前處理方法破壞蝦青素與蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可與其他方法聯(lián)合同時(shí)提取甲殼素和蝦青素。談俊曉[25]以冷凍南極磷蝦為原料，采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合法酶解，以無(wú)水乙醇為提取劑，利用響應(yīng)面優(yōu)化法研究了蝦青素的最佳提取工藝條件，最佳提取條件下蝦青素的提取率為90.42%。這表明，采用雙酶復(fù)合酶解法能夠顯著提高南極磷蝦蝦青素的提取效率。Wang等[26]以冷凍南極磷蝦和大豆油為原料，利用內(nèi)源酶的降解作用提取蝦青素，提取獲得的蝦油中蝦青素含量為44.24 mg/kg。

3.1.3 超臨界CO2萃取法 超臨界CO2萃取技術(shù)避免了有機(jī)溶劑法存在的萃取后溶劑分離的問(wèn)題。同時(shí)由于其具有低黏度、高擴(kuò)散系數(shù)等優(yōu)異特性，能夠更好地從固體樣品中進(jìn)行提取且在較低溫度下進(jìn)行，能夠有效防止熱敏性物質(zhì)的降解損失。但超臨界CO2萃取法相比有機(jī)溶劑萃取法需要更高端且耐高壓的設(shè)備，投資較大。

翁婷等[27]以凍干的南極磷蝦為原料，采用超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦青素，結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定樣品中蝦青素的含量，最佳提取條件下蝦青素提取率為84.41%±0.57%。Ali-Nehari等[28]比較了不同壓力和溫度條件下，超臨界CO2與正己烷萃取蝦青素得率的差異，結(jié)果表明，超臨界CO2萃取蝦青素的最高產(chǎn)量為(86.2±3.1)μg/g，正己烷萃取蝦青素的產(chǎn)量為(103.2±1.3)μg/g。雖然超臨界CO2萃取蝦青素的產(chǎn)量略低，但不存在正己烷后續(xù)回收及回收不徹底引起的問(wèn)題。

3.1.4 其他方法 Sun等[29]以冷凍南極磷蝦為原料，采用可交換親水性溶劑提取南極磷蝦油，試驗(yàn)條件下南極磷蝦蝦青素最高提取率達(dá)到81.44%。

3.2 南極磷蝦蝦青素純化方法

初步提取獲得的南極磷蝦蝦青素通常含有低極性脂質(zhì)、糖脂、有機(jī)酸/堿或無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)，影響蝦青素的色澤、穩(wěn)定性和應(yīng)用，還需要進(jìn)一步純化。目前，常用的蝦青素純化方法主要有薄層層析法、柱層析法和高效液相色譜法等[8,30]。

3.2.1 薄層層析法 薄層層析法是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動(dòng)相，定性/定量樣品的一種層析技術(shù)。在蝦青素分離過(guò)程中，通常以硅膠和氧化鋁作為固定相，以石油醚、正己烷及丙酮等作為展開(kāi)劑，實(shí)現(xiàn)游離蝦青素和蝦青素單、雙酯的快速分離。

叢心緣[31]考察了11種展開(kāi)劑體系對(duì)蝦青素的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正己烷、丙酮、乙酸的體積比為8∶2∶0.2時(shí)，分離獲得的蝦青素雙酯、單酯及游離蝦青素比移值(retention factor value, Rf)分別為0.86、0.70、0.47。Yamaguchi等[32]利用薄層色譜法測(cè)定了南極磷蝦蝦青素的相對(duì)含量，但沒(méi)有介紹不同形態(tài)蝦青素含量的準(zhǔn)確含量。

3.2.2 柱層析法 柱層析技術(shù)又稱為柱色譜技術(shù)，根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)的不同，可實(shí)現(xiàn)不同組分的分離。由于蝦青素屬于弱極性化合物，與脂肪酸結(jié)合的蝦青素酯極性更小。因此，采用硅膠為固定相，以石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮作為洗脫體系，可實(shí)現(xiàn)極性相差較大的游離蝦青素、蝦青素單酯和雙酯的分離。反相-高效液相色譜法(RP-HPLC)已經(jīng)成為蝦青素類化合物和類胡蘿卜素分離必須使用的方法之一。目前，常以C18柱或C30柱作為固定相，由于蝦青素和蝦青素酯是一系列極性相近的疏水性化合物，因此，疏水性較強(qiáng)的C30柱更能與蝦青素類化合物有較強(qiáng)的相互作用，分離蝦青素酯效果更好。流動(dòng)相常為甲醇-乙腈體系、甲醇-叔丁基甲醚體系等，需要時(shí)常加少量的酸或堿改善峰的對(duì)稱性。

張莎莎[33]利用硅膠柱層析以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑分離南極磷蝦蝦青素單酯，提取率為38.14%，采用高效液相薄層色譜獲得了純度較高的蝦青素。但該方法只能分別制備蝦青素單酯或蝦青素雙酯，無(wú)法一次完成不同形態(tài)蝦青素的分離。宋素梅[21]發(fā)現(xiàn)，大孔吸附樹(shù)脂AB-8對(duì)蝦青素的最大吸附量為476.2 μg/g干樹(shù)脂，乙酸乙酯對(duì)蝦青素的解吸率為98.7%，并得到動(dòng)態(tài)吸附條件為蝦青素上樣質(zhì)量濃度2 μg/mL、上柱速率4 BV/h，優(yōu)化條件后，皂化液中蝦青素的回收率為78.9%，純度為92.4%；采用硅膠柱進(jìn)一步純化蝦青素，回收率為92.9%，純度為97.1%。因此，通過(guò)皂化反應(yīng)將蝦青素酯轉(zhuǎn)化為游離蝦青素，是分離純化蝦青素、提高最終蝦青素產(chǎn)品得率的重要手段。為了減少皂化過(guò)程中蝦青素的降解損失，姜啟興等[34]以南極磷蝦蝦殼為原料，以游離蝦青素含量為指標(biāo)，研究了南極磷蝦蝦殼中蝦青素酯的皂化條件，結(jié)果表明，最適皂化條件為粗提液濃度0.1 g/mL、皂化溫度5 ℃、堿濃度0.02 mol/L、皂化時(shí)間12 h，在最適條件下游離蝦青素質(zhì)量濃度為55.75 μg/mL。談俊曉[25]通過(guò)優(yōu)化確定了南極磷蝦蝦青素的皂化條件為NaOH-乙醇溶液濃度0.010 mol/L、皂化時(shí)間18 h，確定溶劑體系為正庚烷-丙酮-乙醇-水(體積比為5∶4∶6∶5)，其固定相保留率為60.15%，在此條件下南極磷蝦蝦青素提取率為8.04%，純度為98.12%。

綜上所述，南極磷蝦蝦青素的提取方法與南極磷蝦油脂的提取方法在基本原理和技術(shù)路線方面都比較相近。現(xiàn)有的有機(jī)溶劑提取法存在溶劑殘留問(wèn)題，超臨界CO2提取法、薄層色譜法和高效液相色譜法僅適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。因此，蝦青素制備方法還需要進(jìn)一步優(yōu)化和創(chuàng)新，亟待開(kāi)發(fā)能夠?qū)崿F(xiàn)蝦青素規(guī)?；a(chǎn)、分離效果好、產(chǎn)品純度高的制備方法。未來(lái)，南極磷蝦蝦青素的規(guī)?；苽淇梢耘c南極磷蝦油脂的工業(yè)化制備技術(shù)相結(jié)合而開(kāi)展。

4 南極磷蝦蝦青素的結(jié)構(gòu)特征

南極磷蝦蝦青素的結(jié)構(gòu)特征是決定其生物特性的基礎(chǔ)。研究表明，南極磷蝦蝦青素主要是以酯的形式存在，其中蝦青素單酯占25%～35%，雙酯占55%～64%[33,35-36]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦蝦青素為全反式結(jié)構(gòu)，以3種立體異構(gòu)體形式存在，(3S,3′S)、(3R, 3′S)及(3R,3′R)3種立體異構(gòu)體所占比例分別為10%～20%、10%～20%、60%～70%[13]。叢心緣[31]采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(HPLC-HRMS)，定性、定量研究了3種形態(tài)的南極磷蝦蝦青素，共鑒定出27種蝦青素酯，其中，含量較高的蝦青素雙酯是Asta-C14:0/C16:0、Asta-C14:0/C14:0、Asta-C16:0/C16:0，含量較高的蝦青素單酯是Asta-C14:0、Asta-C16:0和Asta-C18:1。張莎莎[33]首次報(bào)道采用高效液相薄層色譜制備獲得(3R,3′R)南極磷蝦蝦青素和(3R,3′R)南極磷蝦蝦青素單酯；采用高效液相色譜檢測(cè)并證實(shí)蝦青素單酯中僅含一種(3R,3′R)蝦青素異構(gòu)體；采用GC-MS確定南極磷蝦蝦青素單酯中含12種脂肪酸。黃萌[37]采用液質(zhì)聯(lián)用分析游離南極磷蝦蝦青素樣品，確定其相對(duì)分子質(zhì)量為596.3，純度為99.36%，這與天然蝦青素的相對(duì)分子質(zhì)量(596.86)相符，與蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的紫外最大吸收波長(zhǎng)(476 nm)也相符，故確定目標(biāo)產(chǎn)物為游離南極磷蝦蝦青素。周慶新等[38]利用高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)分析了采用60%正己烷-乙醇提取所得南極磷蝦油中蝦青素分子種組成。其中，酯化態(tài)蝦青素約占蝦青素總量的98.38%，游離態(tài)蝦青素約占1.62%；鑒定出蝦青素雙酯12種，總體相對(duì)含量達(dá)73.5%，超過(guò)蝦青素單酯及游離態(tài)蝦青素相對(duì)含量；鑒定出蝦青素單酯5種，相對(duì)含量為24.88%。Lambertsen等[39]采用柱層析和薄層色譜法相結(jié)合分析南極磷蝦蝦青素雙酯、單酯和游離態(tài)蝦青素的相對(duì)含量分別為51%、43%和6%,其中酯化態(tài)蝦青素的相對(duì)百分含量約為94%。然而，由于當(dāng)時(shí)條件限制等因素，Takaichi等[35]采用場(chǎng)解吸質(zhì)譜法(field desorption mass spectrometry, FD-MS)在南極磷蝦酯中僅發(fā)現(xiàn)了5種脂肪酸(C12:0、C14:0、C16:0、C16:1和C18:1)。

目前，盡管已有一些學(xué)者對(duì)南極磷蝦蝦青素結(jié)構(gòu)特征開(kāi)展了相關(guān)研究，但是這些信息還缺乏系統(tǒng)性的分析和總結(jié)，還需要開(kāi)展更多的深入研究，以全面、系統(tǒng)地闡明南極磷蝦蝦青素的結(jié)構(gòu)特征。

5 南極磷蝦蝦青素的生物活性

南極磷蝦蝦青素的生物活性是其結(jié)構(gòu)特征的反映。蝦青素進(jìn)入人體后能否發(fā)揮生物活性的關(guān)鍵因素是其吸收利用或儲(chǔ)存在人體的比例，其利用率主要受分子結(jié)構(gòu)、食物中的物理結(jié)合方式、膳食中脂肪含量，以及胃腸道中胰酶和膽鹽含量等因素影響[40]。蝦青素在體內(nèi)通過(guò)淋巴系統(tǒng)輸送到肝臟，與膽汁酸混合，在小腸內(nèi)形成膠束，膠束被腸黏膜細(xì)胞部分吸收，將蝦青素整合到乳糜中，而含有蝦青素的乳糜在全身循環(huán)中釋放進(jìn)入淋巴后，被脂蛋白脂肪酶消化，乳糜殘余物被肝臟和其他組織迅速清除。蝦青素的吸收取決于與其一起攝入的食物成分(如脂質(zhì)的含量和種類)，高脂飲食可以增加蝦青素的吸收，低脂飲食則減少其吸收。叢心緣[31]開(kāi)展的D-半乳糖致衰老小鼠抗衰老試驗(yàn)結(jié)果表明，南極磷蝦蝦青素的抗氧化活性優(yōu)于合成蝦青素。目前，關(guān)于南極磷蝦蝦青素在體內(nèi)消化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝過(guò)程的研究還較少，針對(duì)不同分子結(jié)構(gòu)的蝦青素在生物體內(nèi)的消化吸收過(guò)程及其作用機(jī)制研究則更是鮮見(jiàn)報(bào)道，今后應(yīng)開(kāi)展更多的深入研究。

6 南極磷蝦蝦青素的定量和定性檢測(cè)

蝦青素主要以游離和酯化的形式存在，游離蝦青素只需要充分提取檢測(cè)各異構(gòu)體含量或者總量即可,而蝦青素酯則需要先將其皂化或酶解成游離蝦青素再進(jìn)行檢測(cè)。南極磷蝦蝦青素主要以酯的形式存在,蝦青素檢測(cè)方法是開(kāi)展南極磷蝦蝦青素定性和定量研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，蝦青素檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法(UV)、薄層色譜法(TLC)、激光拉曼光譜法、高效液相色譜法(HPLC)和高效液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)等[41]。

6.1 紫外-可見(jiàn)分光光度法

紫外-可見(jiàn)分光光度法是在190～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測(cè)定的方法。由于蝦青素類化合物在可見(jiàn)光區(qū)域內(nèi)具有特征吸收，因此，可以采用UV 法定量檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)單快速、適用范圍廣、成本低，但也存在一定的缺點(diǎn)。采用分光光度法測(cè)定的蝦青素含量要比高效液相色譜法偏高，原因是除了蝦青素之外，其他類胡蘿卜素如葉黃素、角黃素和β-胡蘿卜素也可能被認(rèn)為是蝦青素，甚至葉綠素和一些蝦青素降解產(chǎn)物也被誤包含在蝦青素中。

6.2 薄層色譜法

薄層色譜法不僅可以用來(lái)分離純化蝦青素類化合物，還可以結(jié)合掃描分析來(lái)定量蝦青素。黃萌[37]采用高效薄層色譜法測(cè)定南極磷蝦油中蝦青素含量，該研究中采用高性能硅膠作為固定相，以正己烷-丙酮(體積比為7∶2)為流動(dòng)相，可以實(shí)現(xiàn)10 min內(nèi)完成分離，并結(jié)合TLC掃描儀分析光密度，蝦青素回收率為98.53%。

6.3 高效液相色譜法

目前，蝦青素的定量多采用高效液相色譜法，利用C18/C30柱，以甲醇/水或甲醇/乙腈體系為流動(dòng)相，利用外標(biāo)法定量蝦青素含量。孫偉紅等[42]首先將樣品經(jīng)無(wú)水MgSO4去除水分，以丙酮作為提取溶劑，提取液中加入N-丙基乙二胺填料分散固相萃取凈化，經(jīng)NaOH-甲醇溶液皂化后，以YMC-Carotenoid C30為色譜柱，紫外檢測(cè)器測(cè)定表明，南極磷蝦和蝦粉中蝦青素的定量限分別為2.5、5 mg/kg；在0.1～10 mg/L時(shí)，全反式蝦青素的線性關(guān)系良好(r2>0.999)；該方法的加標(biāo)回收率為77.9%～91.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.42%～8.75%。孫來(lái)娣[24]以南極磷蝦油為原料，先采用固相萃取小柱預(yù)分離凈化，經(jīng)NaOH-甲醇溶液皂化，利用YMC-Carotenoid C30色譜柱分離獲得3種蝦青素同分異構(gòu)體，該方法的加標(biāo)回收率為86.1%～94.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.79%～1.91%。

6.4 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法結(jié)合了液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的高特異性檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。叢心緣等[31]建立了南極磷蝦中游離蝦青素及蝦青素酯的高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析方法，利用該方法在南極磷蝦中鑒定出9種蝦青素單酯和18種蝦青素雙酯，并利用峰面積法對(duì)其進(jìn)行了定量。

6.5 不同檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

綜上所述，南極磷蝦及其制品中蝦青素的常用檢測(cè)方法如分光光度法[24]、液相色譜法[43-44]、液相色譜-質(zhì)譜法[35]和核磁共振波譜法[45]等各有優(yōu)缺點(diǎn)。分光光度法是較常用的蝦青素檢測(cè)方法，但該法在測(cè)定過(guò)程中容易受到干擾，難以精確定量；液相色譜法是蝦青素檢測(cè)的主要方法，但存在著蝦青素酯難以有效分離、標(biāo)準(zhǔn)品缺少、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，檢測(cè)過(guò)程中如果溫度和堿濃度偏高容易引起蝦青素的異構(gòu)化和損失，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確；液相色譜-質(zhì)譜法能夠用于南極磷蝦蝦青素酯及脂肪酸的結(jié)構(gòu)鑒定，實(shí)現(xiàn)蝦青素多種幾何異構(gòu)體的分離，但對(duì)人員和設(shè)備要求比較高；核磁共振法能夠?qū)崿F(xiàn)蝦青素異構(gòu)體和蝦青素酯的結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析，但儀器較貴，維護(hù)成本較高。

6.6 蝦青素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

目前，蝦青素檢測(cè)的方法主要依據(jù)2個(gè)國(guó)標(biāo)、3個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和1個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)[41]。1)國(guó)標(biāo)GB/T 23745—2009。該標(biāo)準(zhǔn)主要用于檢測(cè)飼料添加劑中蝦青素含量，采用分光光度計(jì)比色法。2)國(guó)標(biāo)GB/T 31520—2015。該標(biāo)準(zhǔn)主要用于檢測(cè)紅球藻中蝦青素含量，采用HPLC方法。3)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) SC/T 3053—2019。該標(biāo)準(zhǔn)主要用于檢測(cè)水產(chǎn)品及其制品中蝦青素含量，采用高效液相色譜法。4)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2327—2009。該標(biāo)準(zhǔn)主要用于檢測(cè)進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中角黃素、蝦青素的含量。5)中國(guó)醫(yī)藥保健品進(jìn)出口商會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CCCMHPIE1.21—2016，該標(biāo)準(zhǔn)源于美國(guó)藥典。6)地方標(biāo)準(zhǔn)DB23/T 1275—2008。該標(biāo)準(zhǔn)主要用于飼料中蝦青素含量的測(cè)定，采用高效液相色譜法。未來(lái)應(yīng)針對(duì)南極磷蝦蝦青素的結(jié)構(gòu)和理化特性，建立南極磷蝦蝦青素含量檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)。

7 南極磷蝦蝦青素的穩(wěn)定性

蝦青素的穩(wěn)定性因其含有長(zhǎng)共軛不飽和雙鍵而易受光、熱、酸、堿、氧及金屬離子等影響發(fā)生異構(gòu)化和降解，因此，蝦青素的穩(wěn)定性是蝦青素應(yīng)用并發(fā)揮其活性的重要前提。宋素梅[21]研究發(fā)現(xiàn),南極磷蝦蝦青素在光照條件下很不穩(wěn)定；隨著溫度的升高，蝦青素?fù)p失加快，當(dāng)溫度在60～90 ℃范圍時(shí)，降解加劇；堿濃度較低時(shí)蝦青素比較穩(wěn)定，酸濃度或堿濃度的波動(dòng)都會(huì)引起蝦青素的損失；鈉、鉀、鎂、鈣、鋅和鋁離子對(duì)蝦青素基本沒(méi)有影響，但銅、亞鐵和鐵離子對(duì)蝦青素有明顯的破壞作用。為了減緩蝦青素的氧化速度，提高蝦青素的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，趙永強(qiáng)等[46]以麥芽糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)為壁材，采用噴霧干燥法對(duì)南極磷蝦蝦青素進(jìn)行微膠囊化包埋。結(jié)果表明，當(dāng)麥芽糊精與HP-β-CD 壁材質(zhì)量比為1∶3、蝦青素添加量4.76%、聚山梨酯-80 添加量0.87%、固形物含量0.20 g/mL時(shí)，蝦青素微膠囊包埋率為98.77%,制備獲得的蝦青素微膠囊水分含量為3.11%±0.11%，溶解度為94.32%±0.08%;穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，微膠囊化蝦青素在高溫、自然光、有氧條件下，蝦青素的保留率分別從28.72%、45.27%、20.76%提高到了78.32%、84.88%和74.97%。這表明，微膠囊化能夠明顯改善南極磷蝦蝦青素的溶解性和穩(wěn)定性。張曉燕[23]采用納米包載技術(shù)包埋蝦青素，發(fā)現(xiàn)蝦青素納米乳的粒徑變大，TEM觀察形態(tài)呈球形并且分布均勻，但包封率卻降低;穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，與游離蝦青素相比，蝦青素通過(guò)納米包埋后不容易異構(gòu)降解。

抗氧化試驗(yàn)表明，蝦青素經(jīng)過(guò)包埋后能夠長(zhǎng)期維持蝦青素的抗氧化活性。于曉[22]確定了南極磷蝦蝦青素的貯藏條件為4 ℃或-20 ℃，避光保存，避免接觸金屬介質(zhì)或金屬鹽溶液(中性)。宋玉昆[47]比較了全脂型、甘油三酯型和磷脂型蝦油蝦青素在不同氣體條件(有氧、無(wú)氧)，不同溫度條件(-20、5、25 ℃)貯藏的降解情況。結(jié)果表明，相同的貯藏條件下，磷脂型蝦油中蝦青素的降解速率最快；貯藏溫度越高，蝦青素的降解速率越快；在氧氣貯藏條件下，蝦青素的降解速率快于氮?dú)赓A藏；南極磷蝦蝦青素的降解符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，該作者認(rèn)為，阿倫尼烏斯公式能夠較好地解釋蝦青素酯皂化反應(yīng)數(shù)率常數(shù)的變化規(guī)律。因此，微膠囊化能夠明顯改善南極磷蝦蝦青素對(duì)光、熱和氧的敏感性。綜上所述，南極磷蝦蝦青素應(yīng)當(dāng)在低溫、避光、密封條件下保存；有氧狀態(tài)時(shí)，添加α-生育酚對(duì)蝦青素微膠囊的穩(wěn)定性有不利作用。Bustos等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在前25 d微膠囊化對(duì)南極磷蝦游離蝦青素和蝦青素單酯穩(wěn)定性的影響下發(fā)揮了積極作用；但是，蝦油溶液中的蝦青素雙酯穩(wěn)定性較微膠囊化的蝦青素更好。然而，25 d后這種情況發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。為了更好地維持南極磷蝦蝦青素的穩(wěn)定性，有效提高南極磷蝦蝦青素的水溶性和生物利用度，實(shí)現(xiàn)靶向釋放和定點(diǎn)釋放。今后還應(yīng)開(kāi)展更多的蝦青素脂溶性制劑、包合物、微膠囊和納米制劑等穩(wěn)態(tài)化保持技術(shù)的研究。

8 存在問(wèn)題及展望

8.1 南極磷蝦蝦青素研究中存在的問(wèn)題

南極磷蝦蝦青素因其天然來(lái)源的屬性、巨大的生物資源量、良好的功能特性受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)，盡管南極磷蝦蝦青素研究已取得了一定進(jìn)展，但整體上與雨生紅球藻等來(lái)源蝦青素研究相比還有一定差距，主要存在以下問(wèn)題：1)南極磷蝦蝦青素作用機(jī)制尚不明確，新功能/新活性有待深入發(fā)掘；2)制備技術(shù)仍以傳統(tǒng)方法為主，產(chǎn)品得率較低，專用性檢測(cè)方法亟待開(kāi)發(fā)；3)蝦青素穩(wěn)定性及有效載體相關(guān)研究薄弱等。

8.2 未來(lái)重點(diǎn)研究方向

針對(duì)上述問(wèn)題，建議未來(lái)應(yīng)在以下幾方面重點(diǎn)開(kāi)展研究。

1)機(jī)理研究。深入闡明南極磷蝦蝦青素的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及代謝機(jī)理，發(fā)掘其特有的功能特性及作用機(jī)制，揭示南極磷蝦蝦青素及其異構(gòu)體的體內(nèi)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、選擇、代謝路徑，豐富和完善南極磷蝦蝦青素安全性評(píng)價(jià)，尤其是穿透血-腦、血-視網(wǎng)膜屏障的生理機(jī)制，闡明其功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2)關(guān)鍵技術(shù)。開(kāi)發(fā)南極磷蝦蝦青素的溫和、綠色、環(huán)境友好型制備關(guān)鍵技術(shù)，研究替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿法等制備技術(shù)；研發(fā)高效、精準(zhǔn)的蝦青素異構(gòu)體分離分析技術(shù)；積極引入微波、超聲和磁等新型技術(shù)，提高南極磷蝦蝦青素規(guī)?；苽湫屎途珳?zhǔn)獲得目標(biāo)產(chǎn)物的能力，開(kāi)發(fā)適宜于商業(yè)化開(kāi)發(fā)的技術(shù)體系。

3)應(yīng)用研發(fā)?；谀蠘O磷蝦蝦青素的結(jié)構(gòu)特征和理化特性，開(kāi)展南極磷蝦蝦青素在復(fù)雜應(yīng)用體系生物活性、穩(wěn)態(tài)化保持和生物利用度技術(shù)；優(yōu)選蝦青素有效載體，有效解決南極磷蝦蝦青素的穩(wěn)定性、靶向性及緩釋性能的瓶頸問(wèn)題；積極拓展南極磷蝦蝦青素在食品、飼料、營(yíng)養(yǎng)品、化妝品和藥品等領(lǐng)域的利用。

總之，重點(diǎn)為獲得高穩(wěn)定性和高生物利用度南極磷蝦蝦青素構(gòu)型及異構(gòu)體和穩(wěn)態(tài)化產(chǎn)品的設(shè)計(jì)提供依據(jù)，為南極磷蝦蝦青素的高值化利用提供新的策略和方案，拓展南極磷蝦蝦青素的應(yīng)用領(lǐng)域和范圍，更好地造福人類。