水生動(dòng)物病原藥敏實(shí)驗(yàn)解析

○楊移斌

隨著養(yǎng)殖戶對(duì)高產(chǎn)、高效的追求，水生動(dòng)物養(yǎng)殖密度日益提高，養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化。水生動(dòng)物疾病頻發(fā)，這些疾病中或多或少都有病原生物的參與。因此，在養(yǎng)殖動(dòng)物病害防控進(jìn)行相關(guān)藥敏實(shí)驗(yàn)是必要的，但在養(yǎng)殖生產(chǎn)中推廣藥敏實(shí)驗(yàn)也遇到了一些問(wèn)題。本文就水生動(dòng)物病原藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)行闡述，以期與同行交流。

1 何為藥敏實(shí)驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)是離體抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)的簡(jiǎn)稱，又稱藥物敏感性試驗(yàn)，是指在離體條件下，測(cè)定藥物抑制或殺滅致病微生物能力的試驗(yàn)。藥物敏感性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)（稱藥敏實(shí)驗(yàn)，）涉及到病原體及藥物兩方面，因此病原體必須是可體外培養(yǎng)的，可分離的，而藥物目前常用抗生素都有市售藥敏紙片供選擇，而針對(duì)其他藥物如消毒劑等，則可進(jìn)行相應(yīng)的MIC（最小抑菌濃度）/MBC（最小殺菌濃度）測(cè)定，從而評(píng)估病原體對(duì)其敏感性。目前可以進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)的病原只有細(xì)菌、真菌以及一些寄生蟲（寄生蟲的藥敏實(shí)驗(yàn)主要以活蟲體在藥物刺激下掙扎程度來(lái)反應(yīng)的）。

2 藥敏實(shí)驗(yàn)方法

目前藥敏實(shí)驗(yàn)主要分為瓊脂擴(kuò)散法（即K-B法）及倍比稀釋法，而瓊脂擴(kuò)散法又分為打孔法及藥敏紙片法。一般以藥敏紙片法及倍比稀釋法最常用。以細(xì)菌性病原為例，簡(jiǎn)介藥敏實(shí)驗(yàn)方法。

無(wú)菌條件下，取患瀕死水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，取病灶及重要組織器官如肝腎脾等，用接種環(huán)蘸取所取各樣品在固體培養(yǎng)基上劃線，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。從已經(jīng)長(zhǎng)好菌落的平板上挑取形態(tài)大小、顏色相近的菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)。向分離得到的純化菌株加入25%甘油，混勻后保存于-80℃冷凍保存。

藥敏紙片法：將分離株接種于液體培養(yǎng)基中，經(jīng)200r/min恒溫28℃震蕩培養(yǎng)18小時(shí)，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整分離株濃度為104-108CFU/mL，取100μL菌液均勻涂布于固體瓊脂培養(yǎng)基上，貼上不同種類的藥敏紙片，28℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后測(cè)量抑菌直徑，根據(jù)藥敏紙片說(shuō)明書者其他標(biāo)準(zhǔn)判定分離株對(duì)不同藥物的敏感性。

倍比稀釋法：主要是通過(guò)使用液體培養(yǎng)基倍比稀釋藥物，然后在每個(gè)濃度藥物內(nèi)接種病原，恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后，把無(wú)菌生長(zhǎng)、稀釋度最大的藥物如消毒劑濃度作為分離株的MIC，取所有無(wú)菌生長(zhǎng)的組涂布于固體培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)，平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物如消毒劑濃度即為MBC。

圖1 藥敏實(shí)驗(yàn)-K-B法

圖2 藥敏實(shí)驗(yàn)-倍比稀釋法

3 實(shí)際生產(chǎn)中可選用的藥敏實(shí)驗(yàn)方法

在實(shí)際生產(chǎn)中由于條件限制以及病情的緊迫性，使得藥敏實(shí)驗(yàn)不太可能像在實(shí)驗(yàn)室這么開(kāi)展，因此制定生產(chǎn)中藥敏實(shí)驗(yàn)方法顯得更加迫切，下面將就生產(chǎn)中可行的藥敏實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行詳細(xì)闡述。

首先針對(duì)發(fā)病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物進(jìn)行取樣，同樣是選擇具有典型癥狀瀕死的個(gè)體。在無(wú)菌條件下，取其病灶部位及重要組織器官。將所取樣品分別剪碎，溶解于無(wú)菌0.9%生理鹽水中，后涂布于固體平板上，或者接種含有不同濃度藥物試管中，其后操作同K-B或者倍比稀釋法，經(jīng)恒溫24小時(shí)培養(yǎng)后即可讀取結(jié)果。

4 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果解讀

倍比稀釋法得出的最小抑菌濃度及最小殺菌濃度即可作為用藥依據(jù)。K-B法結(jié)果得到的是抑菌圈的直徑大小，一般購(gòu)買的商品化藥敏紙片都有抑菌圈參考范圍，這抑菌圈參考范圍即是使用標(biāo)準(zhǔn)菌株得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，依據(jù)說(shuō)明書即可判定是否耐藥，根據(jù)結(jié)果也可作為用藥依據(jù)。在實(shí)際生產(chǎn)中，如果自制藥敏紙片，則需先用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得出參考范圍，如多大抑菌圈算敏感等，再以此為參考判定所分離菌株的藥物敏感性。絕對(duì)不可以統(tǒng)一確定一個(gè)數(shù)值作為判定標(biāo)準(zhǔn)，如確定10mm分標(biāo)準(zhǔn)，大于10mm為敏感，小于或等于為耐藥或者中度敏感，這是不合理的，因?yàn)椴煌幬镆志鷻C(jī)制是不一樣的。

5 藥敏實(shí)驗(yàn)的意義

對(duì)于漁藥生產(chǎn)企業(yè)而言，“藥敏實(shí)驗(yàn)室”除了能幫助企業(yè)把控漁藥原材料的質(zhì)量外，還能通過(guò)對(duì)所生產(chǎn)漁藥的應(yīng)用效果進(jìn)行試驗(yàn)研究，根據(jù)漁藥的實(shí)際用藥效果修訂其漁藥的使用說(shuō)明書內(nèi)容，確保漁藥的應(yīng)用效果，避免藥害事故發(fā)生。首先，在“藥敏實(shí)驗(yàn)室”根據(jù)漁藥的類型和功能，進(jìn)行藥效驗(yàn)證性試驗(yàn)。針對(duì)抗生素類漁藥除了在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)定其對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病菌的最小抑菌濃度（MIC）外，還需要完成在野外魚池中的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病治療試驗(yàn)；對(duì)于水產(chǎn)用消毒劑要完成測(cè)定其對(duì)水養(yǎng)殖水體中細(xì)菌或者水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病菌的殺菌效果；對(duì)水產(chǎn)用殺蟲劑測(cè)定對(duì)水生動(dòng)物寄生蟲的驅(qū)、殺蟲效果。其次，對(duì)于水產(chǎn)用消毒劑和殺蟲藥物，還需要完成水體環(huán)境因子（如水溫、pH等）對(duì)藥物效果影響的相關(guān)試驗(yàn)，準(zhǔn)確地掌握漁藥在不同水體環(huán)境因子存在時(shí)對(duì)漁藥使用效果的影響，這些試驗(yàn)內(nèi)容對(duì)于避免漁藥的用藥事故發(fā)生，都是至關(guān)重要的。

對(duì)于漁藥經(jīng)銷人員而言，可以利用“藥敏實(shí)驗(yàn)室”對(duì)所銷售漁藥完成水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病生物的抑菌、殺菌、殺蟲效果試驗(yàn)，幫助其準(zhǔn)確掌握所銷售漁藥的質(zhì)量與使用效果，科學(xué)地指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者使用所銷售的漁藥：首先，在“藥敏實(shí)驗(yàn)室”根據(jù)漁藥的類型和功能，進(jìn)行不同種類漁藥用藥效果的驗(yàn)證性試驗(yàn)。針對(duì)抗生素類漁藥主要是測(cè)定其對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病菌的最小抑菌濃度（MIC），對(duì)于水產(chǎn)用消毒劑主要是測(cè)定其對(duì)水養(yǎng)殖水體中細(xì)菌或者水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病菌的殺菌效果，而對(duì)于水產(chǎn)用殺蟲劑測(cè)定對(duì)水生動(dòng)物寄生蟲的驅(qū)、殺蟲效果。其次，根據(jù)在“藥敏實(shí)驗(yàn)室”完成的藥物效果試驗(yàn)結(jié)果，準(zhǔn)確地掌握所銷售的漁藥質(zhì)量與使用效果，做到對(duì)漁藥質(zhì)量和使用效果的心中有數(shù)。其三，根據(jù)在“藥敏實(shí)驗(yàn)室”獲得的漁藥藥效試驗(yàn)結(jié)果，指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者科學(xué)、合理地使用各種漁藥，以提高漁藥使用效果，實(shí)現(xiàn)科學(xué)用藥并能達(dá)成農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提倡的“減量用藥”的目標(biāo)。

對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者而言，“藥敏實(shí)驗(yàn)室”可以幫助解決在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病防控中的一些問(wèn)題：首先，“藥敏實(shí)驗(yàn)室”可以通過(guò)分離、鑒定病原生物，幫助水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者解決水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病正確診斷的問(wèn)題。其次，“藥敏實(shí)驗(yàn)室”可以通過(guò)市售漁藥對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病生物的抑菌、殺菌、殺蟲效果試驗(yàn)，幫助水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者將解決從漁藥市場(chǎng)上正確選擇、購(gòu)買漁藥的問(wèn)題。其三，“藥敏實(shí)驗(yàn)室”可以通過(guò)測(cè)定漁藥對(duì)致病生物的最小抑、殺菌濃度試驗(yàn)，幫助水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者解決無(wú)法準(zhǔn)確確定漁藥使用劑量的問(wèn)題（引自陳昌福教授，闡述的很完美）。

6 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果不等于臨床防控效果

使用抗生素應(yīng)以細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，但臨床對(duì)此往往并不重視，原因是細(xì)菌的藥敏結(jié)果與臨床藥效出入較大，有時(shí)甚至出現(xiàn)用敏感藥無(wú)效，而用不敏感藥有效的情況。究其原因很復(fù)雜，主要有如下幾個(gè)方面:

6.1 體內(nèi)外環(huán)境不同

體外藥敏試驗(yàn)和體內(nèi)藥物療效確實(shí)有差異，主要是因?yàn)轶w外和體內(nèi)的環(huán)境不同，有些細(xì)菌可以利用體內(nèi)的一些物質(zhì)生成抵抗抗生素的成分，使抗生素失效，導(dǎo)致出現(xiàn)體外敏感，而體內(nèi)耐藥的情況。更重要一點(diǎn)即是體外，病原微生物直接跟藥物接觸，而體內(nèi)，藥物跟病原微生物接觸需要經(jīng)過(guò)用藥、吸收、運(yùn)載及達(dá)峰等一系列步驟，每一步都會(huì)對(duì)藥效產(chǎn)生很大的影響。

6.2 細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生

一些細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。例如產(chǎn)超廣譜B2內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌和克雷伯菌對(duì)頭孢菌素及氨曲南，沙門氏、志賀氏菌對(duì)第1、2代頭孢菌素及氨基糖苷類藥物的體外藥敏試驗(yàn)有時(shí)可能呈敏感，但臨床治療是無(wú)效的，報(bào)告藥敏結(jié)果時(shí)需要對(duì)此類結(jié)果進(jìn)行修正和說(shuō)明。

6.3 致病菌判斷不準(zhǔn)確或未檢出

致病菌判斷不正確，或者沒(méi)有檢出，我們認(rèn)為這才是最可能原因。首先，一般醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室做細(xì)菌培養(yǎng)僅限于需氧非苛養(yǎng)菌的檢測(cè)，而對(duì)于厭氧菌、L型細(xì)菌以及一些對(duì)氧或營(yíng)養(yǎng)有特殊要求的細(xì)菌都不能培養(yǎng)出來(lái)，如果這類細(xì)菌才是病原菌的話，當(dāng)然有問(wèn)題了。致病菌的判定是個(gè)難題，需要檢驗(yàn)者具備較豐富的經(jīng)驗(yàn)，致病菌判斷錯(cuò)誤，藥敏與藥效不符也就難免了。還有很多細(xì)菌可能都是致死或者產(chǎn)生癥狀，但根源可能是非生物因素，這樣可能會(huì)導(dǎo)致疾病反復(fù)暴發(fā)。

6.4 藥敏試驗(yàn)方法選擇錯(cuò)誤導(dǎo)致藥敏結(jié)果不正確

例如，非腸桿菌科革蘭氏陰性桿菌除銅綠假單胞菌和不動(dòng)桿菌可做紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)外，假單胞菌屬其它細(xì)菌、嗜麥芽窄食單胞菌和其它苛養(yǎng)不發(fā)酵葡萄糖的革蘭氏陰性桿菌的藥敏試驗(yàn)均需用稀釋法。

6.5 藥敏紙片或藥物濃度變化或失效，造成假耐藥情況

這主要是試劑質(zhì)量問(wèn)題，最容易出問(wèn)題的是氨芐西林、替卡西林、哌拉西林紙片和亞胺硫霉素水劑，還有就是自制藥敏紙片質(zhì)量問(wèn)題，如含量差異。

6.6 藥敏實(shí)驗(yàn)操作誤差

嚴(yán)格按要求做藥敏試驗(yàn)也是很重要的，包括選用合格的平皿、瓊脂、培養(yǎng)基的厚度、菌液的濁度、孵育的溫度及時(shí)間等。

6.7 漁藥質(zhì)量不合格

漁藥本身質(zhì)量問(wèn)題，如購(gòu)買到假冒偽劣產(chǎn)品等；漁藥保存不當(dāng)，養(yǎng)殖戶經(jīng)常把漁用物資存放在養(yǎng)殖池塘旁邊，極易受潮變質(zhì)；漁藥購(gòu)買時(shí)間太久，導(dǎo)致過(guò)期等，而養(yǎng)殖戶又不舍得丟掉，總抱著僥幸心理使用，導(dǎo)致得不償失。

6.8 臨床用藥劑量很難把控

水生動(dòng)物用藥方式與陸生動(dòng)物絕然不同，水生動(dòng)物一般都是群體用藥，采取的是潑灑或者伴餌投喂等方式，其最大的缺點(diǎn)即是無(wú)法確保發(fā)病個(gè)體能獲得足夠藥物。臨床用藥時(shí)劑量的很不好掌握，依據(jù)藥物說(shuō)明書上的劑量，往往在使用過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)很大損耗，如拌料損耗、藥性失活等，而藥物進(jìn)入水環(huán)境，也會(huì)因?yàn)樗|(zhì)的原因有不同的損耗，就不用水質(zhì)溶解藥物的量不一樣的，這給用藥劑量的確定帶來(lái)了很大的困難，目前尚無(wú)此類研究來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。

6.9 藥物選擇、癥狀及使用對(duì)象不符

目前水生動(dòng)物養(yǎng)殖中批準(zhǔn)使用的抗菌藥物種類不多，但各種藥物也有其應(yīng)用的范圍，即應(yīng)對(duì)癥、對(duì)魚選用藥物。如腸道疾病如炎癥等，則應(yīng)選擇在腸道停留較長(zhǎng)的藥物如新霉素等，而治療全身性感染，則應(yīng)選擇吸收較好的氟苯尼考等。很多養(yǎng)殖對(duì)象對(duì)藥物的敏感性不用，藥物選擇不對(duì)不但不能致病，反而可能引起魚類死亡。

（通聯(lián)：430223，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所 電話：17771809619）