薛 飛,董傳瑩,田 莉,張春瑞

(鄭州澍青醫(yī)學高等專科學校臨床醫(yī)學系,鄭州 450000)

子宮內(nèi)膜癌是來源于子宮內(nèi)膜上皮細胞的惡性腫瘤,近年來,其發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升,約占女性生殖道惡性腫瘤的20%~30%,早期患者多為局限性病變,以手術(shù)治療為主,但因早期常忽略不規(guī)則陰道排液和流血現(xiàn)象,易失去早期診斷的機會,而晚期及復(fù)發(fā)性患者的治療以放化療為主的綜合性治療[1]。 蘆薈大黃素(aloe emodin,AE)是一種天然的蒽醌衍生物,可從蘆薈中提取,具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、神經(jīng)保護和肝保護等作用[2]。 研究發(fā)現(xiàn),AE 不但能夠誘導非小細胞肺癌的自噬和凋亡[3],還能通過激活人胰腺癌細胞凋亡和自噬相關(guān)通路,破壞癌細胞線粒體膜電位,具有明顯的抑癌作用[4]。 另有研究發(fā)現(xiàn)AE 通過上調(diào)miR-133 表達減輕心肌梗死和心肌細胞凋亡[5]。 而miRNAs 是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的長度約為19~25 個核苷酸的非編碼小RNA,在轉(zhuǎn)錄后基因的表達調(diào)控中起重要作用[6],其中,miR-30b 過表達可降低自噬相關(guān)標記基因的表達且直接靶向Beclin1 基因[7]。 而Beclin1 是第一個在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的與自噬相關(guān)的抑癌基因,是調(diào)控細胞自噬活性的關(guān)鍵靶點[8]。 但是,目前AE 調(diào)控miR-30b 對子宮內(nèi)膜癌細胞自噬的研究尚未見報道。 因此,本研究通過上調(diào)或抑制子宮內(nèi)膜癌細胞 HEC-1-B 中 miR-30b 表達,并使用 AE 培養(yǎng)該細胞,觀察其對細胞生長及自噬的影響,旨在揭示AE 調(diào)控miR-30b 促進HEC-1-B 癌細胞自噬的作用機制,為子宮內(nèi)膜癌的治療提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 細胞

人子宮內(nèi)膜腺癌細胞株 HEC-1-A(目錄號:TCHu149)、HEC-1-B(目錄號:TCHu115)、RL95-2(目錄號:TCHu198)均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫;人正常子宮內(nèi)膜上皮細胞株由南方醫(yī)科大學實驗室贈與。

1.2 主要試劑與儀器

AE(純度:HPLC≥98%,規(guī)格:每瓶 20 mg,貨號:SA8200)、BCA 蛋白定量試劑盒(貨號:PC0020)和ECL 顯色試劑盒(貨號:SW2040)均購自北京索萊寶生物科技有限公司; 胰蛋白酶(貨號:27250018)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;貨號:16140071)和RPIM-1640 培養(yǎng)基(貨號:72400120)均購自美國Giboc 公司;細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8;貨號:CK04)購自上海復(fù)申生物科技有限公司;96 孔板(貨號:F600418)購自上海生工生物工程有限公司;RNA 提取試劑盒(貨號:DP431)購自北京天根生化科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:QP056)購自美國 Genecopoeia 公司;miR-30b、U6 引物以及 miR-30b 模擬物(miR-30b mimics)、miR-30b 模擬物陰性對照(miR-30b mimics NC)、miR-30b 抑制物(miR-30b inhibitor)、miR-30b抑制物陰性對照(miR-30b inhibitor NC)均由上海生工生物科技有限公司合成;蛋白 marker(貨號:B2787-1VL)、β-actin 鼠抗(貨號:AB1970-100UL)和PVDF 膜(貨號:3010040001)均購自美國 Sigma公司;AnnexinV-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:LHK601-020)購自嘉美生物技術(shù)有限公司;Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒(貨號:L3000015)購自美國 Invitrogen 公司; 單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)熒光檢測試劑盒(貨號:KFS305)購自北京百奧萊博科技有限公司;Beclin1 兔多克隆抗體(貨號:ab62557)、p62 兔單克隆抗體(貨號:ab211324)、LC3-II 和 LC3-I 兔單克隆抗體(貨號:ab221794)以及辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 二抗(貨號:ab150077)均購自美國Abcam公司;酶標儀Fax-20100 購自美國INStat 公司;尼康SMZ745 光學顯微鏡購自于上海普赫生物科技有限公司;FACSCanto 流式細胞儀購自美國Beckman 公司;徠卡倒置熒光顯微鏡DMILLED 購自上海成貫儀器有限公司; 全能型凝膠成像分析系統(tǒng)ChemiDoc-MP 購自山東三瑞科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

分別將各個細胞株接種于含10%胎牛血清的RPIM-1640 培養(yǎng)基中,放于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 d 用0.25%胰蛋白酶消化傳代,使細胞呈單層貼壁生長。

1.3.2 qRT-PCR 檢測正常子宮內(nèi)膜細胞和子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-30b 表達水平

使用RNA 提取試劑盒分別提取正常子宮內(nèi)膜細胞和子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1-A、HEC-1-B、RL95-2 細胞株的總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA 為模板,按照qRT-PCR 試劑盒說明書配置 PCR 反應(yīng)體系:2×SYBR mix 10 μL,H2O 8 μL,上下游引物各 0.5 μL,10×cDNA 模板 1 μL。 反應(yīng)條件設(shè)定為:94℃預(yù)變性5 min、94℃變性15 s、55℃退火 50 s、35 個循環(huán)、72℃延伸 10 min。 以 U6為內(nèi)參,根據(jù) 2-ΔΔCt算法,計算 miR-30b 表達水平。miR-30b 和U6 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.3.3 細胞轉(zhuǎn)染與分組

HEC-1-B 癌細胞隨機分為HEC-1-B 癌細胞組(正常培養(yǎng),未轉(zhuǎn)染)、miR-30b inhibitor NC 組(正常培養(yǎng),轉(zhuǎn)染miR-30b inhibitor NC)、miR-30b inhibitor(正常培養(yǎng),轉(zhuǎn)染 miR-30b inhibitor)以及 AE 組(含終濃度為 30 μmol/L AE 培養(yǎng)[9],未轉(zhuǎn)染)、AE+miR-30b mimics NC 組(含終濃度為 30 μmol/L AE 培養(yǎng),轉(zhuǎn)染 miR-30b mimics NC)、AE+miR-30b mimics 組(含終濃度為 30 μmol/L AE 培養(yǎng),轉(zhuǎn)染 miR-30b mimics),當HEC-1-B 癌細胞生長密度達50%~60%時,使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染細胞后分別進行正常培養(yǎng)或使用含終濃度為30 μmol/L AE 培養(yǎng),各組細胞繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后,檢測各項指標。

1.3.4 CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性

收集各組細胞,調(diào)整細胞濃度為每毫升1×105個,每孔接種100 μL 至96 孔板中,空白孔加入100 μL 培養(yǎng)基,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 使細胞貼壁,加入濃度為10%的CCK-8 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,于酶標儀上檢測各孔在450 nm 波長下的OD值。 每組各設(shè)6 個復(fù)孔。 細胞增殖率(%)= (實驗組OD450nm-空白組OD450nm)/(對照組OD450nm-空白組OD450nm)。

1.3.5 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率

收集轉(zhuǎn)染或培養(yǎng)24 h 后的各組細胞,1200 r/min 離心 5 min,棄上清,用 PBS 洗滌細胞2 次,加入400 μL 結(jié)合緩沖液懸浮細胞,再加入5 μL Annexin V 染液,輕輕混勻后于2℃~8℃下避光孵育15 min,然后加入10 μL PI 輕輕混勻,再次于2℃~8℃避光孵育5 min,上流式細胞儀檢測細胞凋亡率,每組重復(fù)6 次。

1.3.6 MDC 試劑盒檢測各組細胞自噬率

取轉(zhuǎn)染或培養(yǎng)24 h 后的各組細胞,每組設(shè)置6個復(fù)孔重復(fù),每孔取2 mL 細胞懸液,800 r/min 離心5 min,棄上清,1×Wash buffer 清洗細胞 1 次并重懸細胞,調(diào)整濃度為每毫升1×105個,各取90 μL 細胞懸液至新的EP 管中,加入10 μL MDC 染液,輕輕混勻,室溫避光孵育30 min,然后800 r/min 離心 5 min,棄上清,1×Wash buffer 清洗細胞 2 次后,加入100 μL collection buffer 重懸細胞滴加于載玻片上,蓋上蓋玻片,于熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長355 nm,阻斷波長512 nm)并計數(shù)MDC 陽性細胞(核周和胞漿出現(xiàn)高密度著色點),以MDC 陽性細胞率表示細胞自噬率。

1.3.7 Western blot 法檢測各組細胞中自噬相關(guān)蛋白表達水平

收集轉(zhuǎn)染或培養(yǎng)24 h 后的各組細胞,采用蛋白抽提試劑盒提取各組細胞總蛋白,使用BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量,依次進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn) PVDF 膜、5%脫脂奶粉封閉、1 ∶2000濃度稀釋后的 Beclin1、p62、LC3-II 和 LC3-I 一抗4℃過夜孵育、置于含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1 ∶5000)中室溫孵育 2 h、洗膜,用 ECL 試劑盒顯色,全能型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照,以β-actin 為內(nèi)參,分析各組蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

本研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以平均數(shù)±標準差()表示,使用GraphPad Prism7.0 軟件繪制條形圖,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗;當P<0.05 時,代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-30b 在正常子宮內(nèi)膜細胞和不同子宮內(nèi)膜癌細胞株中的表達

與人正常子宮內(nèi)膜上皮細胞(1.00±0.00)相比,HEC-1-A、HEC-1-B 和 RL95-2 癌細胞中 miR-30b表達水平分別為(1.87±0.19)、(2.14±0.22)、(1.69±0.17)均顯著升高(P< 0.05)。 其中 HEC-1-B 癌細胞中miR-30b 表達水平最高,所以后續(xù)將選擇HEC-1-B 癌細胞進行轉(zhuǎn)染實驗。

2.2 抑制miR-30b 對HEC-1-B 癌細胞增殖、凋亡及自噬的影響

與HEC-1-B 癌細胞組和miR-30b inhibitor NC組相比,miR-30b inhibitor 組癌細胞miR-30b 表達水平、細胞增殖率以及p62 蛋白表達水平顯著降低(P< 0.05),細胞凋亡率、自噬率以及Beclin1 蛋白表達水平和LC3-II/I 比值顯著升高(P< 0.05)。 見圖 1、圖 2。

圖1 各組癌細胞增殖、凋亡及自噬比較Note. A, Apoptosis detection chart. B, Autophagy body fluorescence diagram. C, Western blot analysis of autophagy related proteins.Figure 1 Comparison of proliferation, apoptosis and autophagy of cancer cells in each group

圖2 各組HEC-1-B 癌細胞增殖凋亡及自噬比較Note. A, Expression level of miR-30b and autophagy related proteins. B, Proliferation, apoptosis and MDC positive cell rate. Compared with HEC-1-B cancer cell group, #P < 0.05. Compared with miR-30b inhibitor NC group, △P < 0.05.Figure 2 Comparison of proliferation, apoptosis and autophagy of HEC-1-B cancer cells in each group

2.3 AE 對 HEC-1-B 癌細胞 miR-30b 表達水平的影響

與 HEC-1-B 癌細胞組(1.00±0.00)相比,AE 組(0.32±0.04)和 AE+miR-30b mimics NC 組(0.35±0.05)癌細胞中miR-30b 表達水平顯著降低(P<0.05);與 AE+miR-30b mimics NC 組相比,AE+miR-30b mimics 組(1.17±0.12)癌細胞中 miR-30b 表達水平顯著升高(n=6,P< 0.05)。

2.4 AE 對 HEC-1-B 癌細胞增殖活性和凋亡的影響

與HEC-1-B 癌細胞組相比,AE 組和AE+miR-30b mimics NC 組癌細胞增殖率顯著降低,細胞凋亡率顯著升高(P< 0.05);與AE+miR-30b mimics NC組相比,AE+miR-30b mimics 組癌細胞增殖率顯著升高,細胞凋亡率顯著降低(P< 0.05)。 見圖3、圖4。

圖3 各組細胞凋亡情況檢測結(jié)果Note. A, HEC-1-B cancer cell group. B, AE group. C, AE+miR-30b mimics NC group. D, AE+miR-30b mimics group.Figure 3 Detection results of apoptosis in each group.

圖4 各組HEC-1-B 癌細胞增殖率和凋亡率比較Note. Compared with HEC-1-B cancer cell group, #P < 0.05.Compared with AE+miR-30b mimics NC group, △P < 0.05.Figure 4 The ratio of proliferation rate and apoptosis rate of HEC-1-B cancer cells in each group

2.5 AE 對HEC-1-B 癌細胞自噬率的影響

與HEC-1-B 癌細胞組(2.26±0.29)%相比,AE組(24.57±2.51)%和 AE+miR-30b mimics NC 組(29.22±3.20)%癌細胞自噬率顯著升高(P<0.05);與 AE+miR-30b mimics NC 組相比,AE+miR-30b mimics 組(15.19±1.71)%癌細胞自噬率顯著降低(P< 0.05)。 見圖 5。

圖5 各組HEC-1-B 癌細胞自噬小體熒光圖Note. A, HEC-1-B cancer cell group. B, AE group. C, AE+miR-30b mimics NC group. D, AE+miR-30b mimics group.Figure 5 Fluorescence of autophagy bodies of HEC-1-B cancer cells in each group

2.6 AE 對HEC-1-B 癌細胞自噬相關(guān)蛋白表達水平的影響

與HEC-1-B 癌細胞組相比,AE 組和AE+miR-30b mimics NC 組癌細胞 Beclin1 蛋白表達水平和LC3-II/I 比值顯著升高,p62 蛋白表達水平顯著降低(P< 0.05)。 與 AE+miR-30b mimics NC 組相比,AE+miR-30b mimics 組癌細胞Beclin1 蛋白表達水平和LC3-II/I 比值顯著降低,p62 蛋白表達水平顯著升高(P< 0.05)。 見圖 6、圖 7。

圖6 各組HEC-1-B 癌細胞自噬相關(guān)蛋白表達Western blot 圖Note. A,HEC-1-B cancer cell group. B,AE group. C,AE+miR-30b mimics NC group. D, AE+miR-30b mimics group.Figure 6 Expression of autophagy related proteins in HEC-1-B cancer cells of each group by Western blot

圖7 各組HEC-1-B 癌細胞中Beclin1、p62 蛋白表達水平和LC3-II/I 比值比較Note. Compared with HEC-1-B cancer cell group, #P < 0.05.Compared with AE+miR-30b mimics NC group, △P < 0.05.Figure 7 Comparison of Beclin1 and p62 protein expression levels and LC3-II/I ratio in HEC-1-B cancer cells of each group

3 討論

子宮內(nèi)膜癌好發(fā)于圍絕經(jīng)期與絕經(jīng)后婦女,目前早期患者的5 年生存率可達80%~90%,但晚期患者預(yù)后較差,5 年生存率僅為5%,確切病因仍不清楚,臨床觀察發(fā)現(xiàn)可能與雌激素對子宮內(nèi)膜的長期持續(xù)刺激有關(guān),還可能與子宮內(nèi)膜增生、不育、晚絕經(jīng)、家族史等有關(guān)[10],其發(fā)病機制也較為復(fù)雜。因此探究子宮內(nèi)膜癌具體發(fā)病機制對其后期治療至關(guān)重要。 本研究發(fā)現(xiàn),與正常子宮內(nèi)膜上皮細胞相比,不同子宮內(nèi)膜癌細胞株HEC-1-A、HEC-1-B 和RL95-2 中 miR-30b 表達水平均顯著升高,其中HEC-1-B 癌細胞中miR-30b 表達水平最高。

AE 為大黃中有效抗菌成分,在多種人類癌細胞系中具有抗癌特性,包括抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲,誘導細胞周期阻滯和細胞死亡,調(diào)節(jié)免疫信號等[11]。 除本身具有的抗腫瘤作用外,還可提高腫瘤對放療、化療的敏感性[12]。 另外劉豪杰等[13]研究發(fā)現(xiàn),AE 可通過提高胃癌細胞自噬,誘導細胞凋亡,Gao 等[14]研究發(fā)現(xiàn)AE 可誘導宮頸癌細胞凋亡。 而誘導癌細胞自噬和凋亡可發(fā)揮抗子宮內(nèi)膜癌的作用[15]。 其中自噬蛋白Beclin1 表達水平及LC3-II/I 比值可用于反映自噬程度,而自噬溶酶體降解底物p62 表達的增加與自噬水平呈反相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn),AE 可顯著降低 HEC-1-B 癌細胞中miR-30b 表達水平、細胞增殖率以及p62 蛋白表達水平,顯著提高細胞凋亡率、自噬率以及Beclin1 蛋白表達水平和LC3-II/I 比值,提示AE 可能通過促進HEC-1-B 癌細胞自噬,進一步促進其凋亡,抑制其增殖,但是否調(diào)控miR-30b 尚需進一步研究。Li 等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-30b 可通過抑制自噬減輕肝缺血再灌注損傷。 miR-30b 還通過抑制耐順鉑胃癌細胞的自噬來消除肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1 誘導的順鉑耐藥性[18]。 本研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-30b 可顯著降低HEC-1-B 癌細胞中miR-30b 表達水平、細胞增殖率、以及p62 蛋白表達水平,顯著提高細胞凋亡率、自噬率以及Beclin1 蛋白表達水平和LC3-II/I 比值,提示抑制miR-30b 可能通過促進HEC-1-B 癌細胞自噬,進一步促進其凋亡。 而Bai 等[19]研究發(fā)現(xiàn)AE 不但可通過抑制miR-1 來緩解高脂飲食誘導的大鼠心電圖中Q 波和T 波時間延長,還可通過上調(diào)miR-15a,從而抑制凋亡相關(guān)基因Bcl-2 表達,誘導乳腺腫瘤細胞凋亡[20]。 本研究為進一步探究AE調(diào)控miR-30b 對HEC-1-B 癌細胞的影響,將HEC-1-B 癌細胞轉(zhuǎn)染 miR-30b mimics 后,使用 AE 處理,發(fā)現(xiàn)與AE+miR-30b mimics NC 組相比,AE+miR-30b mimics 組癌細胞miR-30b 表達水平、細胞增殖率以及p62 蛋白表達水平顯著升高,而細胞凋亡率、自噬率以及Beclin1 蛋白表達水平和LC3-II/I 比值顯著降低,提示上調(diào)miR-30b 可逆轉(zhuǎn)AE 對癌細胞發(fā)揮的作用。

綜上所述,AE 可能通過抑制miR-30b 表達,促進HEC-1-B 癌細胞自噬,進一步抑制癌細胞增殖,促進其凋亡,而上調(diào)miR-30b 可逆轉(zhuǎn)AE 對HEC-1-B 癌細胞的作用。 然而AE 對子宮內(nèi)膜癌的作用機制較為復(fù)雜,尚需深入研究。