朱麗霖，王后坤，陳雪陽，高可麗，方 春，梁雄燕，楊玉瑩

（長江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

【研究意義】禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥（reticuloendotheliosis，RE）是禽類一種重要的致瘤性和免疫抑制性疾病，臨床上將其命名為禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥，是由反轉(zhuǎn)錄病毒科丙型逆轉(zhuǎn)錄病毒屬-禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）引起的雞、火雞等其他禽類發(fā)生的以急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤、矮小病綜合征（生長抑制綜合征）、淋巴組織和其他組織的慢性腫瘤形成為特征的綜合征[1-2]。該病不僅可導(dǎo)致肝脾腫大、具有顯著壞死或淋巴組織增生性病變，還會嚴(yán)重影響雞的生長發(fā)育和免疫反應(yīng)。該病毒的假型帶有禽白血病病毒的囊膜，可與雞貧血病病毒、馬立克氏病病毒等相互作用，引起腺胃炎、急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤淋巴組織與其他組織慢性腫瘤形成[3-4]。REV 所引起的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥在世界各地均有報道，并且該病的流行呈逐年擴(kuò)大趨勢，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失[5]。多個流行病學(xué)調(diào)查報告顯示REV 在中國雞群感染中，特別是地方品系雞群中已相當(dāng)普遍，易感宿主比馬立克病或禽白血病更為廣泛，雞、火雞、鴨、鵝和鵪鶉都可發(fā)生自然感染和發(fā)病，多種鳥類也可感染[6]。該病毒的致病性并不嚴(yán)重，但造成免疫抑制的潛在威脅不能忽視。REV 基因組由3 個結(jié)構(gòu)基因（GAG、POI 和ENV）組成，側(cè)翼是長端重復(fù)序列（LTRs）[7]。囊膜蛋白ENV 的主要成熟基因產(chǎn)物是表面糖蛋白（gp90）和跨膜蛋白（gp20）[8]。含有連續(xù)和不連續(xù)表位的gp90 蛋白作為顯性蛋白[6]，具有病毒的型特異性，該蛋白負(fù)責(zé)誘導(dǎo)動物產(chǎn)生保護(hù)性抗體引發(fā)免疫反應(yīng)，是應(yīng)用于REV 診斷的良好選擇[9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Witter[10]建立了IFA 檢測REV 的方法，可以快速對臨床樣本做出檢測，耗時短、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)，但需要使用熒光顯微鏡這種精密的儀器進(jìn)行結(jié)果讀取，具有明顯的環(huán)境限制，所以并不太適用于現(xiàn)場診斷。1993 年ALY[11]基于SNV 的LYR 序列設(shè)計一對PCR 引物，能從囊淋巴瘤和非腫瘤腦組織中檢出REV，而ALV 和MDV 引起的腫瘤組織病料則不能被該引物擴(kuò)增。其敏感性比ELISA、核酸探針至少高10 倍?！颈狙芯壳腥朦c】哈獸研李凱等[12]針對gp90 基因建立了檢測REV 的熒光定量PCR 方法，其敏感性是普通PCR 的100 倍。楊葉[11]等對REV 的免疫顯性蛋白gp90 的氨基酸序列進(jìn)行分析和對REV 單抗抗原表位分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，合成了5 段多肽，通過已知的REV 陽性血清與多肽反應(yīng)結(jié)果，篩選獲得一條反應(yīng)性良好的抗原多肽。將篩選出的多肽作為抗原包被酶標(biāo)板，優(yōu)化后建立了特異性檢測REV 抗體的多肽ELISA 方法。有研究用純化的REV 重組CA 蛋白免疫新西蘭兔制備兔抗CA 蛋白多克隆抗體[4]，為REV 的檢測及CA 基因的深入研究奠定了基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究中，筆者通過構(gòu)建兩種原核表達(dá)載體分別表達(dá)REV-gp90 蛋白，重組蛋白純化后制備針對REV-gp90 蛋白的多克隆抗體，間接ELISA 檢測抗體效價，并對其特異性進(jìn)行鑒定，以期為防控禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與載體 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生REV HB2015021（KY581581）、大腸桿菌DH5α 和BL21、表達(dá)載體pET-28a和pGEX-6p-1，均由長江大學(xué)病原微生物與分子實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 克隆試劑盒（CV1901），購自北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（GK2043）、質(zhì)粒小提試劑盒（GK2004），均購自上海捷瑞生物工程有限公司；DNA 連接酶（6022），購自TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司；Ni2+瓊脂糖柱料（HZ1003-7），購自武漢匯研生物科技有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（P0006），購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑（F5881）、弗氏不完全佐劑（F5506），均購自Sigma 公司；DF-1 細(xì)胞購自中科院上海獸醫(yī)研究所，本實驗室凍存；0.25%胰酶（GP3108-100 mL），購自Genview 公司；胎牛血清（900-108），購自Gemini 公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（C11995500BT），購自Gbico 公司；LB 培養(yǎng)基，上海生工生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（D110105）、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（D110087），均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均由長江大學(xué)動物病原微生物學(xué)實驗室提供。

1.1.3 試驗動物 健康的Balb/c小鼠，購自長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增 根據(jù)REV 毒株HB2015021（KY581581），設(shè)計了用于擴(kuò)增gp90 基因的特異性引物，引物序列見表1，以感染REV（HB2015021）DF-1 細(xì)胞基因組DNA 為模板擴(kuò)增REV-gp90。引物由武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)公司合成。PCR 反應(yīng)體系如下（25 μL）：2×Mix：12.5 μL、gp90-F（10 μmol/L）1 μL、gp90-R（10 μmol/L）1 μL、DNA 模板1.5 μL、去離子水9 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃3 min；變性95 ℃15 s、退火58 ℃20 s、延伸72 ℃90 s，共30個循環(huán)；終末延伸72 ℃10 min；16 ℃保溫。

表1 REV-gp90引物序列Tab.1 Primers sequence of REV-gp90

1.2.2 重組表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建 目的基因gp90 用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，并按克隆試劑盒說明書將其分別連接至pET-28a 載體和pGEX-6p-1 載體上，42 ℃，1 h。將連接之后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α 細(xì)菌內(nèi)，分別涂布于帶有卡那霉素（Kana）與氨芐（Amp）抗性平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，分別挑選5 個單菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆保存菌液，并通過質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2.3 重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測序正確的原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-REV-gp90 和pGEX-6p-1-REV-gp90 用熱激的方法分別轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)菌株BL21中，分別均勻涂布于Kana 和Amp 平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑選陽性菌落接入2 支裝有對應(yīng)抗生素的液體LB 培養(yǎng)基（每支4 mL）中培養(yǎng)，其中一支用于后續(xù)試驗，另一支用于誘導(dǎo)表達(dá)。待菌液培養(yǎng)至OD 值約0.6 時，在EP 管中加入1 mL 菌液和1 μL 的IPTG，至終濃度為1 mmol/L，作為誘導(dǎo)組；取1 mL 菌液作為未誘導(dǎo)對照，His 標(biāo)簽重組蛋白誘導(dǎo)條件：30 ℃、220 r/min 誘導(dǎo)5 h；GST 標(biāo)簽重組蛋白誘導(dǎo)條件：37 ℃、220 r/min 誘導(dǎo)4 h。12 000 r/min 離心3 min收集菌體，用40 μL 的PBS 重懸菌體后，按比例加入Loading Buffer，混勻后在沸水中煮8～10 min，配制12%Gel SDS-PAGE分離膠、5%SDS-PAGE濃縮膠，進(jìn)行凝膠電泳檢測。

1.2.4 重組融合蛋白的純化 挑選表達(dá)量較高的菌株在適宜溫度下對其進(jìn)行大量誘導(dǎo)和蛋白純化。將用于后續(xù)實驗的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑，按兩種標(biāo)簽蛋白誘導(dǎo)條件分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。純化前需要對表達(dá)的融合蛋白是否為可溶性進(jìn)行檢測，取適量收集的菌體用5 mL PBS 重懸，再用超聲波破碎儀裂解，工作條件如下：200 W 破碎5 s，間隔10 s，工作總時間90 min，離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE凝膠檢測。

收集重組質(zhì)粒pET-28a-REV-gp90 的菌體使用20 mL PBS 洗滌菌體，12 000 r/min 4 ℃冷凍離心5 min，棄去上清，菌體用20 mL PBS 重懸后，在冰水混合物中冰浴30 min，再將重懸的菌液置于超聲破碎儀裂解；超聲波裂解結(jié)束后冷凍離心20 min，用0.45 μm濾器過濾除去雜質(zhì)，備用。

用2 mL 的Ni2+親和層析柱料填充裝置，按照說明書操作。從小到大依次加入梯度咪唑以洗脫吸附的REV-His-gp90蛋白，每種洗脫液抽取40 μL用于SDS-PAGE檢測，剩余蛋白液-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

收集重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-REV-gp90 的菌體使用20 mL Buffer A（Tris base 3.0274 g，EDTA 0.3 g，NaCl 3 g，加400 mL 去離子水調(diào)節(jié)PH 至8.0，溶解后定容至500 mL，常溫保存）。洗滌菌體，12 000 r/min 4 ℃冷凍離心10 min，棄去上清；用Buffer B（Tris base 3.027 4 g，EDTA 0.3 g，NaCl 3 g，5 mL 1% Nonidet P-40，去離子水溶解，定容至500 mL，常溫保存）。重新懸浮菌體，加入溶菌酶和PMSF 至終濃度為分別為1 mg/mL 和1 mmol/L，在冰水混合物中冰浴30 min，后將重懸的菌液置于超聲破碎儀裂解，破碎5 s，間隔10 s，功率200 W，工作總時間90 min；超聲波裂解結(jié)束后12 000 r/min。4 ℃冷凍離心20 min；收集上清并用Buffer Ⅰ（3.027 4 g Tris base，0.3 g EDTA，3 g NaCl，120 g 尿素，TritonX-100 2.5 mL，去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH 至8.0，最后定容至250 mL，常溫保存）。重懸沉淀，后將重懸的沉淀置于超聲破碎儀裂解，破碎5 s，間隔10 s，功率200 W，工作總時間90 min；超聲波裂解結(jié)束后12 000 r/min。4 ℃冷凍離心20 min；收集上清并用Buffer Ⅱ（3.0274 g Tris base，0.3 g EDTA，3 g NaCl，TritonX-100 15 mL，去離子水溶解后定容至500 mL，常溫保存）。重懸沉淀，后將重懸的沉淀置于超聲破碎儀裂解，破碎5 s，間隔10 s，功率200 W，工作總時間90 min；超聲波裂解結(jié)束后12 000 r/min。4 ℃冷凍離心20 min；收集上清并用Buffer Ⅲ（3.027 4 g Tris base，0.3 g EDTA，3 g NaCl，鹽酸胍95.5 g，TritonX-100 2.5 mL，去離子水溶解后定容至500 mL，常溫保存）。重懸沉淀，后將重懸的沉淀置于超聲破碎儀裂解，破碎5 s，間隔10 s，功率200 W，工作總時間90 min；超聲波裂解結(jié)束后12 000 r/min。4 ℃冷凍離心20 min；依據(jù)沉淀的多少加入Buffer C（240 g 尿素，6.054 8 g Tris base，EDTA 0.3 g，脫氧膽酸鈉0.414 g，TritonX-100 2.5 mL，β-巰基乙醇360 μL，去離子水溶解，定容至500 mL）。沉淀溶解后，抽取40 μL 用于SDSPAGE 檢測，剩余分裝于-80 ℃保存。

1.2.5 多克隆抗體的制備 純化的融合蛋白REV-His-gp90 用Bradford 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后為免疫用抗原，免疫4 只7 周齡的Balb/c 小鼠。首次免疫用100 μg 融合蛋白與等量的弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射；第二次和第三次免疫用弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，每只小鼠抗原用量為100 μg，免疫間隔時間為2 周。三免后3 d 眼球摘除放血處死小鼠，25 ℃水平放置2 h，4 ℃水平放置4 h，4 000 r/min 離心10 min，制備抗血清。

1.2.6 間接ELISA 檢測多克隆抗體效價 將純化的REV-GST-gp90 蛋白作為包被抗原，將包被抗原用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋至2 μg/mL，每孔100 μL添加至酶標(biāo)板中，置于4 ℃過夜。用PBST將酶標(biāo)板洗滌3次，拍干后加入5%脫脂乳，37 ℃封閉2 h。用PBS將小鼠血清稀釋1 000倍，渦旋混勻，取100 μL進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別加入酶標(biāo)板中，37 ℃孵育2 h后用PBST洗滌3次并拍干，用5%脫脂乳1∶2 000倍稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，并加至酶標(biāo)板中，37 ℃作用1 h。孵育結(jié)束后洗滌3 次并拍干，避光加入顯色液每孔100 μL，充分反應(yīng)約15 min 后，每孔加入50 μL 終止液終止顯色。將終止顯色的酶標(biāo)板放入多功能酶標(biāo)儀，測量OD450以P/N≥2為判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.7 Western blot 檢測分析 為了檢測制備的多克隆抗體是否能夠與REV-gp90特異性發(fā)生反應(yīng)，將BL21-pET-28a-REV-gp90 和BL21-pET-28a 分別接種至Kana 抗性LB 培養(yǎng)基，誘導(dǎo)表達(dá)后離心收集菌體。將菌體裂解液經(jīng)SDS-PAGE 分離后，通過濕轉(zhuǎn)膜法（230 mA，70 min）將分離膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，以重組融合蛋白REV-His-gp90 為檢測抗原，以收集誘導(dǎo)的BL21-pET-28a 蛋白為陰性對照，5%的脫脂乳室溫封閉2 h，用TBST 洗滌3 次，加入制備的多克隆抗體（1∶500 稀釋），室溫下孵育2 h，用TBST 洗滌3 次，最后加入HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1:5 000 稀釋），室溫孵育1 h，用TBST 洗滌5 次，通過ECL化學(xué)發(fā)光顯影并拍照。

1.2.8 間接免疫熒光（IFA）按照文獻(xiàn)[13]的檢測方法，用PBS 將處于對數(shù)生長期的DF-1 單層細(xì)胞輕輕洗兩遍，接種REV 病毒，用含有1%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，棄上清，更換為5%血清的完全培養(yǎng)基，同時設(shè)置未接毒的正常DF-1 細(xì)胞作為陰性對照，5 d 后棄上清。用PBS 洗兩遍，加入預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定15 min；PBS 洗兩遍，加入0.5%Triton X-100 透膜劑，37 ℃反應(yīng)15 min；用PBS 洗兩遍后加入1% FBS 作為封閉液，37 ℃封閉1 h；PBS 洗兩遍，加入1∶500 稀釋的多抗，37 ℃作用60 min；用PBS 洗3 遍，再加入稀釋的FITC 羊抗鼠熒光二抗，37 ℃避光反應(yīng)45 min，避光狀態(tài)下用PBS洗3 遍，每次15 min。在熒光顯微鏡下觀察，空白對照無熒光，而實驗組出現(xiàn)亮綠色熒光則為陽性，反之則為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR 擴(kuò)增目的基因gp90 片段，見圖1，使用無縫克隆試劑盒將gp90 片段分別與pET-28a 和pGEX-6p-1載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α細(xì)菌內(nèi)，過夜培養(yǎng)挑選菌落，并用設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定（圖2）。

圖1 REV-gp90基因擴(kuò)增PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of REV-gp90 gene by PCR

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.2 重組蛋白的表達(dá)、純化和濃度測定

將pET-28a-REV-gp90和pGEX-6p-1-REV-gp90重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞中，分別均勻涂板，挑菌后通過PCR 進(jìn)行鑒定，陽性克隆加入IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，取誘導(dǎo)后裂解菌體的上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE 檢測。結(jié)果表明REV-His-gp90 和REV-GST-gp90 均為包涵體蛋白，分別為43 ku 和69 ku（圖3）。經(jīng)過純化后均獲得較為精純的蛋白（圖4）。純化的蛋白用Bradford 蛋白定量試劑盒測定濃度，分別為0.65 mg/mL和1.16 mg/mL。

圖3 重組質(zhì)粒表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of the expression of fusion protein by SDS-PAGE

圖4 蛋白純化的SDS-PAGE分析Fig.4 Analysis of protein purification by SDS-PAGE

2.3 多克隆抗體的制備及鑒定

按前述方法制備多克隆抗體，在第三次免疫后3 d的小鼠經(jīng)眼球摘除采血獲得抗REV-gp90 多抗血清。以純化的REV-GST-gp90 重組蛋白作為包被抗原，采用間接ELISA 的方法對純化的方法進(jìn)行測定，首先將純化的抗體以1∶1 000 倍的比例稀釋，然后，剩余的以等體積稀釋進(jìn)行倍比稀釋，以P/N≥2 為判定標(biāo)準(zhǔn)，測得該多抗血清效價為1∶64 000，OD450檢測吸光度結(jié)果如圖5。為了檢測制備的多克隆抗體的特異性，通過Western-blot檢測，見圖6，在預(yù)期的位置出現(xiàn)特異性目的條帶，且陰性對照組無條帶。將制備的多抗血清與感染REV 病毒5 d 的DF-1 細(xì)胞進(jìn)行IFA，均有熒光，如圖7 所示，結(jié)果表明所制備的多克隆抗體可以與REV 發(fā)生特異性反應(yīng)。表明本實驗制備的多抗血清有良好的特異性。

圖5 抗血清的效價測定Fig.5 Antiserum titer determination

圖7 IFA檢測多抗血清特異性Fig.7 Specific detection of polyclonal antibody by IFA

3 討論與結(jié)論

RE 感染在我國地方品系雞群中已相當(dāng)普遍[14-16]，雞、火雞、鴨、鵝、麻雀和鵪鶉等都易染。REV 對低日齡雞感染力較強(qiáng)[17]，主要是通過垂直和水平傳播，小雞感染REV 后如未及時發(fā)現(xiàn)將對整個雞群造成大規(guī)模感染的威脅。而REV 與MDV、CAV、ALV 等免疫抑制性病毒在雞群中混合感染給養(yǎng)禽業(yè)帶來的危害更加嚴(yán)重[14]，同時也給REV的監(jiān)測帶來了困難。因此，特異性強(qiáng)、靈敏性高的REV檢測技術(shù)亟待發(fā)展。本研究以pET-28a 為原核表達(dá)載體構(gòu)建His 標(biāo)簽的重組REV-gp90 蛋白，并通過Ni2+親和層系柱進(jìn)行純化，免疫Balb/c 小鼠，制備抗REV-His-gp90 蛋白的多克隆抗體。為了防止由于識別標(biāo)簽蛋白而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，本研究另外構(gòu)建了pGEX-6p-1為載體的REV-GST-gp90蛋白，用其作為間接ELISA中的包被抗原。原核表達(dá)的REV-His-gp90蛋白具有良好的免疫原性，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的免疫應(yīng)答反應(yīng)。為了驗證所制備的多克隆抗體的特異性，本實驗采用Western blot和IFA對其進(jìn)行分析。WB結(jié)果顯示該多克隆抗體能與REV-His-gp90 發(fā)生特異性反應(yīng)，同時，間接免疫熒光結(jié)果表明所制備的REVgp90 蛋白及其多克隆抗體能與REV 病毒粒子特異結(jié)合，可以作為反映REV 感染、診斷病情及預(yù)后的新檢測系統(tǒng)，且該檢測方法簡便快速，不需要過多儀器，在臨床上也具有實用價值。WB和IFA 結(jié)果證明本實驗制備的抗REV-gp90多克隆抗體具有良好的特異性。本實驗獲得的多克隆抗體以及檢測方法，將為后期REV-gp90 蛋白生物學(xué)及免疫學(xué)功能的研究、單克隆抗體的制備以及REV 檢測技術(shù)發(fā)展提供生物材料和研究工具。