張 強(qiáng)，宋 萍*，朱留剛，封 磊，洪 偉，3，吳承禎

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)過程與經(jīng)營重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；4.武夷學(xué)院，福建 武夷山 354300）

【研究意義】雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）隸屬衛(wèi)矛科雷公藤屬，廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺病、腎病、皮膚病、白血病等疾病，是珍貴的藥用植物[1]。雷公藤提取物中的二萜三環(huán)氧化物雷公藤甲素（triptolid）是其主要的藥用活性成分之一。1972年，Kupchan等[2]首次發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素具有明顯的抗白血病作用，此后雷公藤甲素又被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)可對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株產(chǎn)生明顯的抑制作用；此外，雷公藤甲素還具有免疫抑制和抗炎作用，對(duì)多種促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)以及內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)具有抑制作用，并具有誘導(dǎo)自身或其它細(xì)胞凋亡的能力[3]。因此，雷公藤甲素具有廣闊的開發(fā)前景與應(yīng)用市場。但由于其結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜和特殊，目前尚無法有效地進(jìn)行大量人工合成，加之其在植株中的天然含量低、分離困難，使得對(duì)于雷公藤甲素的研究和應(yīng)用受到很大限制。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)由于可以人工控制實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長、分化和次生代謝產(chǎn)物積累的最佳條件，從而可以有效地促進(jìn)細(xì)胞增殖并定向誘導(dǎo)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成和積累。因此，研究如何利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)雷公藤甲素具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用誘導(dǎo)子來提高次生代謝物的產(chǎn)量，是目前植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中常用的方法。誘導(dǎo)子可分為生物誘導(dǎo)子與非生物誘導(dǎo)子兩種。生物誘導(dǎo)子包括來自真菌、細(xì)菌或草食動(dòng)物誘導(dǎo)子、植物細(xì)胞壁碎片、植物被病原體或草食動(dòng)物入侵時(shí)釋放的化學(xué)物質(zhì)等，其功能與受體偶聯(lián)，通過激活或失活許多酶或離子通道起作用[4]。以酵母提取物及榆黃蘑作為生物誘導(dǎo)子，添加至懷牛膝懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中，能明顯促進(jìn)牛膝多糖的生成[5]；利用青霉和黑曲霉作為生物誘導(dǎo)子，可分別將大豆懸浮細(xì)胞中異黃酮的積累量提升2.56倍與1.32倍[6]。近年來，植物內(nèi)生菌被發(fā)現(xiàn)可以作為生物誘導(dǎo)子用于提高植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中次生代謝產(chǎn)物的積累。如高媛等[7]通過添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子使苦豆子中喹諾里西啶類生物堿達(dá)到了對(duì)照組的2.65 倍；李群等[8]將6 株內(nèi)生菌作為生物誘導(dǎo)子添加于灰氈毛忍冬懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)，其對(duì)細(xì)胞生物量及次生代謝產(chǎn)物綠原酸含量產(chǎn)生了不同程度的促進(jìn)作用。非生物誘導(dǎo)子是指本身并不是植物細(xì)胞中的天然成分，卻可以通過化學(xué)或物理途徑使植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，進(jìn)而觸發(fā)植物次生活性物質(zhì)的合成。其種類主要包括植物生長調(diào)節(jié)劑、水楊酸、茉莉酸甲酯、重金屬鹽、稀土元素、紫外線輻射、高低溫和溶氧量等[4]。如利用茉莉酸甲酯和水楊酸作誘導(dǎo)子使半夏懸浮細(xì)胞中的生物堿含量分別達(dá)到對(duì)照組的3.6和2.5倍[9]。【本研究切入點(diǎn)】截止目前，已有多種誘導(dǎo)子被用于包括人參、雪蓮、紅豆杉、黃芪等在內(nèi)的藥用植物懸浮培養(yǎng)體系中，并在細(xì)胞生長及活性成分積累方面起著重要作用，然而有關(guān)雷公藤懸浮細(xì)胞中雷公藤甲素積累的研究鮮少涉及。前期研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素可以在雷公藤愈傷組織[10]和懸浮細(xì)胞[11]中積累。本研究擬通過雷公藤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，以水楊酸（salicylic acid，SA）、稀土元素La3+以及雷公藤內(nèi)生真菌為誘導(dǎo)子，研究其對(duì)雷公藤懸浮細(xì)胞中雷公藤甲素積累的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過制備和添加不同的非生物和生物誘導(dǎo)子，揭示誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤懸浮細(xì)胞產(chǎn)雷公藤甲素的影響，以期提高懸浮細(xì)胞中雷公藤甲素含量，為雷公藤甲素的擴(kuò)大化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 雷公藤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

以雷公藤植株嫩葉為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，連續(xù)繼代培養(yǎng)3 代以上。選取質(zhì)地疏松、生長良好的愈傷組織，用鑷子夾成小塊，稱取0.4 g進(jìn)行接種[14]。應(yīng)用White基礎(chǔ)培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)公司），附加激素2，4-D 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L和KT 0.1 mg/L，培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌20 min。將愈傷組織接種到裝有50 mL培養(yǎng)基的三角瓶中，置于恒溫振蕩搖床于120 r/min、（25±1）℃下懸浮暗培養(yǎng)。

1.2 非生物誘導(dǎo)子的添加

雷公藤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)至第3 天向培養(yǎng)液中添加非生物誘導(dǎo)子。使用醫(yī)用注射器分別吸取SA 和LaCl3原液，經(jīng)0.22 μm 的滅菌水系微孔濾頭過濾除菌后添加至細(xì)胞培養(yǎng)液中。SA 添加后的質(zhì)量濃度分別控制在0.1 mg/L（低濃度）、1.0 mg/L（中等濃度）和10 mg/L（高濃度）；LaCl3添加后的濃度分別控制在20 mg/L（低濃度）、40 mg/L（中等濃度）和60 mg/L（高濃度）。對(duì)照不添加任何誘導(dǎo)子。

1.3 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子的制備

利用本實(shí)驗(yàn)室保藏的兩株雷公藤內(nèi)生真菌Pochonia suchlasporiaNS-17和Penicillium spinulosumNS-5 進(jìn)行生物誘導(dǎo)子的制備。將菌株接種于PDA 平板進(jìn)行活化，取菌餅接種于PDA 液體培養(yǎng)基，于28 ℃、120 r/min 下?lián)u床震蕩培養(yǎng)6 d，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行抽濾分別收集菌絲體和發(fā)酵液濾液。菌絲體用蒸餾水充分清洗后，加入蒸餾水進(jìn)行勻漿，再次抽濾，得到菌絲提取物，于121 ℃滅菌20 min，即得菌絲體誘導(dǎo)子。將發(fā)酵液濾液高壓滅菌制備成培養(yǎng)液誘導(dǎo)子。在植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)至第4、8天（細(xì)胞分別處于生長前期和對(duì)數(shù)生長期）時(shí)，分別添加各內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子。以誘導(dǎo)子的糖濃度來確定其添加量，糖含量應(yīng)用苯酚硫酸法測定。

1.4 細(xì)胞活力的測定

采用氯化三苯四氮（2，3，5-Triphenyltertrazolium Chloride，TTC）還原法測定懸浮細(xì)胞活力。

1.5 細(xì)胞干質(zhì)量的測定

用超純水將懸浮細(xì)胞充分清洗，去除殘留的培養(yǎng)基，抽濾，60 ℃烘干至恒量，用電子天秤稱重，記為干質(zhì)量。

1.6 總糖測定

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中總糖的含量采用苯酚硫酸法測定。

1.7 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定

細(xì)胞PAL的活性依據(jù)PAL與L-苯丙氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物肉桂酸在290 nm處的吸光值的變化進(jìn)行測定。

1.8 雷公藤甲素的測定

雷公藤甲素應(yīng)用高效液相色譜儀（HPLC）測定。通過過濾分離培養(yǎng)液和懸浮細(xì)胞，其中細(xì)胞樣品烘干至恒重，用研缽碾成粉末。稱取粉末0.500 0 g。以甲醇為浸提液，超聲處理30 min，4 ℃自然浸提12 h。然后4 000 r/min 離心，將上清液定容于10 mL 容量瓶，經(jīng)0.45 μm 濾頭過濾后作為待測液。HPLC 色譜柱為XB-C18 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相為水/甲醇（30/70）；流速是1.0 mL/min；波長為218 nm；柱溫是室溫。進(jìn)樣量為10 μL[13]。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果分析

2.1 不同誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤甲素產(chǎn)量的影響

由圖1，SA處理下的雷公藤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中雷公藤甲素含量與誘導(dǎo)子濃度有關(guān)，0.1 mg/L的SA明顯促進(jìn)了雷公藤甲素的產(chǎn)量，在培養(yǎng)12 d時(shí)培養(yǎng)液中雷公藤甲素含量最高，約是對(duì)照的3.5倍。而1.0 mg/L和10 mg/L的SA對(duì)雷公藤甲素積累的影響很小。

圖1 誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤甲素含量的影響Fig.1 The effect of elicitors on the content of triptolide

相比對(duì)照，3種濃度的LaCl3誘導(dǎo)子均明顯提高了培養(yǎng)液中雷公藤甲素的產(chǎn)量，且誘導(dǎo)子濃度越低其誘導(dǎo)效應(yīng)越強(qiáng)；但誘導(dǎo)子濃度越低，雷公藤甲素產(chǎn)量峰值出現(xiàn)的越晚。20，40，60 mg/L 的LaCl3誘導(dǎo)下的雷公藤甲素濃度峰值分別是對(duì)照的2.0、1.7和1.2倍。由此可見，低濃度的SA和不同濃度的LaCl3均能促進(jìn)雷公藤懸浮細(xì)胞向外釋放雷公藤甲素，而LaCl3的誘導(dǎo)效應(yīng)隨濃度的增加而減弱。

與對(duì)照相比，在細(xì)胞培養(yǎng)第4天添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子，NS-5菌絲體和NS-17菌絲體均顯著促進(jìn)了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中雷公藤甲素的積累，培養(yǎng)12 d 時(shí)，雷公藤甲素產(chǎn)量最高，分別是對(duì)照的1.9 和1.7 倍。NS-17培養(yǎng)液和NS-5培養(yǎng)液對(duì)雷公藤甲素產(chǎn)量的影響則相對(duì)較小。

在細(xì)胞培養(yǎng)第8 天添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子，在誘導(dǎo)初期各誘導(dǎo)子便提高了細(xì)胞中雷公藤甲素的釋放；隨后，NS-17培養(yǎng)液和NS-5菌絲體誘導(dǎo)下雷公藤甲素在培養(yǎng)第15天達(dá)到峰值，其產(chǎn)量分別是對(duì)照的2.0和2.4 倍；NS-17 菌絲體、NS-5 培養(yǎng)液誘導(dǎo)下的雷公藤甲素產(chǎn)量分別在培養(yǎng)第9、12 天時(shí)最大，分別是對(duì)照的2.1和1.8倍。

2.2 不同誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞活力的影響

如圖2，將不同濃度的非生物誘導(dǎo)子SA 和LaCl3添加至培養(yǎng)3 d的雷公藤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系后，細(xì)胞活力隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢。與對(duì)照相比，兩種非生物誘導(dǎo)子的添加均使細(xì)胞活力的峰值提前。中、低濃度的SA（1.0 mg/L、0.1 mg/L）和LaCl3（40 mg/L、20 mg/L）在懸浮培養(yǎng)前期對(duì)細(xì)胞活力具有明顯的誘導(dǎo)效應(yīng)，誘導(dǎo)第3 天和第6 天時(shí)，細(xì)胞活力高于對(duì)照；培養(yǎng)12 d 之后，這些誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)效應(yīng)減弱，各處理的細(xì)胞活力接近于對(duì)照。與20 mg/L 的LaCl3相比，40 mg/L 的LaCl3提高細(xì)胞活力的效應(yīng)更強(qiáng)。高濃度的SA和LaCl3處理的懸浮細(xì)胞活力均低于對(duì)照，顯示出一定的抑制效應(yīng)。

圖2 誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.2 The effect of elicitors on the cell viability

在雷公藤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)前期添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子后，在培養(yǎng)前12 d 內(nèi)，NS-5 培養(yǎng)液顯著提高了細(xì)胞活力，NS-5菌絲體對(duì)細(xì)胞活力的影響則不明顯；在培養(yǎng)后期，NS-5培養(yǎng)液和菌絲體對(duì)細(xì)胞活力均產(chǎn)生了抑制作用（圖1）。除了誘導(dǎo)初期，從培養(yǎng)至第9天開始，NS-17培養(yǎng)液和菌絲體對(duì)懸浮細(xì)胞活力均顯示出明顯的抑制效應(yīng)。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子后，相比對(duì)照，NS-5 培養(yǎng)液在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期（9 d、12 d）提高了細(xì)胞活力，但在細(xì)胞生長后期對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生了抑制作用；其它誘導(dǎo)子在整個(gè)誘導(dǎo)期對(duì)細(xì)胞活力均具有抑制作用。

2.3 不同誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞生長的影響

對(duì)非生物誘導(dǎo)子和生物誘導(dǎo)子處理下的雷公藤懸浮細(xì)胞生長情況測定（圖3）發(fā)現(xiàn)，各誘導(dǎo)子處理下雷公藤懸浮細(xì)胞的生長趨勢與對(duì)照基本一致。0.1 mg/L SA 處理的懸浮體系細(xì)胞干質(zhì)量大于對(duì)照；10 mg/L SA 在細(xì)胞生長前期干質(zhì)量高于對(duì)照而進(jìn)入生長對(duì)數(shù)期以后則低于對(duì)照；1.0 mg/L SA 則明顯降低了細(xì)胞干質(zhì)量的積累。與對(duì)照相比，20 mg/L 和40 mg/L LaCl3處理對(duì)細(xì)胞干質(zhì)量的積累無明顯的影響；60 mg/L LaCl3則明顯提高了對(duì)數(shù)生長期和生長后期的細(xì)胞干質(zhì)量。

在細(xì)胞生長前期添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長，提高細(xì)胞的干質(zhì)量（圖3）。其中，NS-17 培養(yǎng)液誘導(dǎo)子的促進(jìn)作用最顯著，12 d 時(shí)的細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)最大，是對(duì)照的2.8 倍；其次是NS-5 培養(yǎng)液誘導(dǎo)子，細(xì)胞干質(zhì)量在9 d時(shí)達(dá)最大，是對(duì)照的1.9倍；NS-5菌絲體和NS-17菌絲體誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞干質(zhì)量呈現(xiàn)出輕微的促進(jìn)作用。在細(xì)胞培養(yǎng)第8 天添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子后，NS-5 培養(yǎng)液在整個(gè)誘導(dǎo)期均提高了細(xì)胞干質(zhì)量；NS-17 培養(yǎng)液在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期顯著促進(jìn)了干質(zhì)量的積累；而NS-5 菌絲體和NS17 菌絲體的誘導(dǎo)作用不大，細(xì)胞干質(zhì)量與對(duì)照相接近。由此可見，細(xì)胞生長前期添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子有利于提高細(xì)胞生物量，內(nèi)生真菌培養(yǎng)液比菌絲體的促進(jìn)作用要強(qiáng)，其中NS-17培養(yǎng)液的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。

圖3 誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞生長的影響Fig.3 The effect of elicitors on the cell growth

2.4 不同誘導(dǎo)子對(duì)總糖消耗的影響

由圖4中SA 處理下的雷公藤懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中總糖含量的變化可知，0.1 mg/L 和10.0 mg/L SA 誘導(dǎo)下細(xì)胞對(duì)總糖的消耗明顯高于對(duì)照，而1.0 mg/L SA 誘導(dǎo)的細(xì)胞總糖消耗則略低于對(duì)照。SA 誘導(dǎo)的細(xì)胞總糖消耗與生物量的增加基本一致。根據(jù)LaCl3誘導(dǎo)的培養(yǎng)液總糖含量變化曲線，20 mg/L LaCl3誘導(dǎo)下細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液中總糖消耗明顯高于對(duì)照，這可能與雷公藤甲素的積累有一定關(guān)聯(lián)；60 mg/L 誘導(dǎo)下的細(xì)胞總糖消耗也明顯高于對(duì)照，總糖的消耗與細(xì)胞生物量的提高相一致；40 mg/L LaCl3誘導(dǎo)下的細(xì)胞總糖消耗則稍低于對(duì)照。

在細(xì)胞生長前期添加內(nèi)生真菌NS-5、NS-17 誘導(dǎo)子后，培養(yǎng)液中總糖含量均低于對(duì)照（圖4）。其中，NS-17培養(yǎng)液誘導(dǎo)的細(xì)胞總糖消耗最大。總體上，各內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子作用下的培養(yǎng)液總糖消耗與細(xì)胞生物量增長相一致，而兩者與雷公藤甲素的積累沒有明顯關(guān)聯(lián)。在細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子與生長前期添加的培養(yǎng)液總糖含量變化十分接近。

圖4 誘導(dǎo)子對(duì)培養(yǎng)液中總糖含量的影響Fig.4 The effect of elicitors on the total sugar content in the culture broth

2.5 不同誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞PAL活性的影響

非生物誘導(dǎo)子處理下的雷公藤懸浮細(xì)胞PAL 活性變化如圖5 所示，細(xì)胞PAL 活性隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加明顯增強(qiáng)，在對(duì)數(shù)生長期（第9 天）達(dá)到峰值，之后逐漸減弱。相比對(duì)照，3 種濃度的SA 誘導(dǎo)子均明顯剌激了細(xì)胞PAL 活性，并且隨著SA 誘導(dǎo)子濃度的增加，剌激作用越強(qiáng)。3 種濃度的LaCl3在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期對(duì)PAL活性具有增強(qiáng)作用，在細(xì)胞生長后期作用不明顯，其中，40 mg/L的LaCl3處理的細(xì)胞PAL活性峰值最大。

圖5 誘導(dǎo)子對(duì)PAL活性的影響Fig.5 The effect of elicitors on the PAL activity

細(xì)胞生長前期添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子后，雷公藤懸浮細(xì)胞PAL活性隨培養(yǎng)時(shí)間的增長呈現(xiàn)先減弱后增強(qiáng)的趨勢，細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期PAL達(dá)到低谷。與對(duì)照相比，各內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子在細(xì)胞生長前期和后期提高了PAL 活性，而在對(duì)數(shù)生長期則降低了PAL 活性。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子后，相比對(duì)照，NS-17菌絲體誘導(dǎo)子在細(xì)胞生長前期和后期提高了PAL活性，而在對(duì)數(shù)生長期抑制了PAL活性；NS-17和NS-5培養(yǎng)液誘導(dǎo)子在整個(gè)誘導(dǎo)期對(duì)細(xì)胞PAL顯示了抑制作用；NS-5菌絲體誘導(dǎo)子對(duì)PAL的影響不明顯。

3 討論與結(jié)論

SA 是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的酚類化合物，具有多種功能，包括調(diào)控植物的生長發(fā)育以及在生物和非生物脅迫條件下誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)等，其作為誘導(dǎo)子可以有效地促進(jìn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。如張媛媛等[12]發(fā)現(xiàn)添加200 μmol/LSA 培養(yǎng)30 d 時(shí)，半夏中肌苷含量高出對(duì)照組161.40%。水楊酸、萘乙酸和硝普鈉3種誘導(dǎo)子均可以促進(jìn)蒙古黃芪有效成分的積累，其中，水楊酸對(duì)提高黃酮成分的效果最為明顯，萘乙酸與硝普鈉則分別對(duì)多糖與皂苷的積累具有顯著的促進(jìn)作用[13]。SA不僅對(duì)同一細(xì)胞系內(nèi)不同化合物的影響不同，對(duì)同一細(xì)胞系同一化合物的效應(yīng)大小也受其添加濃度的影響。本研究中，低濃度的SA（0.1 mg/L）明顯提高了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中雷公藤甲素的產(chǎn)量，最高為對(duì)照的3.5倍。同時(shí)，低濃度SA的添加提高了細(xì)胞活力、細(xì)胞生物量積累和總糖消耗量。而高濃度SA（10 mg/L）對(duì)雷公藤甲素積累的影響很小?？梢姡琒A 可以有效誘導(dǎo)雷公藤甲素的積累，而雷公藤甲素的積累與細(xì)胞生長呈現(xiàn)一定的偶聯(lián)。較低濃度的外源SA 處理可通過上調(diào)防御相關(guān)基因表達(dá)來誘導(dǎo)各種重要的次生代謝產(chǎn)物[14-15]。低濃度SA（25 μmol/L、50 μmol/L）誘導(dǎo)的顛茄毛狀根東莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)較對(duì)照顯著增加[16]。而9 mmol/L SA 和12 mg/L 殼聚糖誘導(dǎo)下的寬絲獐牙菜（Swertia paniculata）莖葉培養(yǎng)物中裂環(huán)烯醚萜和黃酮類酣含量最高，更高或更低的誘導(dǎo)子濃度則會(huì)使這些化合物的含量降低[17]。

鑭作為一種重要的稀土元素，對(duì)植物的生長發(fā)育和抗逆性等都具有一定的影響，其常作為非生物誘導(dǎo)子用于植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。如添加20.00 mg/L的LaCl3溶液可使鐵皮石斛中石斛堿含量增加24.53%[18]。稀土元素對(duì)植物生理生化的正、負(fù)效應(yīng)取決于劑量和其它條件，通常，在較低濃度下可刺激細(xì)胞生長和酶活性，但在較高濃度下對(duì)細(xì)胞有毒[19]。本研究中，不同濃度的LaCl3均提高了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中雷公藤甲素含量，隨著LaCl3濃度的降低誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，低濃度LaCl3誘導(dǎo)下的細(xì)胞總糖消耗明顯增加，但低濃度的LaCl3對(duì)雷公藤細(xì)胞活力和細(xì)胞生長的影響較小，反映雷公藤甲素的積累可能不是細(xì)胞增長的結(jié)果，但可能與細(xì)胞糖代謝有一定的關(guān)聯(lián)。本研究的結(jié)果與其它研究有著相似之處，在云南紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中，硝酸鑭濃度為1.15～23 μmol/L時(shí)，促進(jìn)了胞外紫杉醇的生產(chǎn)和胞內(nèi)紫杉醇的合成，其中5.8 μmol/L 硝酸鑭的誘導(dǎo)效應(yīng)最強(qiáng)，在某些低濃度下硝酸鑭對(duì)紫杉細(xì)胞生長顯示出輕微的正效應(yīng)，而更高濃度的硝酸鑭（23.1～46.2 μmol/L）誘導(dǎo)作用較弱[19]。可見，鑭可以用于誘導(dǎo)雷公藤懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中雷公藤甲素的生產(chǎn)，但應(yīng)對(duì)其劑量和其它條件進(jìn)行有效控制。

植物內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子能夠快速、高效和專一地活化細(xì)胞特定次生代謝途徑，已廣泛用于提高植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，如苦豆子內(nèi)生真菌菌液濃縮物使苦豆子組培苗中氧化苦參堿含量得以提高，最高為對(duì)照組的20.9倍[20]。齊鳳慧等[21]在茶條槭懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期加入內(nèi)生真菌（Phomopsissp.）誘導(dǎo)子，使茶條槭細(xì)胞中沒食子酸的含量得到明顯提升，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子可能通過增大細(xì)胞膜透性，促進(jìn)細(xì)胞核有絲分裂，提高無機(jī)鹽離子吸收等多個(gè)方面調(diào)控沒食子酸的合成。真菌誘導(dǎo)子中具有誘導(dǎo)活性的成分主要是其所含有的多糖類物質(zhì)，能夠刺激細(xì)胞代謝產(chǎn)物的合成。本研究中，在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)前期添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子，NS-5菌絲體和NS-17菌絲體誘導(dǎo)子均明顯促進(jìn)了雷公藤甲素的生產(chǎn)，兩者對(duì)細(xì)胞生長和總糖消耗呈現(xiàn)輕微的正效應(yīng)，雷公藤甲素的積累與細(xì)胞生長沒有明顯的關(guān)聯(lián)；在細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期添加各誘導(dǎo)子均提高了雷公藤甲素的含量，最高是對(duì)照的1.8～2.4倍。無論是細(xì)胞培養(yǎng)前期添加還是對(duì)數(shù)生長期添加，NS-5 菌絲體提取物的誘導(dǎo)作用均是最強(qiáng)的?？梢?，內(nèi)生真菌可作為誘導(dǎo)子用于懸浮細(xì)胞雷公藤甲素的生產(chǎn)，而誘導(dǎo)效應(yīng)的大小即與內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子和添加時(shí)間有關(guān)。不同添加時(shí)間對(duì)活性產(chǎn)物合成的影響可能與細(xì)胞的代謝活動(dòng)有關(guān)。李萍等[5]指出，在細(xì)胞生長前期細(xì)胞還沒有形成足夠的前體用于合成代謝需要的各種酶；在對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞代謝活動(dòng)旺盛，對(duì)誘導(dǎo)子比較敏感；在生長遲緩期，細(xì)胞代謝水平下降，誘導(dǎo)子對(duì)代謝產(chǎn)物的合成影響很小，因此在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期添加誘導(dǎo)子往往誘導(dǎo)效應(yīng)更強(qiáng)。

PAL是苯丙烷類途徑中第一個(gè)酶，也是連接初生代謝和次生代謝的關(guān)鍵酶，對(duì)植物的生理狀態(tài)十分敏感，PAL活性的激活是植物細(xì)胞受到生物和非生物脅迫常見的反應(yīng)[22]。在紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中，各種生物和非生物因子，如重金屬離子、真菌誘導(dǎo)子、茉莉酸甲酯和機(jī)械應(yīng)力等的誘導(dǎo)提高了PAL活性[23-25]。本研究中，SA及LaCl3的添加明顯提高了雷公藤懸浮細(xì)胞PAL活性，在對(duì)數(shù)生長期PAL活性最大；而內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子的添加則使PAL活性呈現(xiàn)先增后降再增加的變化，對(duì)數(shù)生長期PAL活性呈現(xiàn)抑制狀態(tài)。SA及LaCl3添加對(duì)PAL活性明顯的促進(jìn)作用表明，SA 及LaCl3誘導(dǎo)的PAL活性直接或間接上調(diào)可能是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中雷公藤甲素產(chǎn)量得以提高的原因之一。而內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子促進(jìn)雷公藤甲素在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)積累的同時(shí)，PAL活性并未明顯升高，由此推測內(nèi)生真菌誘導(dǎo)的雷公藤甲素的合成可能與PAL酶無關(guān)。

綜上所述，不同誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤懸浮細(xì)胞中雷公藤甲素積累均具有一定的促進(jìn)作用。本研究中0.1 mg/L SA提高雷公藤懸浮細(xì)胞活力、細(xì)胞生物量、總糖消耗量及PAL活性的同時(shí)促進(jìn)了雷公膠甲素的積累，最高含量為對(duì)照的3.5 倍；LaCl3對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中雷公藤甲素積累的誘導(dǎo)作用隨著其濃度的降低而增強(qiáng)，最高含量為對(duì)照的2.0倍；內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子中的NS-5菌絲體提取物對(duì)雷公藤甲素積累的誘導(dǎo)效果最好，最高含量是對(duì)照2.4倍。本研究的結(jié)果可為雷公藤甲素的擴(kuò)大化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。