黃慶陽,楊 帆,謝立紅,曹宏杰,羅春雨,王繼豐,焉志遠,倪紅偉

1 黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所, 哈爾濱 150040

2 濕地與生態(tài)保育國家地方聯(lián)合工程實驗室, 哈爾濱 150040

3 黑龍江省林業(yè)科學院, 哈爾濱 150081

微生物作為地球最早出現(xiàn)的生命形式,決定了地球演化的方向和進程,推動了土壤的發(fā)生和發(fā)育[1]。土壤細菌作為土壤微生物中種類和數量最多的類群,參與了大部分土壤生態(tài)過程,如地球化學循環(huán)、能量流動以及信息傳遞等[2-3]。土壤細菌對環(huán)境變化十分敏感,其群落組成和多樣性會對環(huán)境條件改變迅速響應,是評價土壤環(huán)境質量的重要指標[4]。良好的土壤細菌結構和較高的細菌多樣性能夠提高細菌活性,改善土壤理化性質,對土壤營養(yǎng)循環(huán)的貢獻就可能越大[4- 5]。

火山噴發(fā)后生物地球化學循環(huán)和植被更新演替都發(fā)生了改變,原生演替從裸巖重新開始[6],包括植被、土壤和微生物等各種生態(tài)過程?；鹕酵寥纴碓从诨鹕饺蹘r和火山灰,富含大量的微量元素和金屬元素,與世界其他類型的土壤具有明顯的差異特征,可能導致不同的微生物活性[7-8]。

火山土壤微生物的研究常見于Biolog微孔板法、磷脂脂肪酸法(PLFA)等傳統(tǒng)方法,較多集中在日本富士火山[7]、美國圣海倫火山[9]和五大連池火山群[10-11]等火山活躍區(qū)。Yoshitake[6]認為火山演替初期土壤微生物量和微生物多樣性較低,并隨著演替的進行逐漸增高,與土壤氮、碳等養(yǎng)分有顯著相關；Xu等[10]和曹宏杰[11]認為五大連池新、老期火山的土壤微生物量具有顯著差異,以上研究說明火山土壤微生物量受到土壤環(huán)境和土壤養(yǎng)分的顯著影響。近年來,高通量測序技術廣泛應用于微生物群落結構和多樣性的研究[12-13],研究發(fā)現(xiàn)火山中的變形菌門、酸桿菌門和放線菌門等優(yōu)勢菌,均與來自巖心的火成巖玄武巖有關,說明土壤細菌群落結構受到火成巖基質的影響[6,14]。潘虹等認為五大連池不同火山礦泥中古菌和細菌群落結構具有顯著差異,并且存在大量潛在新種[15-16]。

五大連池火山群具備原生而完整的植被生態(tài)演替過程,是研究火山生態(tài)系統(tǒng)中植物、土壤與微生物等諸多科學問題難得的科研基地,但有關五大連池火山土壤細菌群落結構和多樣性的研究未見報道。土壤細菌的空間分布格局存在顯著的生境依賴性特征,受土壤性質、植被、氣候等多種環(huán)境因素的綜合影響,因此本研究選取同一氣候條件下,新、老期火山相同植被類型(山楊-白樺林)的土壤為研究對象,采用高通量測序的方法測定分析土壤細菌群落結構和多樣性,結合土壤理化指標,探討五大連池火山土壤細菌群落多樣性和群落結構及其關鍵影響因子,為火山生態(tài)系統(tǒng)植被和土壤發(fā)育規(guī)律提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

五大連池位于中國黑龍江省,跨越300年至200萬年間,形成了不同時間和空間格局的14座火山,包括2座新期火山(至今300年,保存著熔巖地貌)、12座老期火山(17萬年—200萬年),是中國保存最為完好的內陸火山遺跡[17]。五大連池山口湖地質公園位于火山群的東南部,處于孫吳斷裂帶上,是由斷裂形成的以花崗巖為主的低山丘陵[18]。五大連池地區(qū)屬于溫帶大陸性季風氣候,年均氣溫-0.5℃,年平均降水量473 mm,年無霜期121 d,地帶性土壤類型為暗棕壤[19]。五大連池植被屬于溫帶闊葉混交林,但兼有寒溫帶針葉林區(qū)域和溫帶森林草原區(qū)域的部分屬性,主要優(yōu)勢植物有山楊(Populusdavidiana)、白樺(Betulaplatyphylla)、黑樺(Betuladahurica)、蒙古櫟(Quercusmongolica)、香楊(Populuskoreana)和落葉松(Larixgmelinii)等。

1.2 土壤樣品采集與處理

2019年7月在五大連池新期火山(NV)、老期火山(OV)和山口湖地質公園(非火山噴發(fā),Non-V)(表1),選擇山楊-白樺林進行土壤樣品采集,火山熔巖臺地土壤很薄,部分僅有10 cm左右,因此以0—10 cm土壤層中作為取樣對象[21]。在每個樣地內選取5個20 m×20 m的樣方,移除表面凋落物和腐殖質層,梅花狀5點法采集0—10 cm厚度的土壤,充分混合后過2 mm尼龍篩并分成3份,一份-80℃保存用于土壤細菌測定；一份土壤自然風干用于土壤總碳、總氮和總磷的測定,一份土壤4℃保存用于土壤含水量、pH、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和速效磷的測定,室內試驗于2019年8月完成。

表1 研究樣地的基本情況Table 1 General characteristic of the study areas

1.3 土壤理化性質測定

土壤pH的測定采用電極電位法；土壤含水量采用烘干法；有機質(Soil Organic Matter, SOM)和全氮(Total Nitrogen, TN)采用CN元素分析儀測定；銨態(tài)氮(Ammonia Nitrogen, AN)和硝態(tài)氮(Nitrate Nitrogen, NN)采用流動分析儀測定；全磷(Total phosphorus, TP)和有效磷(Available Phosphorous, AP)采用鉬銻抗比色法測定。

1.4 土壤細菌 DNA 提取、處理及上機流程

利用土壤試劑盒(MoBio PowerSoil, USA)提取土壤總DNA,細菌16S rRNA 擴增引物采用特異引物(515F/806R),物種分類采用silva128/16s_bacteria的細菌數據庫進行比對和鑒定。高通量測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成,生物信息學分析利用微生物多樣性V4.0云平臺完成。微生物多樣性數據已提交到美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數據庫,獲得登記號PRJNA716727。

1.5 數據統(tǒng)計分析

細菌多樣性采用Shannon 指數、Simpson 指數、Chao 1 指數和Ace 指數表征,利用 SPSS 19.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA),采用最小顯著差異法(Least Significant Difference, LSD)比較數據組間的差異。采用非度量多維尺度分析(Non-metric Multidimensional Scaling Analysis, NMDS) 和非參數檢驗(Analysis of similarities, Anosim)研究樣本間群落組成的相似性或差異性。用皮爾森相關系數(Pearson)評定不同因子間的相關性。采用R語言進行去趨勢對應分析(Detrended Correspondence Analysis, DCA),根據梯度值確定冗余分析(Redundancy Analysis, RDA),用ggplot作圖。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

新、老期火山和非火山的土壤理化性質具有顯著差異(表2),三個樣地土壤pH均呈弱酸性,老期火山土壤pH最大,非火山的土壤pH最?。蝗齻€樣地中土壤有機質、全氮、全磷、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮具有顯著差異,變化趨勢相同,表現(xiàn)為老期火山>非火山>新期火山；新期火山的土壤含水量和速效磷顯著低于老期火山和非火山。

表2 新、老期火山和非火山的土壤理化性質Table 2 Soil physical and chemical characteristics in new volcano, old volcano and non-volcano

2.2 土壤樣品測序結果及取樣深度驗證

土壤樣品通過優(yōu)化過濾低質量序列后得到有效序列總數為430240,序列長度410—440 bp。三個樣地土壤細菌的稀釋性曲線均趨向平緩(圖1),且土壤測序的Coverage 指數均大于0.994(表2),表明樣品取樣合理,已經能夠反映供試土壤樣品的微生物群落組成。

圖1 相似度為0.97條件下各土壤樣品的稀釋性曲線Fig.1 Rarefation curves of each soil sample at similarity of 0.97 NV: 新期火山 New volcano; OV: 老期火山 Old volcano；Non-V: 非火山 Non volcano

在97% 相似度下進行OTUs聚類,三個樣地土壤細菌共得到941個OTUs(圖2),共有OTUs總數為713個,約占全部OTUs的75.77%。新、老期火山和非火山的土壤細菌OTUs總數分別為852、820和879個,表現(xiàn)為非火山>新期火山>老期火山。

圖2 新、老期火山和非火山細菌群落的OTUs比較 Fig.2 OTUs comparison of bacteria in new volcano, old volcano and non-volcanoOTUs：操作分類單元Operational taxonomic units

2.3 土壤細菌群落多樣性

不同采樣點土壤細菌Ace 指數、 Chao1 指數和 Simpson 指數具有顯著差異,變化趨勢一致表現(xiàn)為非火山>新期火山>老期火山,三個樣地土壤細菌Shannon 指數無顯著差異(表3)。

表3 新、老期火山和非火山多樣性指數Table 3 Diversity index analysis of new volcano, old volcano and non-volcano

β多樣性分析表明不同生境中的細菌群落相似性差異較大(圖3)。其中,新期火山和非火山的細菌群落差異最小,樣品間差異指數僅為0.43；新期火山和老期火山的細菌群落樣品相似性次之,樣品間差異指數為0.56；老期火山和非火山的細菌群落差異最大,樣品間差異指數為0.59。

圖3 新、老期火山和非火山土壤細菌beta多樣性分析 Fig.3 Analysis of beta diversity of soil bacteria in new volcano, old volcano and non-volcano

2.4 土壤細菌群落結構分析

在門上水平,新、老期火山和非火山土壤分別檢測出17、18和17個細菌類群,三個樣地的土壤細菌群落組成基本一致,共有細菌16個類群,其中相對豐度≥1%的類群有10個(圖4),包括變形菌門(Proteobacteria)(41.64%,32.64%,43.35%),放線菌門(Actinobacteria)(29.29%,40.09%,29.80%),酸桿菌門(Acidobacteria) (13.67%,7.84%,11.43%),綠彎菌門(Chloroflexi)(6.23%,9.69%,3.84%),擬桿菌門(Bacteroidetes)(3.14%,2.09%,3.20%),Patescibacteria(2.72%,0.29%,2.79%),疣微菌門(Verrucomicrobia)(0.58%,3.29%,1.32%),Rokubacteria(0.10%,2.41%,0.10%),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(1.07%,0.69%,0.97%),浮霉菌門(Planctomycetes)(0.73%,0.23%,1.50%)。其中變形菌門和酸桿菌門在三個樣地土壤中相對豐度均大于10.0%,顯著高于其他細菌,是細菌中的優(yōu)勢菌門。

圖4 新、老期火山和非火山土壤門水平細菌相對豐度Fig.4 Soil bacteria relative abundance of the phylum level in new volcano, old volcano and non-volcano不同小寫字母間表示差異顯著(P<0.05);Proteobacteria: 變形菌門; Actinobacteria: 放線菌門; Acidobacteria: 酸酐菌門; Chloroflexi: 綠彎菌門; Bacteroidetes: 擬桿菌門; Verrucomicrobia: 疣微菌門; Gemmatimonadetes: 芽單胞菌門; Planctomycetes; 浮霉菌門;ns: 無顯著性 No significant

三個樣地土壤中酸桿菌門(P<0.05)、Patescibacteria(P<0.05)、疣微菌門(P<0.01)和Rokubacteria(P<0.05)具有顯著差異或極顯著差異,其中老期火山土壤酸桿菌門、疣微菌門、Rokubacteria具有最大值；而老期火山土壤Patescibacteria的相對豐度最小。

2.5 土壤群落結構差異性分析

利用非度量多維尺度法(NMDS)分析土壤細菌群落物種組成上的差異性,結果顯示脅強系數Stress為0.025,可以準確反應樣品組間的差異程度(圖5)。三個樣地土壤細菌群落明顯分開,形成不同的類群,空間差異顯著(R=0.684,P=0.001),組間差異遠大于組內差異。

圖5 基于OTUs 水平的Bray-Curtis 的非度量多維尺度和相似性分析Fig.5 Analysis of nonmetric multidimensional scaling and similarity at the OTUs level of bacterial communitiesNMDS: 非度量多維尺度分析 Non-metric multidimensional scaling analysis；Between: 類群之間

2.6 土壤細菌與土壤因子的關系

土壤細菌Ace 指數、Chao1 指數和Simpson 指數與土壤pH呈顯著負相關(P<0.05),其他多樣性指數與土壤因子無顯著相關性(P>0.05) (表4)。

表4 細菌群落多樣性與土壤理化性質的Pearson相關性分析Table 4 Pearson correlation coefficients between soil bacteria α-diversity indices and soil physicochemical properties

在門水平,變形菌門平均相對豐度與pH 和硝態(tài)氮呈顯著負相關(P<0.05)；放線菌門與pH呈顯著正相關(P<0.05),與有機質、全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮呈極顯著正相關(P<0.01)；綠彎菌門與pH呈顯著正相關(P<0.05)；擬桿菌門和Patescibacteria與pH、有機質、全氮、銨態(tài)氮呈顯著負相關(P<0.05),與硝態(tài)氮呈極顯著負相關(P<0.01)；Rokubacteria與pH、有機質、全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮呈極顯著正相關(P<0.01)；芽單胞菌門與有機質、全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮呈極顯著負相關(P<0.05),可見,土壤pH、有機質、全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮對門水平細菌群落組成的影響程度較大(表5)。

表5 優(yōu)勢細菌類群與土壤因子相關性分析Table 5 Correlation coefficients between dominant bacteria groups and edaphic factors

趨勢對應分析(DCA)第一排序軸的梯度長度小于3,采用冗余分析(RDA)解釋細菌群組成與土壤因子的關系,結果顯示：前兩軸累計方差解釋比88.60%,能較為完整地反映排序信息(圖6)。土壤因子與第一排序軸相關性按相關系數(絕對值)的大?。合鯌B(tài)氮>pH值>有機質>全氮>銨態(tài)氮>全磷>含水量>速效磷。

圖6 門水平細菌群落組成與土壤環(huán)境因子的典型相關分析 Fig.6 Canonical correlation analysis of soil bacteria community compositions of the phylum level and soil factorRDA: 冗余分析 Redundancy analysis; WC: 土壤含水量Soil water content; SOM: 有機質Soil organic matter; TN: 全氮 Total nitrogen; TP: 全磷 Total phosphorus; AP: 速效磷 Available phosphorus; AN: 銨態(tài)氮 Ammonia nitrogen; NN: 硝態(tài)氮 Nitrate nitrogen

3 討論

本研究中,新期火山土壤中有機質、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、全磷和速效磷顯著低于老期火山,表明火山噴發(fā)后隨著演替的正向進行,土壤養(yǎng)分含量逐漸升高,這可能是因為隨著年代的逐漸增加,土壤發(fā)育程度加深,有機質不斷積累[22]。另外新期火山的熔巖表面干燥、平坦、裸露度較高不易留存凋落物,凋落物稀少導致輸入土壤中有機營養(yǎng)和無機含量缺乏[6]。非火山-山口湖地質公園的土壤的有機質、全氮、全磷、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮與新、老期火山土壤具有顯著差異,這可能是因為養(yǎng)分主要與成土母質、風化程度、淋溶強度有關[22],五大連池火山群的噴發(fā)物質均來自第四紀火山活動形成的巖漿源[23],具有玄武巖性質,而非火山-山口湖地質公園的土壤由花崗巖風化而成。Wang[24]也認為在植被與土壤協(xié)同演化的過程中,不同森林生態(tài)系統(tǒng)中的土壤理化性質呈現(xiàn)一定的差異。因此,五大連池火山土壤理化性質受到凋落物數量和火山噴發(fā)時間、火山成土母質等火山特性的共同影響。

β多樣性可以度量動、植物和微生物等群落物種組成隨環(huán)境梯度的變化程度[25]。Bray-Curtis 距離分析顯示新期火山、老期火山與非火山細菌群落相似性差異較大,但結果并不符合細菌群落β多樣性隨地理距離的增加而降低的模型[26],這可能與火山噴發(fā)出的特性或者巖漿成分有關。毛翔[27]認為五大連池火山噴發(fā)帶中的一條E-W方向的斷裂帶,將老期火山東焦得布山、臥虎山和藥泉山劃分為五大連池南側的構造單元,導致通過該斷裂帶噴出的深層巖漿或變質物質與該地區(qū)所屬的松遼盆地并不十分一致[28],因此有可能導致東焦得布山與非火山和新期火山的土壤微生物差異較大。

在不同的森林生態(tài)系統(tǒng)中,土壤主要的微生物群落組成基本上是近似的[5,29],本研究土壤中變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和擬桿菌門的相對豐度較高,是五大連池火山土壤中的優(yōu)勢菌類,與其他森林生態(tài)系統(tǒng)差別不大。而五大連池火山爆發(fā)這種劇烈的擾動,改變了沉積層火山物質組分,導致微生物代謝類型及功能的多樣性,進而影響細菌的群落結構[7]。變形菌門已經被證實與來自巖心的玄武巖有關[30-31],具有增強玄武巖的風化作用和能夠在貧瘠環(huán)境生長的能力[32],并被視為在玄武巖環(huán)境中作為碳源和氮源關鍵的細菌類群,可以浸出磷和硫元素；老期火山土壤中放線菌門和疣微菌門的相對豐度顯著高于新期火山和非火山土壤,這可能與玄武巖性質有關系,疣微菌門也被證實與北極環(huán)境中玄武巖風化作用有關[33]。

地上植被、土壤環(huán)境因子以及土壤理化性質與土壤微生物之間存在著復雜的關系網[34]。本研究中土壤pH與3種細菌多樣性和6種細菌類群具有顯著或極顯著的相關性,這說明土壤pH是土壤細菌多樣性和群落結構的重要控制因子,Zhu等[35]和Shen等[36]在干旱或者潮濕等多種生態(tài)環(huán)境中,也得到了相同的結論。土壤有機質、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮等與放線菌門、擬桿菌門和Patescibacteria等細菌類群也有顯著的相關性,說明森林演替過程中土壤有機質和氮素變化與細菌群落組成變化密切相關[4],這是由于地上凋落物成分、質量影響土壤表層有機質和氮含量的變化,導致土壤微生物群落結構存在差異[37]。曹永昌[38]也認為在土壤發(fā)育初期積累的碳顯著高于氮,氮素成為土壤中微生物生長的限制因素。

4 結論

五大連池火山土壤細菌Ace 指數、Chao1 指數和Simpson 指數均顯著低于非火山土壤；新、老期火山和非火山土壤細菌包括變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門等優(yōu)勢菌門,但三個樣地土壤細菌群落空間差異顯著,其中酸桿菌門、Patescibacteria、疣微菌門和Rokubacteria是差異菌群?；鹕絿姲l(fā)是一種劇烈的大規(guī)模擾動形式,噴發(fā)時間和火成巖基質等特性會導致不同火山土壤理化性質的差異,進而影響土壤細菌多樣性和群落結構。我們認為土壤pH、有機質和氮含量是驅動五大連池火山森林生態(tài)系統(tǒng)土壤細菌多樣性和群落結構變化重要的影響因子。