齊世杰　趙靜娟　鄭懷國

摘要：全球作物生物育種已進(jìn)入至關(guān)重要的、以搶占技術(shù)制高點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)為目標(biāo)的戰(zhàn)略機(jī)遇期，基礎(chǔ)研究是科技創(chuàng)新的重要途經(jīng)，明晰全球生物育種領(lǐng)域的研究前沿和發(fā)展方向，對我國作物生物育種發(fā)展來說具有迫切性和必要性?；贓SI數(shù)據(jù)平臺，經(jīng)專家咨詢對全球生物育種領(lǐng)域研究前沿和核心論文進(jìn)行遴選與解讀，借助DDA分析工具，采用計量分析和數(shù)據(jù)挖掘方法，從期刊、國家、機(jī)構(gòu)及合作、研究方向等角度對核心論文進(jìn)行全方位的深入剖析。Plant Biotechnology Journal是作物生物育種領(lǐng)域前沿的代表期刊;美國和中國是全球重點(diǎn)研究國家;我國代表性研究機(jī)構(gòu)優(yōu)勢顯著，但影響力有待提升，可根據(jù)機(jī)構(gòu)特色研究方向，有針對性地積極開展跨國合作;基因編輯技術(shù)、堿基編輯等生物育種技術(shù)及應(yīng)用是重點(diǎn)關(guān)注的研究前沿。

關(guān)鍵詞：作物生物育種;研究前沿;高被引論文;文獻(xiàn)計量;DDA;基因編輯技術(shù);基因組學(xué);高通量表型平臺

中圖分類號：S336 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2021）19-0009-10

農(nóng)作物種業(yè)是國家戰(zhàn)略性、基礎(chǔ)性核心產(chǎn)業(yè)，事關(guān)糧食安全、民族興衰。種業(yè)發(fā)展可以分為4個階段：第1階段：農(nóng)家育種時代;第2階段：雜交育種時代;第3階段：分子育種時代;第4階段：“生物技術(shù)+人工智能+大數(shù)據(jù)信息技術(shù)”育種時代[1]。發(fā)達(dá)國家已經(jīng)進(jìn)入第2階段至第3階段之間。2021年，生物育種作為前瞻性、戰(zhàn)略性國家重大科技項(xiàng)目之一，被寫入國家“十四五”規(guī)劃綱要，是種子產(chǎn)業(yè)變革的重大舉措。育種基礎(chǔ)科學(xué)創(chuàng)新能力的提升從源頭上支撐了我國現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展[2]。因此，把握全球作物生物育種研究熱點(diǎn)，追蹤作物生物育種技術(shù)前沿，對于管理決策者和研究者都具有十分重要的意義。

生物育種是利用遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、現(xiàn)代生物工程技術(shù)等方法原理培育生物新品種的過程，主要包括轉(zhuǎn)基因育種、分子輔助標(biāo)記、分子設(shè)計育種、基因組學(xué)育種，以及基因編輯育種。近年來，隨著高通量測序平臺、計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，作物生物育種研究獲得了重大的突破。通過跟蹤全球的研究前沿與核心論文，從期刊、資助基金、學(xué)科領(lǐng)域、國家、機(jī)構(gòu)進(jìn)行多維度分析，有助于對作物生物育種的研究前沿進(jìn)行全方位的了解，進(jìn)而揭示領(lǐng)域熱門研究和技術(shù)前沿的主要貢獻(xiàn)者和潛在合作者。

研究前沿能提供一個獨(dú)特的視角來揭示作物生物育種的研究脈絡(luò)，可以簡明扼要地概括該領(lǐng)域的最新進(jìn)展和前沿技術(shù)，為未來研究方向的把握拓展奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源及范圍

基本科學(xué)指標(biāo)（Essential Science Indicators，簡稱ESI）數(shù)據(jù)庫是科睿唯安在匯集和分析Web of Science核心合集（SCIE、SSCI）所收錄的學(xué)術(shù)文獻(xiàn)及其所引用的參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上建立起來的分析型數(shù)據(jù)庫。研究前沿（Research Frontier）是基于該數(shù)據(jù)庫中近5年內(nèi)的高被引論文的引證關(guān)系，采用共被引分析計算得出，這1組高被引論文稱為“核心論文”，每2個月更新1次[3]。這些論文及相關(guān)研究受到了同行高度認(rèn)可和關(guān)注，代表著該領(lǐng)域最具影響力和發(fā)展前景的研究方向。研究前沿的遴選工作基于ESI數(shù)據(jù)庫中的研究前沿以及前沿所對應(yīng)的核心論文，數(shù)據(jù)截至2020年6月。

1.2研究前沿遴選

利用ESI數(shù)據(jù)庫，經(jīng)專家研討和文獻(xiàn)分析，為保證查全率，首先篩選出與“作物生物育種”相關(guān)的研究前沿137個，作為研究前沿遴選的基礎(chǔ)數(shù)據(jù);然后建立情報專家和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)＜覉F(tuán)隊，對137個前沿進(jìn)行2輪反復(fù)研討，剔除不相干前沿36個，以研究前沿對應(yīng)的核心論文超過5篇為篩選目標(biāo)，經(jīng)過剔除和合并，最終確定了5個研究前沿，并獲得研究前沿與前沿對應(yīng)的核心論文103篇。

2研究前沿計量分析

2.1核心論文概況

對作物生物育種領(lǐng)域ESI研究前沿核心論文103篇進(jìn)行分析，主要分布在2014—2019年，發(fā)文量分別是21、12、20、24、11、15篇。學(xué)科方向主要涉及植物科學(xué)62篇，科學(xué)、技術(shù)等多學(xué)科科學(xué)20篇，生物化學(xué)與分子生物學(xué)16篇、生物技術(shù)應(yīng)用微生物學(xué)16篇、遺傳學(xué)13篇。103篇核心文獻(xiàn)中，基金資助論文94篇，基金資助率達(dá)到92%，主要資助機(jī)構(gòu)為中國國家自然科學(xué)基金（NSFC）、英國生物技術(shù)與生物科學(xué)研究委員會（BBSRC）、美國國家科學(xué)基金會（NSF）、中國科學(xué)院基金項(xiàng)目以及澳大利亞研究委員會。

2.2主要來源出版物

研究前沿論文的來源期刊共有41本，其中既包括《Nature Communications》《Science》等綜合性頂級期刊，也包括生物、農(nóng)業(yè)、遺傳學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的專業(yè)期刊，如《Plant Science》（植物科學(xué)）、《Fungal Genetics and biology》（遺傳學(xué)）等。其中發(fā)表3篇及以上的期刊如表1所示，《Plant Biotechnology Journal》期刊刊載的論文數(shù)量最多，為15篇，反映了該刊在作物生物育種領(lǐng)域具有較強(qiáng)的專業(yè)性和前瞻性，刊載的論文對該領(lǐng)域的發(fā)展方向具有一定的引領(lǐng)作用，是作物生物育種領(lǐng)域研究前沿的重要來源期刊。其次是《Plant Physiology》《Plant Science》《Trends in Plant Science》3本專業(yè)性期刊，以及《Nature Communications》和《Science》2本綜合性期刊，載文量均為5篇，也是作物生物育種領(lǐng)域研究前沿的代表性期刊。

2.3重點(diǎn)代表國家

從統(tǒng)計數(shù)據(jù)來看，作物生物育種領(lǐng)域的熱點(diǎn)前沿論文共涉及39個國家/地區(qū)，利用數(shù)理統(tǒng)計和 TF-IDF 算法對排名前10的11個國家的發(fā)文量、篇均被引頻次和主要關(guān)鍵詞進(jìn)行計算，從數(shù)量、影響力和研究內(nèi)容3個方面，對該領(lǐng)域研究前沿的主要國家進(jìn)行深入分析（圖1、表2）。

從文章數(shù)量來看，美國是本領(lǐng)域研究前沿核心論文的主要來源國家，共發(fā)表論文44篇，中國37篇排名第2。 以上2個國家位于第1梯隊， 遙遙領(lǐng)先

于其他國家，是作物生物育種領(lǐng)域研究前沿的突出代表國。德國、英國、法國和澳大利亞位于第2梯隊，發(fā)文量占10%以上，是該領(lǐng)域歐洲和大洋洲的主要代表國家。加拿大、以色列、意大利等5個國家位于第3梯隊，以亞洲、歐洲和北美國家為主。

從篇均被引頻次（圖1折線）和研究主題（表2）來看，加拿大排名第1，篇均被引頻次超出排名第2的意大利（333次）100余次，一定程度上反映出加拿大在生物育種領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究具有較高質(zhì)量和影響力，特別是在多倍體（小麥）基因組、基因組學(xué)育種方面。意大利、以色列和澳大利亞位于第2梯隊，篇均被引頻次在300～400次之間，競爭優(yōu)勢顯著，且具有“少而精”的發(fā)文特點(diǎn)，具有較大的發(fā)展?jié)摿秃献骺臻g，研究主題集中在利用QTL技術(shù)對番茄和水稻進(jìn)行作物改良方面。法國、英國、美國、德國和中國位處第3梯隊，篇均被引頻次在200～300次之間，具有發(fā)文活躍、研究方向多元化、影響力一般的發(fā)文特點(diǎn)，整體發(fā)展較好，特別是中國、美國2個農(nóng)業(yè)大國，已經(jīng)率先在CRISPR/Cas9 技術(shù)、基因編輯等生物育種技術(shù)方面進(jìn)行探索，也開展了復(fù)雜農(nóng)藝性狀的相關(guān)研究，相對而言，影響力有待進(jìn)一步提升。日本、墨西哥位處第5梯隊，處于追趕的狀態(tài)，在提升優(yōu)良小麥群體產(chǎn)量、植物表型鑒定方面表現(xiàn)突出

2.4重要研究機(jī)構(gòu)及合作

作物生物育種領(lǐng)域的研究前沿共有280個研究機(jī)構(gòu)主導(dǎo)或參與，利用DDA分析工具，采用TF-IDF算法對前10個機(jī)構(gòu)的研究主題詞進(jìn)行提取，并繪制出10個機(jī)構(gòu)的合作情況（表3、圖2）。

全球作物生物育種領(lǐng)域研究前沿前10個機(jī)構(gòu)中包括6所高等院校和4個科研院所，發(fā)展較為均衡。從發(fā)文數(shù)量（表3）來看，前10個研究機(jī)構(gòu)具有明顯的階梯特征，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)表的前沿核心論文最多，研究集中在復(fù)雜農(nóng)藝性狀、甘藍(lán)型油菜、作物馴化、全基因組關(guān)聯(lián)方面，產(chǎn)出能力較強(qiáng)，處于世界領(lǐng)先地位。美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究院排名第2，在遺傳多樣性、基因分型、多倍體小麥、單核苷酸多態(tài)性方面表現(xiàn)突出，以上2個機(jī)構(gòu)位于第1梯隊，是該領(lǐng)域基礎(chǔ)研究的主要產(chǎn)出機(jī)構(gòu)。中國科學(xué)院和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)位于第2梯隊，科研氛圍較為活躍，特別是在QTL、CRISPR/Cas9、基因編輯技術(shù)、基因組工程、異源四倍體等育種技術(shù)方面，研究對象包括小麥、水稻、番茄、棉花，是我國作物生物育種領(lǐng)域的代表性研究機(jī)構(gòu)。其他機(jī)構(gòu)位于第3梯隊，發(fā)文量相差不大，但研究方向各有不同，法國國家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院側(cè)重在QTL和全基因組關(guān)聯(lián)分析[4]，以及作物生長模型和基因組預(yù)測[5]方面;加州大學(xué)戴維斯分校在多倍體小麥的基因分型、基因編輯技術(shù)在香蕉抗病性育種[6]、提升油茶品質(zhì)[7]中的應(yīng)用有所突破;約翰·英納斯研究中心在下一代測序技術(shù)、六倍體小麥的基因分型[8-9]陣列進(jìn)行相關(guān)探究;國際玉米和小麥改良中心在利用遙感、無人機(jī)等智能育種技術(shù)方面有所進(jìn)展[10-12];堪薩斯州立大學(xué)在基因組育種方法[13-14]上進(jìn)行了探究。

結(jié)合篇均被引頻次分析，法國國家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（351次）排名第1，在本領(lǐng)域具有較強(qiáng)的影響力和行業(yè)關(guān)注度。加州大學(xué)戴維斯分校和堪薩斯州立大學(xué)，屬于“少而精”的研究機(jī)構(gòu)，競爭優(yōu)勢顯著，能夠引起同領(lǐng)域科研人員的高度關(guān)注。其次是美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究院和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，能夠兼顧論文的數(shù)量與質(zhì)量，整體發(fā)展相對較好。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國科學(xué)院2個機(jī)構(gòu)，相對于發(fā)文量而言，其篇均被引頻次表現(xiàn)一般，仍有一定的發(fā)展?jié)摿蜕仙臻g。但整體而言，排名前5位的研究機(jī)構(gòu)中我國機(jī)構(gòu)占據(jù)3個，證明我國研究機(jī)構(gòu)的力量十分雄厚。約翰英納斯研究中心和國際玉米和小麥改良中心處于追趕階段。

作物生物育種領(lǐng)域研究前沿Top10機(jī)構(gòu)的合作情況見圖2，圖2中節(jié)點(diǎn)代表研究機(jī)構(gòu)，節(jié)點(diǎn)大小代表發(fā)文量的多少，連線的實(shí)虛代表合作的強(qiáng)弱。從圖2可以看出，重要機(jī)構(gòu)間合作呈現(xiàn)出以中、美2國的國內(nèi)合作為主，跨國合作逐步形成的特點(diǎn)，包括2個較為明顯的國內(nèi)合作團(tuán)體：（1）美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究局、堪薩斯州立大學(xué)和加州大學(xué)戴維斯分校之間較強(qiáng)的合作網(wǎng)絡(luò);（2）以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院為主導(dǎo)的，聯(lián)合中國科學(xué)院、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)之間的合作關(guān)系。此外，康奈爾大學(xué)的國際合作表現(xiàn)突出，在全球各國間起到重要的鏈接作用。約翰英納斯研究中心的合作關(guān)系較弱，偏向于機(jī)構(gòu)內(nèi)部團(tuán)隊間的合作。

3研究前沿重點(diǎn)解析

對全球生物育種領(lǐng)域的五大前沿及前沿對應(yīng)的核心論文信息進(jìn)行整理。從表4可以看出， 全球

生物育種領(lǐng)域的五大前沿分別是：（1）基因組學(xué)分析在作物育種中的應(yīng)用;（2）高效基因編輯技術(shù)及其在作物育種中的應(yīng)用;（3）高通量表型平臺與植物育種;（4）雄性不育與作物雜種優(yōu)勢利用;（5）野生親緣關(guān)系在作物育種中的研究。其中前沿（1）“基因組學(xué)分析在作物育種中的應(yīng)用”核心論文最多，是重點(diǎn)研究前沿。前沿（5）“野生親緣關(guān)系在作物育種中的研究”相對較新，核心論文平均出版年2017年，是新興研究前沿。

3.1基因組學(xué)分析在作物育種中的應(yīng)用

基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展使作物基因組研究取得了突破性進(jìn)展。繼2002年第一個水稻基因組測序完成之后，世界各國已完成或接近完成64種作物的基因組測序。我國是世界上較早啟動作物基因組學(xué)研究的國家，已完成了世界上70%～80%重要作物的基因組測序。此外，還開發(fā)了基于高通量基因組測序的基因型鑒定方法，成功開展了水稻、玉米重要農(nóng)藝性狀的基因組關(guān)聯(lián)分析和功能研究。

分子標(biāo)記輔助育種（MAS）是作物改良的有效手段。研究前沿中首次挖掘出小麥抗赤霉病的TaHRC-R基因[15]和甘藍(lán)型油菜產(chǎn)油量的新的QTL位點(diǎn)[16]，為新品種的培育提供了靶位點(diǎn)和篩選手段。利用高通量SNP芯片技術(shù)、基因分型測序（GBS）以及重測序技術(shù)，結(jié)合表型組、代謝組、蛋白組等組學(xué)技術(shù)，全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）獲得了與性狀直接關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，提供了分子輔助育種候選位點(diǎn)。小麥中，研究人員設(shè)計了35、90[17]、660 K[18]芯片，獲得了產(chǎn)量相關(guān)因素、耐旱性相關(guān)QTLs，提供了檢測基因滲入的SNP位點(diǎn)。番茄中，進(jìn)行了番茄屬的屬間和種間多樣性研究，挖掘出控制番茄風(fēng)味的化學(xué)物質(zhì)以及QTLs，發(fā)現(xiàn)了番茄馴化和改良的過程為2組QTLs，以及大果馴化過程中丟失了的控制風(fēng)味基因，全面揭示了育種是如何全面改變風(fēng)味物質(zhì)的。油菜中，研究人員梳理了甘藍(lán)型油菜進(jìn)化歷史，通過60 K芯片的GWAS分析，獲得植株高度和分支數(shù)的8個QTLs，挖掘到控制產(chǎn)油量的50個QTLs[16]。玉米中，Wen等結(jié)合代謝組，定位到1 459個QTL_s[19]。

基因組學(xué)的發(fā)展催生了基因組選擇（GS）育種技術(shù)，它是一種新型的、針對數(shù)量性狀由微效多基因控制的育種難題的更高效的分子輔助育種方法。研究前沿集中在GS育種方法、GS實(shí)施中的準(zhǔn)則、模型，以及預(yù)測的準(zhǔn)確性方面。通過選擇訓(xùn)練群體，可使水稻開花時間的預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)到63%[20]?；蚪M選擇育種技術(shù)在作物育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2高效基因編輯技術(shù)及其在作物育種中的應(yīng)用

基因編輯是對生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行精確修飾的一種基因工程技術(shù)。目前的基因編輯技術(shù)包括：巨型核酸酶、鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)（CRISPR/Cas）系統(tǒng)。其中CRISPR/Cas因其簡單、高效和多功能性迅速成為基因編輯的首選技術(shù)，廣泛應(yīng)用于研究和生產(chǎn)中。植物CRISPR/Cas基因編輯的首次成功應(yīng)用報道于2013年，隨后，更多植物的CRISPR/Cas基因編輯體系成功建立，為作物品質(zhì)改良提供了全新途徑。

該前沿主要集中在對技術(shù)本身問題的探討以及在作物育種應(yīng)用兩大方面。就技術(shù)本身而言，研究熱點(diǎn)主要集中在作物基因編輯的效率及遺傳穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)化方式的優(yōu)化、基因編輯工具的完善以及CRISPR/Cas9基因編輯監(jiān)管問題;作物基因編輯育種則主要體現(xiàn)在增強(qiáng)作物抗病性、改善作物品質(zhì)等方面。

3.2.1CRISPR/Cas9植物基因組編輯方法、編輯效率及遺傳方式朱建康等檢測了CRISPR/Cas在擬南芥的12個不同靶點(diǎn)針對7個基因的編輯情況，結(jié)果證明，CRISPR/Cas系統(tǒng)在編輯擬南芥基因方面是高效和特異的，編輯后的目的基因可以穩(wěn)定地遺傳。同時他們還測試了2個水稻亞種11個靶基因?qū)RISPR/Cas9誘導(dǎo)的編輯情況，證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中也是高效特異且穩(wěn)定遺傳的[21]。美國研究人員報道了水稻Cas9/sgRNA誘導(dǎo)的大染色體片段缺失，Cas9/sgRNAs在水稻原生質(zhì)體中產(chǎn)生涉及3個不同基因簇的大染色體缺失（115～245 kb），并在再生的T0代植株中驗(yàn)證了2個基因簇的缺失[22]。美國杜邦公司利用Cas9和Guide RNA在玉米和大豆基因組中成功實(shí)現(xiàn)定向突變、精確基因編輯和位點(diǎn)特異性基因的插入[23-24]。

3.2.2避免轉(zhuǎn)基因中間體產(chǎn)生的編輯技術(shù)方面CRISPR/Cas9編輯植物基因組通常涉及轉(zhuǎn)基因中間體，引發(fā)監(jiān)管方面的擔(dān)憂。相關(guān)報道介紹了2種簡單而有效的基因組編輯方法，一種是從以DNA或RNA形式引入的瞬時表達(dá)CRISPR/Cas9的愈傷組織細(xì)胞中再生植株[25];另一種是使用CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNPs）對小麥進(jìn)行基因組編輯[26]。這2種方式獲得的突變體是完全無轉(zhuǎn)基因的，因此可廣泛應(yīng)用于基因組編輯作物的生產(chǎn)，具有很好的商品化前景。此外，美國杜邦公司也采用預(yù)先組裝的Cas9-gRNA核糖核蛋白導(dǎo)入玉米胚細(xì)胞，并再生了具有突變和編輯等位基因的玉米植物[27]。

3.2.3堿基編輯技術(shù)方面基于CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)展起來的新型靶基因修飾技術(shù)堿基編輯技術(shù)，為創(chuàng)造作物堿基突變提供了新的手段，在改變作物基因功能方面具有顯著優(yōu)勢。包括胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，簡稱CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，簡稱ABE）2種。有研究者利用堿基編輯系統(tǒng)成功在水稻、小麥及玉米中實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)堿基編輯[28]。日本研究人員在番茄和水稻中利用CBE堿基編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)C-T （G-A）堿基替換。研究人員分別將人源胞嘧啶脫氨酶替換了大鼠胞嘧啶脫氨酶，大大提高了CBE堿基編輯效率[29]。后續(xù)的研究中，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)CBE堿基編輯器在水稻產(chǎn)生大規(guī)模脫靶，還需要進(jìn)一步優(yōu)化。2018年來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院的研究團(tuán)隊，幾乎同時分別實(shí)現(xiàn)ABE堿基編輯器的成功應(yīng)用。CBE堿基編輯器的編輯效率顯著高于ABE堿基編輯器。張倩倩等利用CBE堿基編輯器成功實(shí)驗(yàn)西瓜ALS基因的堿基突變，獲得世界首例抗除草劑西瓜[30]。常規(guī)CRISPR/Cas9編輯技術(shù)使用化膿性鏈球菌Cas9（SpCas9），需要NGG作為鄰接基序（PAM），大大限制了堿基編輯器的使用范圍。中國科學(xué)院的研究團(tuán)隊使用帶有SpCas9和金黃色葡萄球菌Cas9（SaCas9）變體的新ABES和CBE來繞過這一限制，從而大大增加了水稻基因組中堿基編輯的目標(biāo)范圍。日本研究人員使用SpCas9（SpCas9-NGv1）變體，有效地誘變水稻和擬南芥基因組中的NG PAM的內(nèi)源靶位點(diǎn)且拓展了CBE的堿基識別窗口[31]。

3.2.4基因編輯技術(shù)監(jiān)管、安全性評估方面基因編輯技術(shù)飛速發(fā)展，但與之對應(yīng)的政策法規(guī)的設(shè)立存在一定的滯后性。盡管基因編輯技術(shù)不引入轉(zhuǎn)基因，并且基因編輯作物在多個國家已被認(rèn)定為非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，但對這些新技術(shù)的監(jiān)管、安全性評估標(biāo)準(zhǔn)、大眾接受度及相應(yīng)的立法尚存在很大爭議，各個國家的評判標(biāo)準(zhǔn)也不統(tǒng)一。通過基因編輯進(jìn)行植物育種的快速進(jìn)展要求為新的生物技術(shù)建立新的全球政策，同時填補(bǔ)基于過程和基于產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因法規(guī)之間的空白。德國、日本和美國[32-33]等國家對上述問題開展了一些調(diào)研和探討，建議通過基因編輯或其他未來技術(shù)修改的植物應(yīng)根據(jù)新的性狀和由此產(chǎn)生的最終產(chǎn)品進(jìn)行評估，而不是根據(jù)創(chuàng)造新植物品種所使用的技術(shù)進(jìn)行評估。

3.2.5作物基因編輯育種在增強(qiáng)作物抗病性、改善作物品質(zhì)方面CRISPR/Cas基因編輯育種可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)育種資源從無到有的突破，Macovei等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻東格魯病敏感品種IR64中產(chǎn)生eIF4G突變其中導(dǎo)致SVLFPNLAGKS殘基（主要是NL）與YVV殘基相鄰的框內(nèi)突變的等位基因，使其獲得東格魯病抗性，為培育更多樣化的RTSV抗性品種提供了有價值的材料[34]。Ortigosa等鑒定了AtJAZ2的番茄同源基因，并通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的SlJAZ2編輯成功地在商品品種MoneyMaker中獲得了抗細(xì)菌性斑點(diǎn)病的番茄[35]。Tripathi等利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除香蕉B基因組中香蕉內(nèi)源條紋病毒激活序列。在水分脅迫條件下，與未編輯的對照植物相比，75%的編輯植株保持無癥狀[6]。

在園藝作物單性結(jié)實(shí)的農(nóng)藝性狀方面，Ueta等利用CRISPR/CAS9系統(tǒng)突變單性結(jié)實(shí)的關(guān)鍵基因SlIAA9，獲得單性結(jié)實(shí)番茄純合突變體[36]。利用CRISPR/Cas9敲除SlAGL6，獲得的番茄突變體能夠在嚴(yán)重阻礙受精坐果的熱脅迫條件下產(chǎn)生果實(shí)且無核果實(shí)質(zhì)量和形狀正常，花粉生活力正常并保持有性繁殖能力[37]。

在大米和油茶作物中，Tang等利用CRISPR/CAS9系統(tǒng)敲除金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsNramp5，培育出低Cd積累量、無轉(zhuǎn)基因的秈稻新品系[38]。利用CRISPR/Cas9在2個廣泛栽培的優(yōu)良粳稻品種的Waxy基因中引入功能缺失突變，實(shí)現(xiàn)了在不影響其他理想農(nóng)藝性狀的情況下將水稻轉(zhuǎn)化為糯性水稻。Jiang等利用CRISPR/Cas9靶向新興油料植物山茶中FAD2基因，成功地獲得了油酸含量從脂肪酸組成的16%提高到50%以上的山茶種子[7]。Morineau等通過CRISPR/Cas9基因編輯，實(shí)現(xiàn)了3個δ-12-脫飽和酶（FAD2）基因的選擇性、針對性突變，導(dǎo)致多不飽和脂肪酸水平降低，油酸積累增加[39]。3個FAD2基因座的不同等位基因的組合提供了具有不同脂肪譜的茶樹品系的多樣性，油酸在油中的積累量從10%到62%不等。不同的等位基因組合可以對這個六倍體物種的基因劑量和功能進(jìn)行公正的分析，也為植物育種提供了一個獨(dú)特的遺傳變異來源。

3.3高通量表型平臺與植物育種

高通量表型平臺的出現(xiàn)及發(fā)展可以對植物的表型組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行充分挖掘與分析，最終構(gòu)建與豐富基因組數(shù)據(jù)相匹配的植物表型測量技術(shù)體系。近5年來，高通量作物表型平臺獲得飛速發(fā)展，出現(xiàn)了衛(wèi)星、有人駕駛固定翼飛機(jī)、無人機(jī)、地面移動機(jī)器人、室外移動式龍門架、室內(nèi)流水線及微型CT機(jī)等各類平臺。當(dāng)前熱點(diǎn)集中在自動化機(jī)器人田間表型平臺、無人機(jī)表型平臺、表型信息獲取傳感及分析技術(shù)等方向。

田間高通量表型測量平臺（HTPP）中，Li等建立了具有專用傳感器陣列的全自動機(jī)器人田間表型測量平臺，所用傳感器包括高分辨率可見光成像儀、葉綠素?zé)晒夂蜔峒t外成像儀、高光譜成像儀和3D激光掃描儀[40]。另有1種懸掛式表型測量平臺主要對溫室內(nèi)植物進(jìn)行監(jiān)測，該平臺在距離地面 2～5 m范圍內(nèi)運(yùn)行，并可在惡劣天氣條件下完成高分辨率成像[41]。低成本的無人機(jī)系統(tǒng)（UAS）在近距離快速測量作物表型方面具有巨大潛力。基于無人機(jī)的平臺可在30～100 m的高度獲得高分辨率熱成像和多光譜成像，既能為少量小區(qū)提供高分辨率的測量，也可對成千上萬的小區(qū)進(jìn)行快速評估。

利用高通量表型平臺對作物生育期內(nèi)的冠層發(fā)育進(jìn)行測量研究，發(fā)現(xiàn)冠層高度的廣義遺傳力最高[42]。Zhang等開發(fā)了一套評估溫室入射光空間分布的方法對數(shù)百株玉米進(jìn)行監(jiān)測，利用平臺測量了玉米重組自交系群體（n=167）在16個發(fā)育時期的106個機(jī)器識別性狀[43]。結(jié)合高密度遺傳連鎖圖譜（包括2 496個重組區(qū)）共鑒定到包括已知的3個QTL熱點(diǎn)區(qū)間在內(nèi)的988個QTL。此外，研究發(fā)現(xiàn)UAS平臺獲得的植被指數(shù)VI與地面實(shí)際測量值之間具有較好的相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)VI具有很高的廣義遺傳性[10]。該高空作業(yè)平臺能夠有效評估低氮脅迫下的農(nóng)作物表現(xiàn)，光譜成像和地面測量的歸一化植被指數(shù)（NDVI）數(shù)據(jù)均表明農(nóng)作物衰老指數(shù)和谷物產(chǎn)量之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性。

在作物表型預(yù)測中，為了評估高通量表型數(shù)據(jù)的效用，科研人員等提出了候選G2P模型用于整合大量基因組和新表型數(shù)據(jù)，并基于基因與環(huán)境進(jìn)行建模[44]。

3.4雄性不育與作物雜種優(yōu)勢利用

植物雄性不育通常是指雄性器官不能產(chǎn)生正常功能的雄配子（花粉）的現(xiàn)象，在雜種優(yōu)勢利用及雜交種生產(chǎn)等方面具有重要價值。根據(jù)遺傳機(jī)制不同，可將雄性不育分為受核基因控制的核不育類型（GMS）和受細(xì)胞質(zhì)基因與核基因共同控制的質(zhì)核互作不育類型（CMS）。

目前，在雄性不育與作物雜交育種研究主要集中在雄性不育的遺傳資源、分子機(jī)制及其在雜種優(yōu)勢中的應(yīng)用等領(lǐng)域。其中，在雄性不育的分子機(jī)制研究領(lǐng)域已發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致小孢子減數(shù)分裂異常、絨氈層發(fā)育異常、花粉壁發(fā)育異常等與細(xì)胞核不育相關(guān)的功能基因，及在細(xì)胞葉綠體和線粒體中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)不育的相關(guān)功能基因。

本研究前沿主要集中在3個方面：作物雜交育種中雄性不育的分子調(diào)控機(jī)制研究、雄性不育基因在雜交育種中的應(yīng)用及作物雄性不育與育性恢復(fù)。其中“Male sterility and fertility restoration in crops”是本前沿論文中被引頻次（210次）最高的論文。文章綜述了近年來作物細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和細(xì)胞核雄性不育系的研究進(jìn)展，總結(jié)了雄性不育和育性恢復(fù)的幾種模型及進(jìn)化意義，具有重要價值[45]。

7篇核心論文中我國主導(dǎo)或參與貢獻(xiàn)了6篇，表明我國在這一熱點(diǎn)研究方面處于世界領(lǐng)先水平，特別是我國雜交稻生產(chǎn)技術(shù)：基于核質(zhì)互作雄性不育“三系法”和光溫敏核不育“兩系法”。我國植物遺傳學(xué)家在闡明雜交水稻育性調(diào)控的分子遺傳基礎(chǔ)領(lǐng)域作出了重要貢獻(xiàn)。在三系雜交稻育種應(yīng)用最廣泛的CMS系統(tǒng)是水稻野敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)，其不育基因?yàn)榫€粒體不育基因WA352，WA352通過結(jié)合核編碼蛋白Cox11抑制其降解ROS，引起花粉絨氈層提前程序性死亡，是導(dǎo)致花粉敗育的分子機(jī)制。將核不育恢復(fù)基因與來自于玉米的α-淀粉酶基因、1種來自于珊瑚的紅色熒光蛋白基因串聯(lián)，可用于批量生產(chǎn)獲得非轉(zhuǎn)基因的雄性不育系[45]。

我國科學(xué)家在玉米核不育恢復(fù)基因ZmMs7[46]、ZmMs30[47]等的克隆和功能研究也取得了重大突破，為玉米雄花發(fā)育的分子機(jī)制研究提供了重要線索;同時，提出了作物多控不育技術(shù)系統(tǒng)的概念，利用該技術(shù)體系生產(chǎn)的玉米不育系和雜交種都不含任何轉(zhuǎn)基因成分，可規(guī)避轉(zhuǎn)基因?qū)θ祟愂称钒踩睦_。通過對多種植物核不育基因的比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析，預(yù)測到62個玉米核不育候選新基因，據(jù)此構(gòu)建了玉米花藥/花粉發(fā)育的遺傳與生化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為玉米和其他作物不育基因的理論研究和育種應(yīng)用提供了重要參考和技術(shù)指導(dǎo)。

3.5野生親緣關(guān)系在作物育種中的研究

相對于馴化作物來說，野生親緣關(guān)系（crop wild relatives，簡稱CWR）作物在進(jìn)化過程中具備很強(qiáng)的生物或非生物抗性，從而擁有更高的遺傳多樣性。利用野生近緣種提高作物的抗病性、產(chǎn)量等性狀是熱點(diǎn)研究。該熱點(diǎn)前沿集中在CWR保護(hù)、基因組水平上對作物野生種遺傳多樣性的認(rèn)知以及CWR在作物育種的應(yīng)用現(xiàn)狀與展望3個方向。

在CWR保護(hù)方面，世界上部分國家已發(fā)出倡議并設(shè)立了資助項(xiàng)目，用于保護(hù)世界范圍內(nèi)的CWR，作物種類包括蘋果、花生、香蕉、大麥、胡蘿卜、鷹嘴豆、豇豆、茄子、蠶豆、小米、豌豆、扁豆、燕麥、珍珠小米、木豆、馬鈴薯、大米、黑麥、高粱、向日葵、甘薯、野豌豆和小麥等。工作內(nèi)容則包括：確定那些現(xiàn)有基因庫中缺失的、最有可能包含適應(yīng)農(nóng)業(yè)適應(yīng)氣候變化的價值多樣性以及最瀕危的CWR;從野生環(huán)境中收集新的和受威脅的CWR多樣性，并將其提供給基因庫進(jìn)行保護(hù);與全世界研究人員和其他用戶共享這些物種;評估新收集的CWR和其他已收集的CWR的有用特性，并準(zhǔn)備用于作物改良;廣泛提供信息，以便研究人員、收集者、育種者和植物遺傳資源的其他用戶能夠訪問信息和信息系統(tǒng)，以改進(jìn)CWR的保護(hù)和使用。其次是利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)結(jié)合科學(xué)方法提出CWR保護(hù)的量化指標(biāo)，既可清晰了解全球CWR保護(hù)的現(xiàn)狀，也可確定那些需要優(yōu)先保護(hù)的野生種類型。有研究利用已有信息模擬了與81種作物相關(guān)的 1 076 個分類群的全球分布，并將這些分布所包含的潛在地理和生態(tài)多樣性與目前可在基因庫中獲得的多樣性信息進(jìn)行比較，以此來評估遺傳多樣性保護(hù)的全面性[48]。研究結(jié)果表明，CWR的多樣性在基因庫中代表性很差。有63種作物相關(guān)的313個類群（占總數(shù)的291%）沒有種質(zhì)資源，另外257個（23.9%）只有不到10個。超過70%的分類群被認(rèn)為需要進(jìn)一步收集，以提高它們在基因庫中的代表性，而超過95%的分類群在其自然分布中的地理和生態(tài)變異方面的代表性不足。研究提出一個差距分析指標(biāo)方法，用來評估遷徙地和原生地野生植物遺傳多樣性保護(hù)工作[49]，不僅能夠確定物種的優(yōu)先次序，還可以量化區(qū)域范圍內(nèi)植物保護(hù)的進(jìn)展情況。對近7 000 個分類群評估，發(fā)現(xiàn)每100個分類群中僅有不到3個被評估為充分保護(hù)，并提出建議。

在基因組水平上對CWR基因庫多樣性的認(rèn)知研究中，基因組測序數(shù)據(jù)表明，CWR的確是具有實(shí)用價值的植物育種基因庫，野生種能夠擴(kuò)大作物的遺傳多樣性。此外，DNA測序技術(shù)的進(jìn)步使得育種家認(rèn)識到需要結(jié)合重測序來有效地探索CWR中有益的遺傳變異。對CWR核基因組、轉(zhuǎn)錄組和母體（葉綠體和線粒體）基因組的分析有助于它們在作物改良中的應(yīng)用[50]。以高優(yōu)先級CWR為靶點(diǎn)進(jìn)行測序?qū)⑹笴WR基因組測序的貢獻(xiàn)最大化。

CWR在作物改良應(yīng)用研究中，從作物類型來看，野生種利用研究最多的作物依次為向日葵、小麥、馬鈴薯、花生、蘋果、水稻、燕麥、木豆、梨和番茄;而從改良性狀類型來看，多為生物抗性、非生物抗性、農(nóng)藝性狀、育性、數(shù)量性狀、表型性狀;從應(yīng)用年代來看，自1980年以來，野生種利用受到關(guān)注，在2000年以后發(fā)生了跳躍性的提升直到最近依然保持這種狀態(tài)，通過一些實(shí)例來表達(dá)野生種遺傳多樣性對作物遺傳改良的重要推動。在非生物脅迫抗性方面，通過雜交育種將野生種單粒小麥（Triticum monococcum）中的TmHKT1：5-A基因轉(zhuǎn)入硬粒小麥中去從而使其在鹽環(huán)境下的產(chǎn)量增加25%。在生物脅迫抗性方面，將玉米野生種墨西哥玉米（Tripsacum dactyloides L.）的抗枯萎病等位基因轉(zhuǎn)移后，至少使美國1978年的玉米損失減少50%。在作物產(chǎn)量性狀上，將野生番茄（Solanum hirsutum）與小果泛起雜交后形成的番茄品種產(chǎn)量和可溶物含量增加20%。如何將目標(biāo)性狀或基因從野生種滲透至作物基因組中，涉及到諸多技術(shù)，比如胚搶救技術(shù)、體細(xì)胞融合雜交技術(shù)、多倍體化技術(shù)等。即使這樣，也仍有部分野生種的基因未能成功轉(zhuǎn)移進(jìn)入作物，需要持續(xù)研究。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)野生種基因滲入到作物基因組中以后，需要利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)、QTL定位技術(shù)、全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)、單核苷酸變異芯片技術(shù)、基因組測序技術(shù)、功能基因組學(xué)、代謝組學(xué)以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)和最新的基因編輯技術(shù)等來進(jìn)一步獲得并利用野生種的基因及其控制性狀。盡管如此，仍有一些因素阻礙了CWR的利用進(jìn)程，包括野生種表型和基因型數(shù)據(jù)的缺乏、雜交親和性障礙、野生種基本信息的缺失、連鎖累贅、野生種的劣勢認(rèn)知缺乏、對復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)缺乏了解、對遷徙地野生種管理和維護(hù)的不善、缺乏機(jī)構(gòu)支持和資金限制等問題，仍需要進(jìn)一步解決。

4結(jié)論與討論

作物育種的前沿始終圍繞生物育種技術(shù)與應(yīng)用，也是全球重點(diǎn)農(nóng)業(yè)組織與國家基金的重點(diǎn)資助方向?！禤lant Biotechnology Journal》是領(lǐng)域前沿的重要期刊，美國和中國仍是該研究領(lǐng)域的突出貢獻(xiàn)者和領(lǐng)軍者，處于全球領(lǐng)先地位?？傮w而言，全球研究機(jī)構(gòu)和大學(xué)發(fā)展較為均衡，合作以中、美兩國的國內(nèi)合作為主，康奈爾大學(xué)是國際合作的典范。重要研究機(jī)構(gòu)中，我國的中國科學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)是突出代表機(jī)構(gòu)，在全球機(jī)構(gòu)中具有顯著的競爭優(yōu)勢，但影響力有待進(jìn)一步提升，未來應(yīng)在兼顧產(chǎn)出的基礎(chǔ)上，更加重視論文的質(zhì)量，提升國際影響力。在合作方面，應(yīng)由重點(diǎn)機(jī)構(gòu)帶頭，基于全球重要機(jī)構(gòu)的不同研究方向，有針對性地開展國際學(xué)術(shù)交流，積極開展跨國合作模式，增進(jìn)我國的優(yōu)勢技術(shù)，補(bǔ)足我國作物育種中的短板。

生物育種技術(shù)的發(fā)展引領(lǐng)了作物生物育種領(lǐng)域的前進(jìn)方向，隨著計算機(jī)信息技術(shù)的發(fā)展，高通量表型平臺也有了較大的突破，能夠在技術(shù)應(yīng)用過程中發(fā)揮重要作用。面對糧食供給現(xiàn)狀，雄性不育與作物雜種優(yōu)勢這一傳統(tǒng)方向是關(guān)系到世界糧食供給和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要內(nèi)容，是基礎(chǔ)性和必要性的研究方向，野生親緣關(guān)系及在作物育種中的研究是較新的研究方向。我國正值“十四五”的開局之年，須在掌握國際發(fā)展動態(tài)和前沿技術(shù)的基礎(chǔ)上，基于我國作物育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展的國情，結(jié)合大力發(fā)展生物種業(yè)的相關(guān)政策，順勢而為，利用我國育種優(yōu)勢，加強(qiáng)育種技術(shù)的創(chuàng)新，突破生物育種的“卡脖子”技術(shù)，盡早跨越種業(yè)第2階段至第3階段的過渡時期，向種業(yè)第4階段邁進(jìn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]育種：實(shí)現(xiàn)跨越發(fā)展，打好種業(yè)翻身仗[EB/OL]. （2021-03-10）[2021-04-20]. https：//baijiahao.baidu.com/s？id=1693809839546724507&wfr=spider&for=pc.

[2]李新海，谷曉峰，馬有志，等. 農(nóng)作物基因設(shè)計育種發(fā)展現(xiàn)狀與展望[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2020，22（8）：1-4.

[3]Incites Essential Science Indicators [EB/OL]. （2019-03-10）[2021-04-20]. http：//help.incites.clarivate.com/incitesLiveESI/ESIGroup/indicatorsGroup/indicatorsESI/researchFro nts.html.

[4]Sauvage C，Segura V，Bauchet G，et al. Genome-wide association in tomato reveals 44 candidate loci for fruit metabolic traits[J]. Plant Physiology，2014，165（3）：1120-1132.

[5]van Eeuwijk F A，Bustos-Korts D，Millet E J，et al. Modelling strategies for assessing and increasing the effectiveness of new phenotyping techniques in plant breeding[J]. Plant Science，2019，282：23-39.

[6]Tripathi J N，Ntui V O，Ron M，et al. CRISPR/Cas9 editing of endogenous banana streak virus in the B genome of Musa spp.overcomes a major challenge in banana breeding[J]. Communications Biology，2019，2：46.

[7]Jiang W Z，Henry I M，Lynagh P G，et al. Significant enhancement of fatty acid composition in seeds of the allohexaploid，Camelina sativa，using CRISPR/Cas9 gene editing[J]. Plant Biotechnology Journal，2017，15（5）：648-657.

[8]Winfield M O，Allen A M，Burridge A J，et al. High-density SNP genotyping array for hexaploid wheat and its secondary and tertiary gene pool[J]. Plant Biotechnology Journal，2016，14（5）：1195-1206.

[9]Allen A M，Winfield M O，Burridge A J，et al. Characterization of a Wheat Breeders Array suitable for high-throughput SNP genotyping of global accessions of hexaploid bread wheat （Triticum aestivum）[J]. Plant Biotechnology Journal，2017，15（3）：390-401.

[10]Haghighattalab A，Pérez L G，Mondal S，et al. Application of unmanned aerial systems for high throughput phenotyping of large wheat breeding nurseries[J]. Plant Methods，2016，12：35.

[11]Zaman-Allah M，Vergara O，Araus J L，et al. Unmanned aerial platform-based multi-spectral imaging for field phenotyping of maize[J]. Plant Methods，2015，11：35.

[12]Tattaris M，Reynolds M P，Chapman S C.A direct comparison of remote sensing approaches for high-throughput phenotyping in plant breeding[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：1131.

[13]Isidro J，Jannink J L，Akdemir D，et al. Training set optimization under population structure in genomic selection[J]. Theoretical and Applied Genetics，2015，128（1）：145-158.

[14]Appels R，Eversole K，F(xiàn)euillet C. et al. Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome.[J]. Science，2018，361（6403）：1-13.

[15]Su Z Q，Bernardo A，Tian B，et al. A deletion mutation in TaHRC confers Fhb1 resistance to Fusarium head blight in wheat[J]. Nature Genetics，2019，51（7）：1099-1105.

[16]Liu S，F(xiàn)an C C，Li J N，et al. A genome-wide association study reveals novel elite allelic variations in seed oil content of Brassica napus[J]. Theoretical and Applied Genetics，2016，129（6）：1203-1215.

[17]Sukumaran S，Dreisigacker S，Lopes M，et al. Genome-wide association study for grain yield and related traits in an elite spring wheat population grown in temperate irrigated environments[J]. Theoretical and Applied Genetics，2015，128（2）：353-363.

[18]Cui F，Zhang N，F(xiàn)an X L，et al. Utilization of a Wheat660K SNP array-derived high-density genetic map for high-resolution mapping of a major QTL for kernel number[J]. Scientific Reports，2017，7：3788.

[19]Wen W W，Li D，Li X A，et al. Metabolome-based genome-wide association study of maize kernel leads to novel biochemical insights[J]. Nature Communications，2014，5：3438.

[20]Spindel J，Begum H，Akdemir D，et al. Correction：genomic selection and association mapping in rice （Oryza sativa）：effect of trait genetic architecture，training population composition，marker number and statistical model on accuracy of rice genomic selection in elite，tropical rice breeding lines[J]. PLoS Genetics，2015，11（6）：e1005350.

[21]Feng Z Y，Mao Y F，Xu N F，et al. Multigeneration analysis reveals the inheritance，specificity，and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2014，111（12）：4632-4637.

[22]Zhou H B，Liu B，Weeks D P，et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice[J]. Nucleic Acids Research，2014，42（17）：10903-10914.

[23]Svitashev S，Young J K，Schwartz C，et al. Targeted mutagenesis，precise gene editing，and site-specific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA[J]. Plant Physiology，2015，169（2）：931-945.

[24]Li Z S，Liu Z B，Xing A Q，et al. Cas9-guide RNA directed genome editing in soybean[J]. Plant Physiology，2015，169（2）：960-970.

[25]Zhang Y，Liang Z，Zong Y A，et al. Efficient and transgene-free genome editing in wheat through transient expression of CRISPR/Cas9 DNA or RNA[J]. Nature Communications，2016，7：12617.

[26]Liang Z，Chen K L，Li T D，et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes[J]. Nature Communications，2017，8：14261.

[27]Svitashev S，Schwartz C，Lenderts B，et al. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes[J]. Nature Communications，2016，7：13274.

[28]Zong Y A，Wang Y P，Li C，et al. Precise base editing in rice，wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion[J]. Nature Biotechnology，2017，35（5）：438-440.

[29]Zong Y A，Song Q N，Li C，et al. Efficient C-to-T base editing in plants using a fusion of nCas9 and human APOBEC3A[J]. Nature Biotechnology，2018，36（10）：950-953.

[30]張倩倩，許勇，田守蔚，等. 利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的單堿基編輯技術(shù)創(chuàng)制抗除草劑西瓜新種質(zhì)[J]. 中國瓜菜，2019，32（8）：219-220.

[31]Endo M，Mikami M，Endo A，et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM[J]. Nature Plants，2019，5（1）：14-17.

[32]Araki M，Ishii T.Towards social acceptance of plant breeding by genome editing[J]. Trends in Plant Science，2015，20（3）：145-149.

[33]Hartung F，Schiemann J.Precise plant breeding using new genome editing techniques：opportunities，safety and regulation in the EU[J]. The Plant Journal，2014，78（5）：742-752.

[34]Macovei A，Sevilla N R，Cantos C，et al. Novel alleles of rice eIF4G generated by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis confer resistance to Rice tungro spherical virus[J]. Plant Biotechnology Journal，2018，16（11）：1918-1927.

[35]Ortigosa A，Gimenez-Ibanez S，Leonhardt N，et al. Design of a bacterial speck resistant tomato by CRISPR/Cas9-mediated editing of SlJAZ2[J]. Plant Biotechnology Journal，2019，17（3）：665-673.

[36]Ueta R，Abe C，Watanabe T，et al. Rapid breeding of parthenocarpic tomato plants using CRISPR/Cas9[J]. Scientific Reports，2017，7：507.

[37]Klap C，Yeshayahou E，Bolger A M，et al. Tomato facultative parthenocarpy results from SlAGAMOUS-LIKE 6 loss of function[J]. Plant Biotechnology Journal，2017，15（5）：634-647.

[38]Tang L，Mao B G，Li Y K，et al. Knockout of OsNramp5 using the CRISPR/Cas9 system produces low Cd-accumulating indica rice without compromising yield[J]. Scientific Reports，2017，7：14438.

[39]Morineau C，Bellec Y，Tellier F，et al. Selective gene dosage by CRISPR-Cas9 genome editing in hexaploid Camelina sativa[J]. Plant Biotechnology Journal，2017，15（6）：729-739.

[40]Li L，Zhang Q，Huang D F.A review of imaging techniques for plant phenotyping[J]. Sensors，2014，14（11）：20078-20111.

[41]Kirchgessner N，Liebisch F，Yu K，et al. The ETH field phenotyping platform FIP：a cable-suspended multi-sensor system[J]. Functional Plant Biology，2017，44（1）：154.

[42]Andrade-Sanchez P，Gore M A，Heun J T，et al. Development and evaluation of a field-based high-throughput phenotyping platform[J]. Functional Plant Biology，2013，41（1）：68-79.