伽馬環(huán)糊精中基因毒性雜質(zhì)甲醛的測定

王麗娟 蘭公劍 萬國盛

【摘要】采用化學衍生化法與紫外-可見分光光度法建立了伽馬環(huán)糊精中甲醛的測定方法。以乙酰丙酮試劑為衍生化劑，采用紫外-可見分光光度法在410 nm檢測波長下測定吸光度，以外標法計算甲醛含量。經(jīng)方法學驗證，線性關(guān)系良好，平均回收率為96.5 %。結(jié)論：所建立的方法專屬性強、精密度好、準確度高、快速方便，可以作為伽馬環(huán)糊精及類似物中甲醛的測定方法。

【關(guān)鍵詞】伽馬環(huán)糊精;甲醛;乙酰丙酮;紫外-可見分光光度法

【中圖分類號】R595.4 【文獻標識碼】A 【文章編號】2026-5328（2021）08-025-03

Abstract：The method was established to determine formaldehyde in gamma cyclodextrin by ultraviolet-visible spectrophotometry following derivation with acetylacetone，the detection wavelength was 410nm. The formaldehyde content was calculated by external standard method. The method was validated，which had good linear relationship，and the average recoveries was 96.5 %. Conclusion：The established method has strong specificity，good precision，high accuracy，fast and convenient，which can be used for determination of formaldehyde in gamma cyclodextrin analogues.

Keywords：gamma cyclodextrin;formaldehyde;acetylacetone;ultraviolet-visible spectrophotometry

甲醛具有致突變性和致癌性，研究表明甲醛不僅可以誘導(dǎo)人外周淋巴細胞DNA發(fā)生斷裂，還可引起DNA-蛋白質(zhì)、DNA-DNA交聯(lián)[1]，已被國際癌癥機構(gòu)列為第一類“致癌物質(zhì)”。伽馬環(huán)糊精（γ-環(huán)糊精）為環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用于淀粉而生成的8個葡萄糖以α-1，4-糖苷鍵結(jié)合的環(huán)狀低聚糖[2]，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[3]。其作為醫(yī)藥原料時，應(yīng)對其雜質(zhì)進行研究和控制，以保障最終藥品的質(zhì)量，甲醛是伽馬環(huán)糊精中可能存在的雜質(zhì)之一，為保障最終藥品的質(zhì)量，需對其進行研究和控制。

甲醛分子量為30，與空氣中的氣體組分分子量相近，采用GC-MS檢測專屬性差，GC-FID檢測響應(yīng)差;此外，紫外吸收弱、不易電離等性質(zhì)，使得HPLC-UV或HPLC-MS等方法亦不適用。常規(guī)檢測方法無法直接檢測甲醛，常采用衍生化法測定衍生物的方式測定甲醛含量。李俊等[4]采用五氟苯肼與甲醛反應(yīng)，建立高效液相色譜法測定果蔬中甲醛含量，在0.114～57mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;邵仕萍等[5]建立乙酰丙酮衍生化-高效液相色譜-熒光檢測器法測定食品中甲醛含量，在0.001～20.0mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;佟琦等[6]建立了2，4-二硝基苯肼柱前衍生化高效液相色譜法測定食品中甲醛含量。此外，隨著科技的發(fā)展，甲醛測定的方法也和更多領(lǐng)域相結(jié)合，主要包括化學發(fā)光法、離子選擇電極法、電化學傳感器法和微流控芯片技術(shù)，但這些技術(shù)操作復(fù)雜、儀器昂貴、普及性差。

本研究以乙酰丙酮為衍生化試劑、以紫外-可見分光光度法為檢測手段，在410nm波長處[7]測定伽馬環(huán)糊精中甲醛含量，實驗表明該方法操作簡便、專屬性強、準確度高，且實用性強。

1實驗部分

1.1試劑與藥品

甲醛溶液（含量：38.9%，來源：南京化學試劑股份有限公司）;乙酰丙酮（含量：99.0 %，來源：國藥集團化學試劑有限公司）;γ-環(huán)糊精（北京百靈威科技有限公司）;異丙醇（色譜純，TEDIA公司）;冰醋酸（色譜純，ROE）;實驗用水為默克 Millipore超純水儀自制超純水。

1.2儀器與試劑

EVOLUTION 350型紫外-可見分光光度計（Thermo公司）; MSU225P型電子天平（Sartorius公司）;XS204型電子天平（METTLER TOLEDO公司）;恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

衍生化劑：取無水醋酸銨75g，加水200ml溶解，再加入1.0ml乙酰丙酮試劑和1.5ml冰醋酸，用水稀釋至500ml，搖勻。臨用新制。

甲醛貯備液：取甲醛溶液適量，精密稱定，用水定量稀釋制成每1ml含甲醛約62.5mg的溶液。

對照品溶液：取甲醛貯備液2ml至50ml量瓶中，加衍生化劑15ml，再加水23ml，置60℃水浴中加熱10分鐘，放冷，用異丙醇稀釋至刻度。

供試品溶液：取供試品1g置5ml量瓶中，加水1.5ml溶解，再加1.5ml衍生化劑，再加水1ml，置60℃水浴中加熱10分鐘，放冷，用異丙醇稀釋至刻度。

空白溶液：移取15ml衍生化劑至50ml量瓶中，再加水25ml，置60℃水浴中加熱10分鐘，放冷，用異丙醇稀釋至刻度。

2.2方法學驗證

2.2.1 專屬性

參比溶液：移取供試品1g至5ml量瓶中，加參比貯備液1.5ml，再加水1.5ml，置60℃水浴中加熱10分鐘，放冷，用異丙醇稀釋至刻度。

對照品溶液、供試品溶液和空白溶液同“2.1溶液制備”項下。

以空白溶液為空白，將各溶液分別在410nm波長處測定吸光度，結(jié)果表明，參比溶液吸光度為-0.007，小于0，即供試品在該波長處無吸收，本法專屬性良好。

2.2.2 線性和范圍

分別取上述“2.1溶液的制備”項下甲醛貯備液各適量，分別置50ml量瓶中，加衍生化劑各15ml，再加水各23ml，置60℃水浴中加熱10分鐘，放冷，用異丙醇稀釋至刻度，得到甲醛濃度分別為0.25 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1、1.25 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、2.50 μg·mL-1、3.76 μg·mL-1的系列線性溶液，在410nm波長處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，以濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標進行線性回歸，線性回歸方程為y=0.1777x+0.0318，相關(guān)系數(shù)r=0.9951，表明線性關(guān)系良好。

2.2.3 準確度

本次研究中準確度以回收率（%）評價，取伽馬環(huán)糊精供試品約1g，精密稱定，置5mL量瓶中，加水1.5ml溶解，加入衍生化劑1.5ml，分別精密加入上述“2.1溶液的制備”項下甲醛貯備液0.1ml、0.2ml和0.3ml，再分別加水0.9ml、0.8ml和0.7ml，分別置60℃水浴中加熱10分鐘，放冷，用異丙醇稀釋至刻度，分別制成相當于50%、100%、150%濃度水平的加樣回收率試驗溶液，每個濃度水平平行配制3份，在410nm波長處測定吸光度，計算加樣回收率及RSD（n=9），測得平均回收率為96.5%，回收率RSD（n=9）為1.7%，表明方法的準確度良好。詳細試驗結(jié)果見表1。

2.2.4 重復(fù)性

取伽馬環(huán)糊精供試品約1g，精密稱定，置5mL量瓶中，加水1.5ml溶解，加入衍生化劑1.5ml，精密加入上述“2.1溶液的制備”項下甲醛貯備液0.2ml，再加水0.8ml，置60℃水浴中加熱10分鐘，放冷，用異丙醇稀釋至刻度，平行配制6份，作為重復(fù)性測試溶液，在410nm波長處測定吸光度，測定每一份溶液中甲醛的含量，并計算含量的RSD。結(jié)果6份樣品測得甲醛含量的RSD為3.2%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.5 中間精密度

由不同實驗人員在不同日期，使用不同的高效液相色譜儀，照“2.2.4 重復(fù)性”項下的方法進行試驗，將測定結(jié)果與重復(fù)性項下測得的6份結(jié)果合并計算，結(jié)果12份樣品測得甲醛含量的RSD為3.2%，表明方法的中間精密度良好。

2.2.6 溶液穩(wěn)定性

照“2.2.4重復(fù)性”項下方法制備加樣供試品溶液，在室溫條件下放置7 h，考察甲醛含量的變化情況。結(jié)果在室溫放置7h，供試品中甲醛含量與0h含量差值為0.00009%（0.9ppm），小于3ppm，表明供試品溶液至少在7h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7方法耐用性

分別考察衍生化劑的加入量1.5ml±0.2ml、衍生化時間10min±2min、衍生化溫度60℃±5℃和測定波長410nm±1nm發(fā)生微小變化時，加樣供試品溶液中甲醛含量的變化情況。結(jié)果表明，檢測條件發(fā)生微小變化時，甲醛測得量的極差為0.00017%（1.7ppm），小于3ppm，表明本法耐用性良好。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了乙酰丙酮衍生化-紫外可見分光光度法測定伽馬環(huán)糊精中甲醛含量的分析方法，方法學驗證結(jié)果表明，所建立的方法專屬性強、準確度高、耐用性好可以穩(wěn)定的用于伽馬環(huán)糊精中甲醛的測定，為伽馬環(huán)糊精的質(zhì)量控制提供了有效的支撐，也可為其他醫(yī)藥原料或藥品中的甲醛的測定提供參考。

【參考文獻】

[1]裘著革，楊丹鳳，孫詠梅，等.甲醛致核酸損失作用的實驗研究[J].環(huán)境科學學報，2001，24（4）：720-722.

[2]國家藥典委員會.伽馬環(huán)糊精[S].中華人民共和國藥典2020年版四部，670.

[3]王金鵬，夏柳溪，孟令儒，等.大環(huán)糊精的分離、鑒定及應(yīng)用研究進展[J].食品與生物技術(shù)學報，2019，38（01）：1-6.

[4]李俊，劉永翔，王輝，等.高效液相色譜法定量測定果蔬中甲醛含量[J].食品科學，2016，37（22）：198-204.

[5]邵仕萍，相大鵬，李華斌，等.乙酰丙酮衍生化高效液相色譜-熒光檢測法測定食品中的甲醛[J].食品科學，2015，36（16）：241-245.

[6]佟琦，王志斌，崔海瑩，等.高效液相色譜法對粉條中甲醛含量的快速檢測[J].分析測試學報，2011，30（12）：1392-1395.

[7]GB/T 30796-2014 食品用洗滌劑試驗方法甲醛的測定[S].

作者簡介：王麗娟，女，漢，1989年12月生，江蘇省鹽城市，碩士，工程師，研究方向：藥物分析及質(zhì)量研究