張 瑩 聶紅明 汪 蓉 姜煜資 俞嫣青 王靈臺

1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 (上海，201203) 2.上海中醫(yī)藥大學 3.上海市浦東新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院

我國是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高發(fā)地區(qū), 世界衛(wèi)生組織曾提出“至2030年消除病毒性肝炎重大公共衛(wèi)生威脅”的終極目標。全球約20億人曾感染HBV,其中2.4億人為慢性HBV感染者，每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細胞癌(HCC)。2006年全國乙型肝炎血清流行病學調查表明,我國1～59歲人群乙肝表面抗原(HBsAg)攜帶率為7.18%[1],據(jù)此推算,我國慢性HBV感染者約有9 300萬人,其中慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者約2 000萬例。我國每年有超過100萬人死于本病所致的肝硬化、肝癌及肝衰竭。雖然近年來已加大乙型肝炎免疫疫苗的接種和普及，但HBV感染在我國仍是一種嚴重危害人民健康的傳染病。CHB發(fā)病率高，且易發(fā)展為肝硬化、原發(fā)性肝癌及肝衰竭，最終導致死亡。目前HBV感染后的慢性化機制尚未明確，本文綜合最新國內外進展對HBV感染后慢性化的發(fā)生機制行綜述。

1 宿主因素

HBV侵入機體后，形成慢性感染與宿主抗病毒免疫應答密切相關。機體免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟程度是HBV持續(xù)性感染的重要因素。胎兒及新生兒免疫系統(tǒng)尚未成熟，此時容易發(fā)生免疫耐受。研究表明，乙肝攜帶者主要與母嬰傳播方式有關[2]。成人感染HBV后，病毒侵入肝細胞形成cccDNA不斷進行復制，激發(fā)人體的非特應性與特異性免疫應答，進一步對肝臟造成損傷。同時乙型肝炎慢性化還與宿主的HLA基因型差異有關，使得HBV肝外不斷復制得以免疫逃逸而致慢性化。

1.1 免疫應答

1.1.1 非特異性免疫 非特異性免疫系統(tǒng)主要包括：組織屏障、固有免疫細胞(吞噬細胞、殺傷細胞、樹突狀細胞等)和固有免疫分子(補體、細胞因子、酶類物質等)。

1.1.1.1 自然殺傷細胞(NK細胞)NK細胞為免疫監(jiān)視細胞,在病毒感染的過程中NK細胞首先做出反應，并抵御病毒的入侵。雖然NK細胞在外周血淋巴細胞中所占比例從5%～15%不等，但其在肝內淋巴細胞中所占比例高達50%。在CHB發(fā)病、發(fā)展及轉歸中,特別是在終止HBV感染和造成肝細胞免疫損害方面都可能有重要作用。NK細胞在缺乏抗體的情況下或通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)對病毒感染細胞或癌細胞具有細胞毒性。在慢性HBV感染中，NK細胞的表型和功能可能與感染階段有關。此外NK細胞對HBV特異性T細胞的調節(jié)作用，降低T細胞的抗病毒活性，抑制適應性免疫反應，可能會對控制病毒的總體作用產(chǎn)生負面影響[3]。在CHB患者中發(fā)現(xiàn)NK細胞的功能缺陷，主要表現(xiàn)為失活狀態(tài)。Aichao Shi等[4]人通過研究干擾素組與單純性恩替卡韋組相比，發(fā)現(xiàn)干CD56bright NK細胞可能通過TRAIL/TRAIL-R的溶細胞途徑和 IFN-γ及TNF-α上調APOBEC3A和APOBEC3B蛋白，間接非溶細胞途徑清除HBSAg。此外，HBV誘導的抑制性單核細胞通過培養(yǎng)調節(jié)性NK細胞抑制HBV特異性T細胞免疫應答，進而導致HBV慢性持續(xù)感染。

1.1.1.2 樹突樣細胞(DC) DC是最有效的專職性抗原遞呈細胞(APC),能激活初始型T細胞, 啟動控制HBV感染的免疫反應,產(chǎn)生CTL,清除病原體。HBV DC亞群的研究主要局限于從外周血分離的髓樣樹突狀細胞(mDCs)和漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)。慢性HBV感染常顯示DC功能受損。Xiaoyan Li等人[5]研究發(fā)現(xiàn)CHB患者髓系樹突狀細胞(MDCs)和漿細胞樣樹突狀細胞(PDCs)的頻率均低于健康對照組，恩替卡韋(ETV)抗病毒治療后，PDCs頻率和MDCS成熟標志物表達增加，基線HBsAg水平是影響DC的重要因素。在基因表達分析中，發(fā)現(xiàn)CAB患者免疫相關基因表達水平顯著降低。在這些基因中，白細胞介素-6信號轉導蛋白(IL6ST)的表達水平與DC表面標志物的表達水平呈正相關。調節(jié)DC中IL6ST的表達水平，并用抑瘤素M治療，可使DC功能恢復。

1.1.1.3 Toll樣受體(TLR) TLR是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLR是單個的跨膜非催化性蛋白質，可以識別來源于微生物的具有保守結構的分子。TLRs主要表達于免疫細胞，包括巨噬細胞、DC、B細胞和T細胞。有研究將健康人外周血單個核細胞(PBMC)的單核細胞極化成M1/M2巨噬細胞，并通過TLR2信號通路檢測乙型肝炎核心抗原(HBcAg)對巨噬細胞極化和功能的影響[6]。結果表明，HBcAg對M1極化影響不大，但能有效削弱M2極化，促進促炎細胞因子IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。由此可知，HBC Ag可通過TLR2途徑削弱M2巨噬細胞的極化，同時促進炎性細胞因子的產(chǎn)生。此外，一些研究報道TLR的表達可以介導NK細胞的強烈激活。TLR5基因變異可能在HBV相關嚴重肝病的發(fā)生中起一定作用[7，8]。

1.1.1.4 干擾素系統(tǒng)(IFN) IFN是病毒感染后免疫細胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，分為α和β兩型，可通過抑制乙肝病毒的復制直接抗病毒，此外還具有免疫調節(jié)作用。其中干擾素-α-2作為目前研究最多的亞型，已被用于治療HBV感染，具有療程短、病毒學應答持續(xù)等優(yōu)點。研究發(fā)現(xiàn)，干擾素α亞型14可有效地誘導肝內干擾素γ和α的協(xié)同應答，并與有效抑制HBV有關[9]。Akpolat等[10]研究表明IFN-γ與CHB慢性化過程相關。

1.1.2 特異性免疫 HBV感染機體刺激特異性免疫系統(tǒng)(T細胞、B細胞、調節(jié)性T細胞)分泌細胞毒顆?；蛟鰪娖渌庖呒毎δ埽_到發(fā)揮抗病毒作用。T細胞是起主要作用的免疫細胞，包括細胞毒性T細胞、輔助性T細胞(Th細胞)、調節(jié)性T細胞(Treg細胞)，參與機體細胞及體液免疫反應。B細胞可分化為漿細胞，漿細胞可合成和分泌抗體(乙肝抗體)，主要執(zhí)行機體的體液免疫。

1.1.2.1 細胞毒性T淋巴細胞(CTL)CTL是機體細胞免疫中起重要作用的細胞，可通過穿孔蛋白途徑和FaS/FaSL介導的細胞凋亡途徑對靶細胞產(chǎn)生細胞毒作用。還能分泌細胞因子，如干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)，直接抑制HBV復制和表達，完全清除肝細胞內的病毒。CTL是CD8+T細胞的效應階段。HBV復制的抑制與循環(huán)CD8+T細胞數(shù)量的增加有關。CD8+T細胞是抗腫瘤、抗病毒免疫的主要效應細胞之一。慢性HBV感染通常表現(xiàn)為病毒特異性T細胞反應性弱或缺乏，被描述為“衰竭”狀態(tài)。CHB和HCC均存在CD8+T細胞耗竭現(xiàn)象[11]。此外，還發(fā)現(xiàn)前列腺素E2通過損害CTL功能促進HBV復制[12]。研究表明，CTLA-4水平和CTLA-4 rs231775多態(tài)性與慢性HBV感染的病情進展和HCC發(fā)生有關[13]。

1.1.2.2 輔助性T細胞(Th) 由初始CD4+T細胞分化而成, 通過分泌細胞因子來相互影響對方細胞的分化與增殖。Th1在自身免疫病、器官移植排斥反應、抗感染的誘導過程中起到重要作用,主要介導細胞免疫應答。Th2在過敏反應中起主導作用,主要介導體液免疫。Th1/Th2細胞平衡關系可能影響乙肝的慢性化發(fā)生及持續(xù)[14]。CHB慢性化患者體內存在Th2型細胞占優(yōu)勢的狀態(tài)。

1.1.2.3 調節(jié)T細胞(Treg) Treg細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，是細胞免疫中重要的調節(jié)細胞，在維持機體免疫耐受方面起著關鍵作用。Treg主要為CD4+、CD25+、Treg。馬建平[15]發(fā)現(xiàn)CD4+、CD25+、foxp3+ T細胞在HBV感染者外周血中的比例明顯高于健康人群，活動期比例明顯高于恢復期，提示HBV感染者外周血CD4+、CD25+、foxp3+ T細胞介導的免疫耐受與感染后病情進展存在明顯關系，能夠直接參與肝臟免疫損傷。HBV感染后體內調節(jié)性 T 細胞表達水平上調，可促進病毒的復制，能夠導致CHB慢性化。

研究表明，CHB肝硬化患者存在Treg/Th17失衡，外周血Treg細胞減少，Th17細胞增多，Treg/Th17比值降低。Treg與Th17細胞呈負相關。兩者失衡參與了CHB肝硬化的發(fā)病機制，Treg/Th17比值可作為預測失代償期肝硬化的潛在指標[16]。

1.1.2.4 B細胞 B細胞主要發(fā)揮體液免疫應答和抗原提呈作用。此外也具有免疫負調節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者Bregs表達顯著高于健康人群。Breg細胞增多可能是慢性乙型肝炎IL-10升高的主要來源，推測Bregs在HBV感染的過程中可能發(fā)揮了免疫負調節(jié)的作用，從而保護HBV逃脫宿主的免疫監(jiān)控和免疫清除[17]。

1.1.2.5 庫普弗細胞(KCs) KCs是指位于肝竇內表面的吞噬細胞，能夠清除血液中的外來抗原、抗原-抗體復合物和細胞碎片等物質。KCs不僅可以維持免疫應答的動態(tài)平衡，而且通過其抗原提呈功能和可溶性介質的分泌，促進CHB的發(fā)病[18]。一方面，KCs具有天然免疫細胞的特性，有助于清除HBV。同時，KCs誘導對HBV的免疫耐受，從而導致感染的慢性化。

1.2 免疫逃逸 HBV以基因突變的形式逃逸機體的免疫監(jiān)視作用，病毒因突變而改變了其對T細胞和B細胞的識別位點,使CTL或抗病毒中和抗體對HBV及其抗原不能進行有效的識別和應答。有研究發(fā)現(xiàn)HBsAg N-糖基化突變是病毒免疫逃逸的主要原因,并可感染免疫接種乙肝疫苗成功的患者。其中特異性HBsAg-MHR(主要親水區(qū))N-糖基化突變與HBV免疫逃逸有關[19]?！癮”抗原決定簇為外殼蛋白最重要的中和部位,其變異可逃避抗體中和,引起持續(xù)感染。所有確定的N-糖基化位點都位于“a”決定簇的第一個環(huán)中，HBsAg-MHR N-糖基化突變在中國是一個很高的頻率，并且可以在人群中水平傳播。這些突變導致抗-HBs的結合性降低，增強了病毒的包膜和分泌。

1.3 人白細胞抗原(HCA)基因型 HBV感染與宿主免疫應答相關，個體的免疫應答取決于主要組織相容性復合體(MHC)。人類的MHC被稱為HLA，HLA基因多態(tài)性影響HBV感染的結局[20]。某些HLA基因型可能會促進HBV感染的慢性化，如HLA-DQA1*0302、HLA-DRB1*03、HLA-DRB1*07等；有些則HBV感染慢性化起抑制作用，如HLA-DQA1*0301、HLA-DQA1*1102等。

1.4 細胞因子 HBV感染是一種包括免疫應答在內的復雜多因素共同作用的過程。機體感染HBV后對肝細胞沒有直接損傷，而是誘發(fā)機體免疫應答間接損傷肝細胞。細胞因子在免疫系統(tǒng)中起著重要的調控作用。如IL-10可抑制單核細胞依賴性輔助性T細胞增生，可抑制DC的分化成熟導致HBV感染慢性化，抑制炎癥因子的分泌，減輕肝損傷，但不利于機體對病毒的清除[21]。研究表明，IL-10基因啟動子區(qū)域和內含子序列多態(tài)性與CHB的慢性化和HBV肝損傷有關[22]。IFN-γ與IL-4水平比例失衡可能與患者HBV持續(xù)感染有關，導致HBV無法清除[23]。白細胞介素-17(IL-17)作為一種促炎細胞因子，已被發(fā)現(xiàn)在感染性和炎癥性疾病中調節(jié)免疫系統(tǒng)。有研究表明IL-17A rs10484879單核苷酸多態(tài)性基因型可能與HBV慢性感染易感性有關[24]。

1.5 補體成分 補體是一組具有酶活性的糖蛋白，是機體重要的免疫效應系統(tǒng)之一，主要存在于人和脊椎動物正常血清及組織液中，血清補體C3、C4與CHB患者的肝功能有相關性[25],Ning G[26]通過比較CHB患者肝組織和血清中C2的表達發(fā)現(xiàn)其明顯低于健康對照組，HBV可能通過抑制C2的表達來促進CHB患者的病毒持久性。

2 病毒因素

HBV感染的自然史CHB的自然史是由病毒、宿主和環(huán)境因素的復雜相互作用決定的，特定病毒學因素對CHB病程的影響越來越受到人們的重視。

2.1 病毒載量 HBV是一種包膜病毒，其環(huán)狀和部分雙鏈DNA基因組約為3.2 kb。肝細胞感染后，HBV基因組進入細胞核，HBV在感染的肝細胞的細胞核中建立一個共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)池。cccDNA以微小染色體的形式存在，對抗病毒藥物具有抵抗力，因此從感染細胞中清除cccDNA仍然是不可能的[27]，這是CHB難以治療的原因。低水平的殘留HBV仍可能促進纖維化進展。研究表明，在HBeAg陰性的患者中，肝內HBV DNA的升高與肝臟炎癥和纖維化的組織學證據(jù)相關，而在HBeAg陽性的患者中則沒有觀察到這種趨勢[28]。Lemonica Koumbi[29]通過19例CHB患者進行血清病毒血癥和肝臟HBV RNA檢測。檢測HBV RNA、NKG2D配體等在CHB患者和轉染細胞中的表達發(fā)現(xiàn)，CHB患者HBV的高復制上調了所有NK細胞配體的mRNA，特別是抑制性NK細胞配體LLT1的mRNA表達。

2.2 病毒HBV DNA基因型 不同的HBV基因型被證明是慢性HBV感染臨床進程的重要預測因子。根據(jù)整個HBV基因組序列的遺傳差異，至少有10個HBV基因型(A到J)和幾個亞型被鑒定出來[30]，它們在整個基因組序列中的差異大于8%，其中基因型B和C是在亞太地區(qū)常見。在體外研究中，基因型C的細胞內HBV DNA表達高于B，基因型D的細胞內hbvdna表達高于A。一項對460名HBeAg陰性、無肝硬化、停用恩替卡韋或TDF治療至少12個月的患者回顧性研究表明[31]，B型HBV感染者病毒學和臨床復發(fā)再治療的比例均顯著高于C型感染者(P<0.05)，且與之相匹配的皰疹傾向也明顯高于B型感染者(P<0.01)?；駽型及混合型的HBV-DNA載量明顯高于B型患者, 病毒復制更為活躍，傳染性強，對肝臟細胞的破壞更為嚴重,預后較差, C基因型HBV比B型更易產(chǎn)生肝臟病變[32，33]。

2.3 病毒基因變異 HBV屬DNA病毒，為部分環(huán)狀雙股DNA，基因組長約3.2 kb，包括前S/S區(qū)(pre-S/S區(qū))、前C/C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。基因常見突變主要有點突變、缺失突變和起始密碼子突變。S基因編碼HBsAg，S基因區(qū)的變異可引起HBsAg抗原性的改變，從而可能導致HBsAg的假陰性診斷和免疫逃避HBV。前S基因突變可能與HBV復制缺陷有關，這可能是觀察到的HBsAg低表達的原因。HBV PreS基因由PreS1和PreS2構成，分別編碼PreS1和PreS2蛋白，前者含有肝細胞結合位點，與病毒顆粒的包裝有關，PreS基因變異可能與HBV隱匿性感染和進展性肝臟疾病相關。研究表明，HBV PreS基因變異在CHB感染不同階段的分布差異，其中PreS缺失變異與CHB相關肝硬化發(fā)生及進展至失代償期顯著相關[34]。C區(qū)編碼核心蛋白和e蛋白。HBV前C(PC)區(qū)和基本核心啟動子(BCP)區(qū)基因變異后加強病毒復制能力和致病性增強，機體免疫原性改變以及影響免疫應答，使HBV逃避宿主的免疫清除，導致持續(xù)感染并加重肝細胞損害[35]。P讀碼框編碼DNA聚合酶，具有反轉錄活性;P區(qū)基因突變主要見于POL/RT基因片段，導致耐藥株的出現(xiàn);X區(qū)與病毒復制轉錄有關。HBV X基因(核苷酸位點1374～1838)編碼的HBx蛋白是病毒分泌的包含154個氨基酸的一個多功能調節(jié)蛋白，和肝細胞的惡性轉化密切相關，HBx區(qū)突變可顯著增加肝癌的發(fā)生風險[36]。

2.4 病毒抗原 HBsAg、HBeAg與HBsAg本質是糖基化包膜蛋白，是由肝細胞整合、DNA轉錄與翻譯后產(chǎn)生的，HBeAg陽性與HBsAg陽性均與HBV DNA水平呈正相關[37]。血清HBsAg和HBeAg水平與HBV慢性感染免疫清除期的肝臟病理分期有關。在一項聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)聯(lián)合核苷類似物(NAs)治療慢性乙型肝炎的研究發(fā)現(xiàn)，低基線HBV DNA和低HBsAg水平的患者比其他人群更快地實現(xiàn)HBsAg清除[38]。Nina[39]研究發(fā)現(xiàn)HBs特異性T細胞的數(shù)量與血清HBsAg水平呈正相關。在對慢性HBV感染者免疫細胞的分析中，發(fā)現(xiàn)HBsAg暴露時間而不是HBsAg的量與抗HBV免疫應答水平有關。

HBeAg是HBV核心顆粒中的一種可溶性蛋白質。一般情況下埋藏于HBcAg內部，當HBcAg裂解時，HBeAg從肝細胞核內溶入血清，它的出現(xiàn)遲于HBsAg，而消失卻早于HBsAg。此外，HBeAg通過PI3K和NF-κB信號途徑增加巨噬細胞miR-155的表達，miR-155通過抑制BCL-6、SHIP-1和SOCS-1的表達促進HBeAg誘導的炎性細胞因子的產(chǎn)生,引起肝細胞損傷[40]。

3 小結

NAs治療可有效抑制HBV DNA復制,但HBeAg血清學轉換率及HBsAg清除率均較低，難以實現(xiàn)臨床治愈。了解CHB的發(fā)病機制有助于指導其臨床監(jiān)測、治療及預防。HBV感染慢性化不是單一因素作用的結果,與宿主本身、病毒基因型、病毒載量等多因素相關?，F(xiàn)代研究主要集中于患者與健康者的相關實驗室指標的比較，來推測其與乙肝慢性化相關程度，進一步應用于臨床治療還需要繼續(xù)深入研究和辨析。