飼料精氨酸水平對(duì)松浦鏡鯉幼魚生長(zhǎng)、抗氧化能力和腸道消化酶活性及其組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

李晉南，張圓圓，范澤，吳迪，王連生

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省水生動(dòng)物病害與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

精氨酸（Arg）作為功能性氨基酸在機(jī)體的各種生理活動(dòng)中起重要作用，如促進(jìn)蛋白質(zhì)代謝、提高機(jī)體的免疫力、促進(jìn)激素的分泌、提高繁殖力等，此外還是多種活性物質(zhì)的前體[1-3]。Arg 是魚的必需氨基酸。不同魚對(duì)精氨酸的需求量為1.0%～3.1%，相當(dāng)于日糧蛋白的3.8%～8.1%[4]。Chen 等[5]認(rèn)為，建鯉（Cyprinus carpio var.Jian）對(duì)精氨酸的需求為日糧蛋白質(zhì)的5.29%。Arg 在哺乳動(dòng)物中的研究較多[6,7]；飼料中添加精氨酸可以提高魚的增重率，降低餌料系數(shù)，提高蛋白質(zhì)效率[8-10]。

精氨酸具有多種生理功能，尤其是在促進(jìn)機(jī)體的抗氧化和免疫功能方面受到了廣泛關(guān)注[11]。精氨酸可以提高大鼠的抗氧化酶活性，降低丙二醛含量，減少氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷[12]。目前，關(guān)于飼料中精氨酸水平對(duì)鯉幼魚腸道功能及抗氧化能力影響的研究報(bào)道尚不多見。松浦鏡鯉是在德國鏡鯉選育系（F4）的基礎(chǔ)上選育出的具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新品種。本研究通過在飼料中添加不同水平的精氨酸，研究其對(duì)松浦鏡鯉生長(zhǎng)性能及腸道健康的影響，以期為精氨酸在配合飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用松浦鏡鯉初始體質(zhì)量為（6.84±0.02）g，來自中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實(shí)驗(yàn)站。

L-精氨酸購自Sigma，純度≥98.5%。實(shí)驗(yàn)飼料蛋白源為魚粉和酪蛋白，脂肪源為魚油和豆油，精氨酸添加水平為0%（A0）、0.6%（A0.6）、1.2%（A1.2）、1.8%（A1.8）和2.4%（A2.4）；用甘氨酸調(diào)節(jié)氮平衡，配制5 種蛋白質(zhì)含量為32.24%、脂肪含量為6.12%的等氮等能飼料。將配制并混勻后的飼料加入魚油和豆油，再次混勻過篩后，加適量的水制成顆粒飼料。實(shí)驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)組成見表1[13]。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)組成（干重）Tab.1 Ingredients and approximate composition in the basal diets（air-dry basis）/%

1.2 方法

選擇規(guī)格一致，體質(zhì)健壯的松浦鏡鯉360 尾，預(yù)飼14 d 后隨機(jī)分為5 組，每組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18 尾，飼養(yǎng)在室內(nèi)體積為200 L 的控溫循環(huán)水族箱中，24 h 不間斷供氧，分別飼喂上述含精氨酸的5種飼料8 周。實(shí)驗(yàn)水溫為（23±1）℃，溶解氧濃度＞5 mg/L，氨氮＜0.02 mg/L，pH7.05～7.20，每周換去水族箱內(nèi)2/3 水，注入已曝氣的水。每天8:00、12:00 和17:00 定時(shí)投喂3 次，以飽食無殘餌為準(zhǔn)，每日清除缸內(nèi)糞便，記錄魚攝食和死亡情況。

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，停食12 h，稱量末重，統(tǒng)計(jì)存活數(shù)。每缸隨機(jī)取3 尾魚，經(jīng)M-222 麻醉后，稱量體質(zhì)量和體長(zhǎng)，迅速在冰盤中解剖，取出腸道后測(cè)量腸質(zhì)量和腸長(zhǎng)。分別取0.5 cm 的前腸、中腸和后腸組織段固定于Bouin 氏液中，保存在4℃冰箱中，用于后續(xù)腸道組織結(jié)構(gòu)分析。剩余的各腸段樣品分裝于密封袋中，保存于-40℃冰箱中，用于測(cè)定消化酶活性和抗氧化指標(biāo)。

腸道消化酶的測(cè)定：將前中后腸的組織樣品用0.86%生理鹽水制成10%的組織勻漿液，離心取上清液后，分裝于1.5 mL 離心管存于-20℃冰箱中備用[13]。

淀粉酶和脂肪酶活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，按說明書測(cè)定。利用福林-酚（Folin-phenol）法測(cè)定蛋白酶活性，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定組織中蛋白含量[13]。

腸道抗氧化指標(biāo)的測(cè)定：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、一氧化氮合酶（NOS）活性與谷胱甘肽（GSH）、總抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA）含量均采用南京建成試劑盒，參照試劑盒說明書測(cè)定。

腸道組織結(jié)構(gòu)的測(cè)定與觀察：腸道組織樣品從Bouin 氏液取出后，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片機(jī)切成厚度為5 μm 切片、HE 染色制成腸道組織切片。在帶有拍照系統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡下（Leica MD 4000B）觀察并拍照，用Motic Images Plus 2.0 軟件對(duì)每個(gè)腸段的皺襞高度、絨毛寬度和肌層厚度等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量，每張切片測(cè)量10 個(gè)以上，取其平均值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

根據(jù)實(shí)驗(yàn)魚初體質(zhì)量、末體質(zhì)量、體長(zhǎng)、腸質(zhì)量和腸長(zhǎng)，計(jì)算特定生長(zhǎng)率（specific growth rate，SGR）、腸體指數(shù)（Intestinal somatic index，ISI）和腸長(zhǎng)指數(shù)（Intestinal length index，ILI）。

特定生長(zhǎng)率（SGR）=（Ln末體質(zhì)量－Ln初體質(zhì)量）×100/天數(shù);

腸體指數(shù)（ISI）=腸質(zhì)量/體質(zhì)量×100%；

腸長(zhǎng)指數(shù)（ILI）=腸長(zhǎng)/體長(zhǎng)×100%。

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，利用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s 多重比較，顯著性水平P 為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料精氨酸水平對(duì)松浦鏡鯉幼魚生長(zhǎng)性能的影響

由表2 可知，添加精氨酸各組松浦鏡鯉的末體質(zhì)量（FBW）和特定生長(zhǎng)率（SGR）顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；A1.2 組和A1.8 組腸體指數(shù)顯著高于A0組（P＜0.05）；A1.8 和A2.4 組的腸長(zhǎng)指數(shù)顯著高于A0 組（P＜0.05）。

表2 攝食不同精氨酸水平飼料的松浦鏡鯉的生長(zhǎng)性能Tab.2 Growth performance of juvenile Songpu mirror carp fed diets containing various levels of arginine

2.2 飼料精氨酸水平對(duì)松浦鏡鯉幼魚腸道消化酶活性的影響

由表3 可知：飼料中添加精氨酸對(duì)中腸蛋白酶活性沒有顯著影響（P＞0.05），添加2.4%精氨酸組前腸蛋白酶活性顯著高于A0、A0.6 和A1.2 組（P＜0.05），A1.8 和A2.4 組后腸蛋白酶活性顯著高于A0 組（P＜0.05）；飼料中添加精氨酸對(duì)后腸脂肪酶活性沒有顯著影響（P＞0.05），A1.8 和A2.4 組前腸和中腸脂肪酶活性顯著高于A0 組（P＜0.05）；飼料中添加精氨酸對(duì)前腸和后腸淀粉酶活性沒有顯著影響（P＞0.05），A1.8 組中腸淀粉酶活性顯著高于A0 組（P＜0.05）。

表3 攝食不同精氨酸水平飼料的松浦鏡鯉腸道消化酶的活性Tab.3 Intestine digestive enzyme activities of juvenile Songpu mirror carp fed diets containing various levels of arginine

2.3 飼料精氨酸水平對(duì)松浦鏡鯉幼魚腸道抗氧化能力的影響

由表4 可知，A1.2 組松浦鏡鯉前腸和中腸CAT活性顯著高于A0 組（P＜0.05），而后腸CAT 活性各組間沒有顯著差異（P＞0.05）。A2.4 組前腸T-AOC顯著高于其他各組（P＜0.05），且其后腸T-AOC 顯著高于A0 組（P＜0.05），A1.8 組中腸T-AOC 顯著高于A0 組和A0.6 組（P＜0.05）。各實(shí)驗(yàn)組間MDA 含量差異不顯著（P＞0.05）。A2.4 組前腸SOD 活性顯著高于其他各組（P＜0.05），其中腸SOD 活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），各添加組后腸SOD 活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。A1.8 和A2.4 組前腸GSH 含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），A2.4 組中腸GSH 含量顯著高于A0、A0.6 和A1.2 組（P＜0.05），A1.2、A1.8 和A2.4 組后腸GSH 含量顯著高于A0 組（P＜0.05）。A2.4 組前腸和中腸NOS 活性顯著高于其他各組（P＜0.05），各添加組后腸NOS 活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表4 攝食不同精氨酸水平飼料的松浦鏡鯉的腸道抗氧化能力Tab.4 Intestine digestive antioxidant capacity of juvenile Songpu mirror carp fed diets containing various levels of arginine

2.4 飼料精氨酸水平對(duì)松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響

飼料中添加精氨酸顯著影響了腸道的皺襞高度，腸絨毛寬度和肌層厚度。由圖1 可知：添加精氨酸顯著增加了松浦鏡鯉前腸皺襞高度（P＜0.05），與A0 組相比，添加1.8%和2.4%精氨酸顯著提高了中腸和后腸的皺襞高度（P＜0.05）。各組前腸和后腸絨毛寬度差異不顯著（P＞0.05），與A0 組相比，添加1.8%和2.4%精氨酸顯著增加了中腸的絨毛寬度（P＜0.05）。前腸肌層厚度各實(shí)驗(yàn)組間差異不顯著（P＞0.05），A1.2 組中腸肌層厚度顯著高于其他各組（P＜0.05），A1.8 組后腸肌層厚度顯著高于A0 組（P＜0.05）。

圖1 飼料中精氨酸水平對(duì)松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響Fig.1 Effects of dietary arginine levels on the intestinal morphology of Songpu mirror carp

3 討論

精氨酸參與體內(nèi)蛋白質(zhì)和多胺的合成，可以提高魚類的生長(zhǎng)性能[8-10,14-16]。本實(shí)驗(yàn)中，飼料中添加0.6%以上的精氨酸，顯著提高了松浦鏡鯉幼魚的末質(zhì)量和SGR，但各添加組間差異不顯著，說明飼料中添加0.6%左右的精氨酸便可以顯著提高松浦鏡鯉幼魚的生長(zhǎng)性能，過量的精氨酸對(duì)松浦鏡鯉的生長(zhǎng)沒有顯著的促進(jìn)作用。對(duì)黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[17]和尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus L.）[8]的研究表明，其生長(zhǎng)性能隨著飼料精氨酸水平的進(jìn)一步增加而呈下降趨勢(shì)，其可能是存在精氨酸與賴氨酸的拮抗作用。

鯉無胃，腸道是消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所。機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力以腸道中的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性來衡量[18]。精氨酸及其代謝產(chǎn)物能提高腸道中消化酶活性，提高魚類的生長(zhǎng)速度[16,19]。對(duì)建鯉的研究表明，飼料中精氨酸水平對(duì)淀粉酶活性無顯著影響，但顯著提高了蛋白酶和脂肪酶活性[5]。Zhou 等[19]對(duì)黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）幼魚的研究表明，精氨酸可以提高魚體前腸和中腸胰蛋白酶活性，以及前腸淀粉酶活性。對(duì)仿刺參（Apostichopus japonicus）的研究表明[20]，飼料精氨酸水平可以顯著影響腸道蛋白酶的活性，而對(duì)脂肪酶和淀粉酶活性影響不顯著。飼料中添加精氨酸顯著提高了雜交鱘（Acipenser schrrenckii ♀×A.baeri ♂）前腸蛋白酶和淀粉酶活性[21]。對(duì)黃顙魚幼魚的研究表明，適宜水平的精氨酸可以提高胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性及肝臟淀粉酶活性[21]。本研究同樣表明，精氨酸能夠通過提高松浦鏡鯉腸道的消化酶活性，從而提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。

SOD、CAT 及GSH 是生物體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，可以有效清除活性氧自由基以保護(hù)機(jī)體組織免受損傷[22,23]。MDA 是脂肪氧化的終產(chǎn)物之一，能夠反映機(jī)體細(xì)胞受損傷程度[24]。總抗氧化能力（T-AOC）與機(jī)體的健康程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，飼料中添加適宜水平的精氨酸增加了松浦鏡鯉幼魚腸道T-AOC、SOD 和CAT 活性，提高了GSH 含量和腸道的抗氧化能力。這一結(jié)果與吳俊光等在鱘魚上的研究結(jié)果一致[25]。飼料中精氨酸水平能顯著提高斑點(diǎn)叉尾（Ictalurus punctatus）肝臟中SOD活力[26]。精氨酸是體內(nèi)多胺、一氧化氮等活性物質(zhì)合成的前體，其能夠在NOS 的催化下生成一氧化氮（NO），而NO 具有殺菌和抑菌作用，可以清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基[27]，提高抗氧化酶的活性。封福鮮等[28]的研究表明，瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）血清NOS 活性隨Arg 水平的升高而升高。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著飼料中精氨酸水平的增加，腸道NOS 活性顯著增高，進(jìn)一步增強(qiáng)了魚體的免疫力。

影響魚類消化吸收能力的不僅僅是腸道消化酶活性，腸道本身形態(tài)結(jié)構(gòu)及發(fā)育情況同樣影響魚類對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[29]，其中影響魚類腸道消化吸收能力的重要指標(biāo)包括腸道皺襞的高度、密度及排列狀態(tài)等[30,31]。精氨酸能顯著提高雜交鱘幼魚前腸的皺襞高度、絨毛高度和肌層厚度，以及中腸的皺襞高度[20]。在美國紅魚（Sciaenops ocellatus）和雜交條紋鱸（Morone chrysops×Morone saxatilis）的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[16,32]。隨精氨酸添加水平的升高，斜帶石斑魚（Epinephelus malabaricus）前中后腸的肌層厚度、皺襞高度均升高[33]。本實(shí)驗(yàn)得到了相似的結(jié)果，適宜水平的精氨酸對(duì)松浦鏡鯉腸道皺襞高度、絨毛寬度和基層厚度都有顯著的改善。這說明精氨酸可以通過促進(jìn)腸道的發(fā)育，提高腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，從而促進(jìn)魚體的生長(zhǎng)。此外有研究表明，精氨酸可以增加腸道重量[34,35]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了精氨酸可以促進(jìn)腸道的健康發(fā)育。

綜上，精氨酸可以顯著提高松浦鏡鯉腸道的消化吸收功能及腸道的發(fā)育，適宜的添加水平為1.8%～2.4%。