顧博文，楊勁峰，魯曉玲，吳怡慧，李娜，劉寧，安寧，韓曉日

連續(xù)施用生物炭對花生不同生育時期葉綠素熒光特性的影響

顧博文1，楊勁峰1，魯曉玲2，吳怡慧1，李娜1，劉寧1，安寧1，韓曉日1

1沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境學院/土壤肥料資源高效利用國家工程實驗室/農業(yè)農村部東北玉米營養(yǎng)與施肥科學觀測實驗站，沈陽 110866;2山東大學海洋學院，山東威海 264209

【】通過測定花生不同生育時期功能葉片的葉綠素熒光特性，探討連續(xù)9年施用不同用量生物炭對花生葉片光系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞、光能吸收和氧化還原性能影響規(guī)律，同時觀測葉片放氧復合體（OEC）受損程度變化趨勢，為指導花生施肥提供理論支撐。于2011年建立的田間定位試驗，設3個處理：CK（不施肥）；C15（生物炭225 kg·hm-2）；C50（生物炭750 kg·hm-2）。2019年分別采集不同生育時期花生功能葉，利用M-PEA-2儀器測定暗處理后的葉片光合指標。通過分析不同生育時期花生功能葉葉綠素熒光參數(shù)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)施用不同用量生物炭對快速葉綠素熒光動力學曲線（OJIP曲線）有顯著影響。C15處理的K點的相對可變熒光強度差（ΔVT）在花生苗期和開花下針期分別為-0.002和-0.020，在結莢期和成熟期分別為-0.024和-0.053，與CK處理相比花生各生育時期功能葉K點的相對可變熒光強度顯著降低；隨著生物炭用量的增加，開花下針期與成熟期K點降低幅度有不同程度增大?；ㄉδ苋~葉綠素熒光參數(shù)在開花下針期和成熟期對生物炭的連續(xù)施用有積極響應，其具體表現(xiàn)為：在開花下針期，與CK處理相比C15處理的J點相對可變熒光強度（VJ）降低23.9%，初級醌受體（QA）被還原速率（MO）降低32.1%，捕獲的激電子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA下游的其他電子受體的速率（ΨO）增加25.0%，以吸收光能為基礎的光化學性能指數(shù)（PIABS）增加154.6%。緩解了花生功能葉片的放氧復合體（OEC）受損程度，提高電子由初級醌受體（QA）向電子傳遞鏈下游的其他電子受體傳遞的能力，隨著生物炭用量的增加，效果越明顯。在成熟期，施用不同量生物炭對花生葉片葉綠素熒光特性指標的影響與開花下針期基本一致，具體表現(xiàn)為：C15處理較CK處理J點相對可變熒光強度（VJ）和初級醌受體（QA）被還原速率（MO）顯著降低，分別減少12.5%和16.0%，捕獲的激電子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA下游的其他電子受體的速率（ΨO）增加7.8%，以吸收光能為基礎的光化學性能指數(shù)（PIABS）增加73.7%；C50處理與CK處理相比J點相對可變熒光強度（VJ）減少13.2%，初級醌受體（QA）被還原速率（MO）減少19.4%，捕獲的激電子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA游的其他電子受體的速率（ΨO）增加8.2%，以吸收光能為基礎的光化學性能指數(shù)（PIABS）增加79.7%。連續(xù)施用生物炭能顯著提高花生功能葉片在開花下針期和成熟期光系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞效率，緩解OEC損傷程度，從而提高花生功能葉的光合性能。

生物炭；花生；葉綠素熒光；快速葉綠素熒光動力學曲線

0 引言

【研究意義】花生是我國重要的油料作物和經濟作物之一，是國民經濟發(fā)展和維護國家糧食安全的重要保障[1]。葉片的光合作用是植物進行物質積累的重要過程[2]，是影響花生產量的關鍵因素之一。在自然條件下，葉綠素熒光和光合作用之間有著十分密切的聯(lián)系，能在降低強光傷害的同時，通過與光合速率之間存在相互負聯(lián)系反映光合速率的大小[3]。施用生物炭能夠顯著提高花生產量[4]，明確生物炭對花生光合性能影響的作用機理至關重要。【前人研究進展】快速葉綠素熒光誘導動力學是研究光合原初反應的無損傷探針，能夠在反映PSII的原初光化學反應和光合機構狀態(tài)的變化的同時敏銳地反應環(huán)境變化對于植物生理的影響，并且能夠應用于多個研究方面[5]。如化學條件(除草劑、化肥等）對植物的影響，趙麗娟等[6]的研究表明土壤中有氯吡嘧磺隆殘留時紅蕓豆幼苗葉片中的QA、QB和質體醌之間的電子傳遞會受到阻礙，光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）活性被抑制，PIABS可以靈敏地反映植物葉片受到氯吡嘧磺隆脅迫下的損傷程度。KALTRINA等[7]的研究表明，在土壤氮含量較低時相同物種之間會出現(xiàn)營養(yǎng)脅迫現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為初級醌受體（QA）快速減少，光系統(tǒng)II（PSII）供體位點的能力降低和以吸收光能為基礎的性能指數(shù)（PIABS）降低。尹賾鵬等[8]研究表明鹽脅迫會導致PSII電子供體側放氧復合體（OEC）的活性降低及PSII電子受體側電子由初級醌受體QA向次級醌受體QB的傳遞過程受阻。在環(huán)境物理因素方面，強光會造成植物葉片光系統(tǒng)功能的抑制[9]，如秦立琴等[1]在研究強光高溫脅迫（HH）和干旱高溫脅迫（DH）對花生光合作用影響時發(fā)現(xiàn)，PSII反應中心的受體側更容易受到高溫和干旱的影響。水分狀況對光合系統(tǒng)也有影響，如長期淹水脅迫會導致紫丁香幼苗有活性PSⅡ反應中心數(shù)量降低，葉片PSⅡ電子受體側由QA向QB的傳遞受阻，QA被過度還原，QA-大量積累，導致紫丁香幼苗葉片PS Ⅱ發(fā)生明顯的光抑制[10]。生物炭是農林廢棄物等有機材料在缺氧或低氧環(huán)境中經熱裂解產生的固體產物[11]，其表面含有羧基、羥基和芳香環(huán)等官能團[12-13]，具有自身容重小、孔隙多、比表面積大、呈堿性和高CEC等特性[14-15]。研究表明[16-17]生物炭能從多方面改良土壤性狀，因生物炭自身特性，當生物炭施入土壤后能達到疏松土壤、降低土壤板結程度的效果，促進作物生長等。研究表明添加80 g·kg-1生物炭能有效提高海棠的株高、鮮重和光合參數(shù)。施用高量生物炭能促進小麥群體葉面積指數(shù)增大[18-19]。JEFFERY等[20]的研究也表明在土壤中施用生物炭能提高作物產量，且增幅可達10%。作物產量的提高，光合作用是關鍵的促進因子?！颈狙芯壳腥朦c】目前關于生物炭在農業(yè)上的研究多集中在研究其對土壤性質的影響，植物生長的響應等方面，而其對植物光合特性的影響研究比較罕見。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)[21]，施用生物炭可以引起花生開花下針期葉片葉綠素熒光誘導曲線顯著變化，提高電子傳遞和光能吸收效率，進而促進光合作用。但對于是否會對花生整個生育時期葉片光合效率產生影響，施用的年限長短是否會持續(xù)產生正效應或負效應均不是十分清楚?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用大田長期定位試驗，研究了連續(xù)9年施用不同用量生物炭后，花生在主要生育時期葉片光合效率的變化規(guī)律，為生物炭及其衍生產品在抵抗外界環(huán)境脅迫、促進光合性能提升等方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

田間試驗位于沈陽農業(yè)大學肥料長期定位試驗科研基地（123°33′ E，40°48′N）。該基地地處松遼平原南部中心地帶，屬于溫帶濕潤-半濕潤季風氣候，年均氣溫為7.0—8.1℃，10℃以上積溫3 300—3 400℃，無霜期為148—180 d，生長季平均降雨量為547 mm；試驗地為旱地棕壤，屬于發(fā)育在第四紀黃土性母質上的簡育濕潤淋溶土[21]。

1.2 試驗設計

長期定位試驗始建于2011年，采用一年一熟花生連作的種植制度，2011—2014年品種為花育33，2015—2016年品種為阜花12號150GY，2017—2019年品種為島222-1。種植密度均為15 萬穴/hm2，每穴種植2株。試驗設3個處理：CK（不施肥）、C15（生物炭225 kg·hm-2）、C50（生物炭750 kg·hm-2）。生物炭作基肥一次施入，施入深度為15—20 cm，覆土。每個處理重復3次，小區(qū)面積 27 m2，隨機排列。生物炭（C 33.3%、N 0.3%、P2O50.2%、K2O 2.4%）的制備：采用玉米芯為主要原料，在450℃裂解并通過80—100目篩子后造粒。

1.3 樣本采集

植物樣本于2019年花生不同生育時期（苗期、開花下針期、結莢期、成熟期）采集，每個小區(qū)隨機選取5片花生功能葉（最新完全展開葉片），放入自封袋，保存于0℃冰盒中迅速帶回實驗室。所有葉片依次采用葉片夾夾住葉片中部，進行30 min暗適應，然后采用M-PEA-2型植物效率儀（Hansatech，英國）進行測定。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 快速葉綠素熒光誘導動力學曲線的測定 采集的葉片先暗適應30 min，然后應用連續(xù)激發(fā)式熒光儀M-PEA-2(Hansatech，英國)測定葉片快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP曲線)。OJIP曲線由3 000 μmo1·m-2·s-1的脈沖光誘導，熒光信號儀記錄是從10 μs開始，至1 s結束，記錄的初始速率為每秒鐘118個數(shù)據。

1.4.2 JIP-test分析 根據王帥等[22]和李鵬民[23]的方法，對獲得的OJIP熒光誘導曲線進行分析。分析時需明確OJIP曲線上的K點相對可變熒光強度差ΔVt,J點的相對可變熒光VJ；QA被還原速率MO；捕獲的激電子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA下游的其他電子受體的速率Ψo；以吸收光能為基礎的光化學性能指數(shù)PIABS等。

1.5 統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據采用Microsoft Excel 2010處理，SPSS19.0軟件進行單因素方差分析和鄧肯檢驗（＜0.05）。

2 結果

2.1 不同處理對OJIP曲線的影響

圖1是以不施肥的CK處理OJIP曲線為參照，將C15和C50處理的OJIP曲線標準化后得到的花生功能葉片在不同生育時期的相對可變熒光強度差（ΔVt）曲線。如圖所示，C15處理的K點的相對可變熒光強度差（ΔVt）在各生育時期分別為-0.002、-0.020、-0.024和-0.053，表明施用少量生物炭能降低K點相對可變熒光強度。當增加生物炭的用量時（C50處理），開花下針期（圖1-b）和成熟期（圖1-d）K點相對可變熒光強度持續(xù)降低，K點相對可變熒光強度差為-0.021和-0.071，與同時期的C15處理相比K點下降幅度增加了5%和34.0%。但在苗期（圖1-a）和結莢期（圖1-c），K點的ΔVt分別為0.013和0.026，表明增施生物炭（C50處理）使K點相對可變熒光強度值增加。

圖1 施用不同量生物炭不同生育時期的花生功能葉片相對可變熒光強度差（ΔVt）曲線（a.苗期；b.開花下針期；c.結莢期；d.成熟期）

2.2 不同施肥處理對花生功能葉VJ的影響

VJ反映了2 ms時有活性的反應中心的關閉程度，其大小變化能夠反映電子傳遞體QA的被還原量，即QA-的積累程度，是衡量OEC受損程度的指標之一[24]。如圖2所示，在花生苗期與結莢期，施用不同量的生物炭對花生功能葉片的VJ值均無顯著影響。在開花下針期，C15處理的VJ值遠低于CK處理，降低幅度達23.9%，隨著生物炭用量的增加，C50處理的VJ值繼續(xù)降低，與CK相比降低了26.9%，但與C15相比二者差異不顯著。進入成熟期后，施用低量生物炭的花生葉片的VJ值顯著降低，與CK相比減少12.5%，當采用高量生物炭投入時，C50的VJ值與CK處理相比降低了13.2%，C50和C15相比，VJ降低的幅度增大，但二者無顯著差異。

2.3 不同處理對花生功能葉片MO的影響

MO為相對熒光的曲線的原初斜率，即O-J過程中QA被還原的速率，它與反應中心色素、捕光色素和QA所處的狀態(tài)有關，反映QA被還原的相對速率[23]。如圖3所示，在花生苗期和結莢期施用不同量的生物炭對花生葉片的MO值沒有顯著影響。在開花下針期和成熟期，不同生物炭用量的花生功能葉片的MO值與CK相比均有降低，施用低量生物炭的C15處理的Mo值與CK相比在兩個生育時期分別降低了32.1%和16.0%，施用生物炭量較高的C50的Mo值與CK相比分別降低了35.4%和19.4%，C50與C15處理相比Mo值降低的幅度增加，但兩種處理間無明顯的差異。

不同字母表示差異顯著（P＜0.05）

不同字母表示差異顯著（P＜0.05）

2.4 不同處理對花生功能葉PIABS的影響

PIABS是以吸收光能為基礎的性能指數(shù)，是反映PSⅡ光化學效率的重要指標之一[10]。如圖4可知，在苗期、結莢期，施用生物炭對花生功能葉片的PIABS值無顯著影響。在開花下針期，C15處理的PIABS值比CK處理提高了154.6%，隨著生物炭用量的增加，葉片光化學效率有增加趨勢，C50比CK的值提高了178.9%，但C15與C50之間無顯著差異。到花生成熟期時，觀察到相同規(guī)律， 施用生物炭均可以顯著提高PIABS值，與CK相比提升幅度分別為73.7%和79.7%，隨著生物炭用量的增加，提高幅度增強但并不顯著。

2.5 不同處理對花生功能葉ψo值的影響

ψo反映了反應中心捕獲的激子能將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA的其他電子受體的概率，即2 ms時有活性的反應中心的開放程度[25]。如圖5所示在苗期和結莢期，施用生物炭對花生功能葉片的ψo值沒有顯著的影響。在開花下針期和成熟期，施用生物炭能顯著增加花生功能葉片的ψo值，施用低量生物炭的C15處理比同時期的不施肥的CK處理高出25.0%和7.8%，施用高量生物炭的C50處理比同時期的不施肥的CK處理高出25.5%和8.2%，增施生物炭有提高花生功能葉片在開花下針期和成熟期ψo值的增幅的趨勢。

不同字母表示差異顯著（P＜0.05）

不同字母表示差異顯著（P＜0.05）

3 討論

肥料長期定位試驗以長期固定的施肥模式按不同的方向持續(xù)改變土壤性質，能夠增大各處理間生產特性的差距，有利于系統(tǒng)研究作物演變特性[26]。而葉綠素熒光的變化能夠在一定程度上反映植物對環(huán)境的響應，當植物處于不同環(huán)境條件時，通過分析快速葉綠素熒光誘導動力學曲線，能深入了解環(huán)境對植物光合機構主要是PSⅡ反應中心的影響以及光合機構對環(huán)境的適應機制[27]。有研究表明[21]，施用一定量的生物炭能提高花生營養(yǎng)生長時期（開花下針期）葉片光系統(tǒng)中電子的傳遞、光能的吸收、氧化還原性能，同時降低葉片放氧復合體（OEC）受損程度，但隨著生物炭用量逐漸增大效果減弱。

3.1 施用生物炭對花生功能葉片OEC的影響

K點是OJIP曲線上照光后大約 0.3 ms處的特征位點，作為OEC受損的一個特殊標記，K點被廣泛關注[23,28]。研究表明，當PSII的供體側受到非生物環(huán)境脅迫如溫度、干旱等，會造成放氧復合體（OEC）結構和功能的改變，導致水光解受到抑制，OEC向PSII提供的電子減少，導致光合電子傳遞鏈效率降低，引起光合速率下降，使OJIP曲線上K點上升[29-30]。本研究中花生功能葉片在各個生育時期的OJIP曲線均出現(xiàn)K相，表明OEC的活性受到損傷，PSII反應中心供應電子的能力和傳遞電子的能力失衡[31]。施用少量生物炭能降低各生育時期K點相對可變熒光強度（ΔVt＜0），緩解花生葉片PSII水裂解系統(tǒng)的抑制，表明施用少量生物炭能緩解逆境對放氧復合體的損傷。當增加生物炭用量，開花下針期和成熟期K點相對可變熒光強度值降低程度較C15處理有所增加，但苗期和結莢期施用高量生物炭K點的相對可變熒光強度差為正值，表明該時期高生物炭用量對OEC的受損無緩解作用。研究表明[1]高溫是導致OJIP曲線K點出現(xiàn)的原因之一，而施用生物炭會加深土壤顏色，增加土壤溫度，這可能是C50處理增加苗期和結莢期K點相對可變熒光強度的原因。

3.2 施用生物炭對花生功能葉片電子傳遞的影響

逆境下，PSⅡ受體側電子傳遞受阻導致光合電子鏈上電子過剩，其原因主要是植物被光照后，被激發(fā)的電子由Pheo傳給QA生成QA-時間極短，僅為250—300 ps，由QA-傳遞到QB的時間卻需要100—200 μs，因此逆境條件下QA向QB電子傳遞容易受阻，造成QA-的積累，而OJIP曲線上2 ms時J點相對熒光強度（VJ）恰好反映QA-的積累量，即可以間接反映 PSⅡ反應中心受體側電子由QA向QB的傳遞能力[25,32]。本試驗中，連續(xù)施用生物炭能顯著降低了開花下針期和成熟期OJIP曲線上2 ms時的VJ值、熒光曲線初始上升斜率MO值，表明生物炭的施用能提高反應中心活性，降低開花下針期和成熟期2 ms時PSⅡ有活性反應中心關閉程度，提高QA-被還原的速率。與此同時Ψo升高，Ψo值受PSⅡ供體側的電子供應能力和受體側(包括PSI)接受電子的能力制約。李書鑫等[33]研究表明，當遇到低溫脅迫時，葉片反應中心光能捕獲及分配發(fā)生變化，甚至會造成 PSⅡ反應中心失活，這進一步表明生物炭的施用能緩解環(huán)境逆境帶來的損傷，提高花生功能葉片PSⅡ受體側QB接受電子的能力，提高電子由QA傳遞到 QB的速率。

PIABS包含大量關于SPⅡ反應中心原初光化學反應的信息，不僅能反映 PSⅡ反應中心對光能的捕獲情況，還可以反映PSⅡ反應中心下游的電子傳遞情況[33-34]。原佳樂等[35]研究表明PIABS對干旱敏感，干旱會降低植物葉片的PIABS值。施用生物炭能顯著提高開花下針期和成熟期的花生葉片的PIABS性能指數(shù)，表明施用生物炭能提高花生該時期的抗旱性，使花生葉片最大光化學效率提高，增強PSⅡ潛在活性和光合作用原初反應，促使其整體的光合性能增強，顯著提高花生葉片的光合效率。

4 結論

連續(xù)施用生物炭可以有效地緩解花生開花下針期和成熟期葉片放氧復合體的受損程度，且隨著生物炭用量增加，效果有增加趨勢。提高花生葉片光合效率的關鍵時期主要出現(xiàn)在開花下針期和成熟期，有效降低了開花下針期和成熟期2 ms葉片反應中心關閉程度（VJ值）和活性（MO值），提高了該時期吸收光能為基礎的性能指數(shù)（PIABS）和電子傳遞速率（Ψo），降低了OEC受損程度。

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Effects of Continuous Application of Biochar on Chlorophyll Fluorescence Characteristics of Peanut at Different Growth Stages

GU BoWen1,YANG JinFeng1, LU XiaoLing2,WU YiHui1, LI Na1, LIU Ning1, AN Ning1, HAN XiaoRi1

1College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University/National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources/Monitoring & Experimental Station of Corn Nutrition and Fertilization in Northeast Region, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shenyang 110866;2Marine College, Shandong University, Weihai 264209, Shandong

【】By measuring the photosynthetic performance indexes of functional leaves of peanut at different growth stages, the effects of different amounts of biochar on electron transport, light energy absorption and redox properties of peanut leaves photosome II were studied for 9 years in a row. Meanwhile, the change trend of leaf oxygen evolution complex (OEC) damage degree was observed to provide the theoretical support for guiding peanut fertilization. 【】A field experiment was conducted in 2011 with three treatments: CK (no fertilization), C15 (biochar 225 kg·hm-2), and C50 ( biochar 750 kg·hm-2). In 2019, the peanut functional leaves at different growth stages were collected, and the photosynthetic indexes of leaves after dark treatment were measured by M-PEA-2 instrument.【】By analyzing the chlorophyll fluorescence parameters of peanut functional leaves at different growth stages, it was found that continuous application of biochar had a significant effect on the rapid chlorophyll fluorescence kinetic curve (OJIP curve). The relative variable fluorescence intensity difference (ΔVt) of K point treated with C15 was -0.002 and -0.020 at seedling stage and flowering and needle setting stage, and -0.024 and -0.053 at pod setting stage and maturity stage. Compared with CK treatment, the relative variable fluorescence intensity of K point in functional leaves of peanut at different growth stages was significantly decreased; with the increase of biochar dosage, the decrease range of K point at flowering, needling and mature stages increased in varying degrees. The chlorophyll fluorescence parameters of peanut functional leaves had a positive response to the continuous application of biochar at the flowering, needling and maturity stages. Compared with CK treatment, the relative variable fluorescence intensity at the J-step (VJ) under C15 treatment decreased by 23.9%, the approximated initial slope of the fluorescence transient (MO) decreased by 32.1%, and the rate at which trapped excitons transfer electrons to other electron receptors downstream of QAin the electron transport chain (ΨO) increased by 25.0% .The performance index on absorption basis (PIABS) increased by 154.6%, which alleviated the damage of oxygen releasing complex (OEC) in peanut functional leaves and improved the ability of electron transfer from primary quinone receptor (QA) to other electron receptors downstream of electron transport chain, and its effect on chlorophyll fluorescence performance increased. With the increase of biochar dosage, the effect was more obvious. At the mature stage, the effects of biochar application on chlorophyll fluorescence characteristics of peanut leaves were basically consistent with those at flowering and needling stage. The specific performance was as follows: the relative variable fluorescence intensity at the J-step (VJ) and the approximated initial slope of the fluorescence transient (MO) under C15 treatment were significantly lower than those under CK treatment 12.5% and 16.0%, respectively, and the trapped excitons transferred electrons into the electron transfer chain (QA) .Compared with CK treatment, the relative variable fluorescence intensity at the J-step (VJ) decreased by 13.2%, and the approximated initial slope of the fluorescence transient (MO) decreased by 19.4%. The probability that a trapped exciton moved an electron into the electron transport chain beyond QA (ΨO)was 8.2%, and the performance index on absorption basis (PIABS) increased by 79.7%.【】Continuous application of biochar could increase the electron transfer efficiency of photosystem II in functional leaves of peanut at the time of flowering and maturity, and improve the photosynthetic performance of functional leaves of peanut during this period.

biochar; peanut; chlorophyll fluorescence; chlorophyll a fluorescence (OJIP) transient

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.006

2020-11-25；

2021-01-04

國家自然科學基金（32072679）、國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0200803）、國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系（CARS-13）

顧博文，E-mail：2019220426@stu.syau.edu.cn。通信作者楊勁峰，E-mail：yangjinfeng7672@syau.edu.cn。通信作者韓曉日，E-mail：hanxr@syau.edu.cn

（責任編輯 李云霞）