HPLC-FLD法同時測定直服丹參粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2

陽文武 王文婷 張 華 熊有明

重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000

丹參粉是唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)干燥根及根莖制成的粉末，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效[1]。丹參喜氣候溫和、空氣濕潤、土壤肥沃的環(huán)境，且其藥用部位直接與土壤接觸，易感染真菌[2-4]。黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的一類致癌性物質(zhì)，是目前為止發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素，其毒性相當(dāng)于砒霜的68倍，對人體及動物器官尤其是肝臟損害嚴(yán)重[5]。在植物來源的藥材中主要污染AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，其中AFB1 被公認(rèn)為是主要的有毒物質(zhì)，從2010年版《中國藥典》開始，就對部分中藥規(guī)定：AFB1不得過5 μg/kg，AF(B1+B2+G1+G2) 總量不得過10 μg/kg[1]。目前，關(guān)于直服丹參粉中真菌毒素含量測定的研究鮮有報道，而丹參粉配伍三七粉直接泡服已成為預(yù)防和治療心腦血管疾病的常用方式，因此對丹參粉中黃曲霉毒素的含量水平進行監(jiān)測對確保人民用藥安全具有十分重要的意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20A液相色譜儀(包括 LC-20AT 型四元泵、 SIL-20A 型進樣器、RF- 20A xs型熒光檢測器、CTO-20A 型柱溫箱，日本島津株式會)；SDLA-B-1101型超純水機(重慶圣德利醫(yī)療器械研究有限公司)；Waters固相萃取裝置(美國沃特世公司)；AB204S型天平(萬分之一，瑞士METTLER TOLEDO公司)；SIGMA4-16S離心機(德國SIGAM公司)；T25 digital ULTRA-TURRAX分散機(德國IKA公司)。

1.2 材料 乙腈、甲醇，均為色譜純(DIKMA科技公司)；AFB1 、AFB2、AFG1、AFG2混合對照品溶液濃度分別為0.93、0.30、0.93、0.35μg/mL(批號：610001-201703，中國食品藥品檢定研究院)。黃曲霉毒素免疫層析親和柱(Pribolab公司)；水為超純水。50批丹參粉樣品購自重慶市不同區(qū)縣的不同藥店(S1丹參粉,重慶康迪藥業(yè)有限公司,批號180701;S2丹參粉,成都康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司,批號181201331;S3丹參粉,云南向輝藥業(yè)有限公司,批號F20190405;S4丹參,成都市祺隆中藥飲片有限公司/包裝打粉;S5丹參,四川圣上大健康藥業(yè)有限公司/包裝打粉;S6丹參,四川圣上大健康藥業(yè)有限公司/包裝打粉;S7丹參,四川/散裝打粉;S8丹參粉,重慶康迪藥業(yè)有限公司,批號181101;S9丹參粉,太極集團四川綿陽制藥有限公司,批號1805002;S10丹參粉,云南向輝藥業(yè)有限公司,批號F20190108;S11丹參粉,東方紅西洋參藥業(yè)(通化)股份有限公司,批號190301;S12丹參粉,云南七丹藥業(yè)股份有限公司,批號1903004;S13丹參粉,太極集團四川綿陽制藥有限公司,批號1707002;S14丹參粉,太極集團四川綿陽制藥有限公司,批號1905001;S15丹參粉,重慶慧遠藥業(yè)有限公司,批號181201;S16丹參粉,北京深港藥業(yè)有限公司,批號1801006;S17丹參粉,云南向輝藥業(yè)有限公司,批號20190108;S18丹參,成都科欣藥業(yè)有限公司,批號180401/包裝打粉;S19丹參,四川圣上大健康藥業(yè)有限公司,批號180801/包裝打粉;S20丹參粉,四川國強中藥飲片有限公司,批號181001;S21丹參,四川同正堂中藥飲片有限公司,批號181001/包裝打粉;S22丹參粉,安徽省澤華國藥飲片有限公司,批號181001;S23丹參,希美(重慶)制藥有限公司,批號190401/包裝打粉;S24丹參粉,云南向輝藥業(yè)有限公司20180522;S25丹參粉,上醫(yī)正念堂(成都)醫(yī)藥科技有限公司,批號190601;S26丹參粉,北京同仁堂(安國)中藥飲片有限責(zé)任公司,批號1904008;S27丹參粉,黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司,批號8050103;S28丹參,安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司,批號19030406/包裝打粉;S29丹參,成都科欣藥業(yè)有限公司,批號180401/包裝打粉;S30丹參粉,洪雅縣瓦屋山藥業(yè)有限公司,批號181001;S31丹參,四川中江/散裝打粉;S32丹參,山東,批號180901/包裝打粉;S33丹參,四川中江/散裝打粉;S34丹參,四川中江/散裝打粉;S35丹參,四川中江/散裝打粉;S36丹參粉,成都康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司,批號181102011;S37丹參粉,成都康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司,批號181201851;S38丹參粉,重慶康迪藥業(yè)有限公司,批號180301;S39丹參粉,通化德濟參藥業(yè)有限公司,批號20180801;S40丹參粉,成都康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司,批號180700061;S41丹參粉,成都康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司,批號181201331;S42丹參粉,云南向輝藥業(yè)有限公司,批號F20180140;S43丹參粉,重慶康嘉藥業(yè)有限公司,批號190201;S44丹參粉,重慶康迪藥業(yè)有限公司,批號180901;S45丹參粉,云南七丹藥業(yè)股份有限公司,批號1901001;S46丹參粉,云南七丹藥業(yè)股份有限公司,批號1906010;S47丹參粉,云南向輝藥業(yè)有限公司,批號F20190405;S48丹參粉,太極集團四川綿陽制藥有限公司,批號1812004;S49丹參粉,湖北金貴中藥飲片有限公司,批號A190101;S50丹參粉,重慶康迪藥業(yè)有限公司,批號180601)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsustain C18(4.6 mm× 150 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；其余按《中國藥典》2015年版四部通則2351黃曲霉毒素測定法中規(guī)定設(shè)置[6]。在上述色譜條件下，AFB1 、AFB2、AFG1、AFG2色譜峰分離度>1.5(如圖1所示)。2.2 對照品溶液配制 精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液100 μL于50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，精密吸取不同體積溶液，注入液相色譜儀，測定峰面積。

2.3 樣品溶液制備 取丹參粉10 g，精密稱定，按《中國藥典》2015年版四部通則2351黃曲霉毒素測定法中供試品溶液制備的方法進行處理[6]。精密吸取各供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系及檢測限 分別精密吸取上述混合對照品溶液5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2進樣量分別在9.3～46.5 pg、3.0～15.0 pg、9.3～46.5 pg、3.5～17.5 pg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在空白基質(zhì)中依次加入較低濃度的混合對照品溶液后進行測定，以每種化合物的3倍信噪比(S/N=3)確定方法的檢出限。結(jié)果見表1。

表1 4種黃曲霉毒素線性關(guān)系及檢測限

2.4.2 加樣回收率試驗及精密度 精密稱取已知含量(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2均未檢出)的丹參粉6份，每份約5 g，精密加入混合對照品溶液0.375 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，AFB1 、AFB2、AFG1、AFG2的平均回收率分別為95.1%、90.2%、95.4%、93.3%，RSD分別為1.7%、2.2%、1.6%、1.3%，表明方法精密度滿足分析要求。結(jié)果見表2。

A.對照圖譜；B.樣品圖譜圖1 黃曲霉毒素HPLC圖

表2 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

續(xù)表2

2.5 樣品測定 取50批丹參粉，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，50 批樣品中有9批次檢出AFB1，檢出率為18.0%，但都低于藥典部分藥材限量標(biāo)準(zhǔn)，在這9批當(dāng)中有兩批檢出AFG1，有1批檢出AFG2，所有樣品均未檢出AFB2，結(jié)果見表3。

表3 樣品中4種黃曲霉毒素含量測定結(jié)果 (n=3)

續(xù)表3

3 討論

《中國藥典》2015年版四部通則2351黃曲霉毒素測定法中的色譜條件，只規(guī)定了色譜柱的類型，沒有規(guī)定色譜柱的品牌、型號，該試驗考察了Diamonsil C18柱、中普紅C18柱、Agilent ZORBAX SB-C18柱和Inertsustain C18柱對黃曲霉毒素分離效果的影響，最終選取Inertsustain C18柱(4.6 mm× 150 mm，5 μm)，在此色譜柱條件下，黃曲霉毒素峰形良好，分離度大于1.5。該試驗采用的方法操作步驟簡便、快速靈敏、重現(xiàn)性好，適用于大批量丹參粉中黃曲霉毒素的快速檢測。

丹參粉不僅可以治療疾病，還有養(yǎng)生保健的功效，很多心腦血管病患者每年都會直接泡服大量丹參粉。雖然該試驗檢測出AFB1的9批樣品均符合藥典限量標(biāo)準(zhǔn)，但AFB1性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫，不易分解，容易在人體內(nèi)積蓄，長期服用含有AFB1的丹參粉，很有可能引起身體不適，甚至?xí)谢及┌Y的風(fēng)險，而《中國藥典》2015年版一部中丹參的檢驗項目未包含黃曲霉毒素，為提高丹參粉的質(zhì)量，保證人民用藥安全，應(yīng)加強對丹參粉中黃曲霉毒素的監(jiān)控。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥廠生產(chǎn)的丹參粉黃曲霉毒素含量較低，可能與其經(jīng)過專業(yè)設(shè)備加工消毒后密封包裝有關(guān)[7-8]，但這類產(chǎn)品價格昂貴，大部分居民都是購買丹參后，自己打粉，沒有消毒滅菌，儲存過程中經(jīng)常暴露在空氣中，在相對濕度較高時，很容易滋生微生物，甚至產(chǎn)生毒素，嚴(yán)重威脅老百姓的身體健康。針對這一情況，應(yīng)做更進一步的研究，以期為人民群眾的用藥安全保駕護航。