楊春艷 德央 張燕飛 歐霞

（西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000）

九味牛黃丸成方于公元8 世紀(jì)，始載于藏醫(yī)巨著《四部醫(yī)典》中，稱為牛黃九味方，處方由紅花、巴夏嘎、木香馬兜鈴、體外培育牛黃、渣馴膏、波棱瓜子、獐牙菜、綠絨蒿、木香等藥材組成。目前市場上均為丸劑，將以上九味，除渣馴膏、牛黃外，其余藥粉碎成細(xì)粉，過篩，加入牛黃細(xì)粉，混勻，用渣馴膏加適量水泛丸，干燥而得。該藥深受廣大患者的歡迎，是治療肝膽系統(tǒng)疾病常用藏藥[1-4]。

九味牛黃丸主治由外傷引起的肝病，肝血旺盛，肝熱，培根木布病[5]，是肝病的基礎(chǔ)治療藥，在治療各種急、慢性肝炎時(shí)，臨床常配伍二十五味松石丸、七味紅花殊勝丸等產(chǎn)品協(xié)同用藥。亦可用于急、慢性膽囊炎，特別是膽汁排泄不暢而引起的膽囊炎癥，臨床常配伍十一味金色丸等共同使用。此外，對酒精肝和脂肪肝亦有明顯的治療和預(yù)防作用，常搭配七味鐵屑丸、仁青芒覺等使用。

九味牛黃丸的服用方法為一次4～5 丸，一日三次，研碎后服用。該方法服用困難，患者依從性差，且由于丸劑劑型限制，臨床起效慢。在系統(tǒng)分析文獻(xiàn)及前期化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)將其劑型改為膠囊劑，并對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初步探索。由于處方中含木香，為主藥，根據(jù)文獻(xiàn)資料顯示木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量常作為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)之一[6]，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC-DAD）測定兩批九味牛黃膠囊中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量為九味牛黃膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。此外，因處方中含有木香馬兜鈴，相關(guān)文獻(xiàn)中也有馬兜鈴酸限量的檢測[6]，因此本實(shí)驗(yàn)通過測定馬兜鈴酸A 的含量以判斷九味牛黃膠囊中馬兜鈴酸A是否在安全范圍之內(nèi)。

1 儀器與試藥

實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)Millipore（德國Merck 公司）、萬分之一天平（Sartorius，德國Sartorius 公司）、安捷倫高效液相色譜儀Agilent 1260 Infinity（美國安捷倫公司）、Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm) 色譜柱；電爐等。兩批九味牛黃膠囊，標(biāo)準(zhǔn)品木香烴內(nèi)酯（純度99.56% HPLC，批號MUST-18101308），標(biāo)準(zhǔn)品去氫木香內(nèi)酯（純度99.20% HPLC，批號MUST-18101301），標(biāo)準(zhǔn)品馬兜鈴酸A（純度98.81%HPLC，批號MUST-19031511）由成都曼斯特生物科技有限公司和中國科學(xué)院成都生物研究所研制。液相用甲醇為色譜純（Merck 公司），乙腈為色譜純（Honeywell），水為超純水，其余所用試劑均為國產(chǎn)分析純（廣東光華化學(xué)廠有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯條件。色譜柱：Kromasil C18 (4.6mm×250mm,5μm)；流動(dòng)相為甲醇（A）-水（B），采用梯度洗脫的方法，洗脫梯度程序?yàn)椋?min～10min 10%～73%B，10min～20min 73%～78%B，20min～25min 78%～85%B，25min～30min 85%～100%B，流速為0.6mL/min；檢測波長：225nm；柱溫箱25℃；進(jìn)樣量15μL。理論塔板數(shù)按照木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯計(jì)算應(yīng)不低于9000[7-9]。

2.1.2 馬兜鈴酸A 條件。色譜柱：Kromasil C18 (4.6 mm×250mm,5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水（55：45），等度洗脫，流速為0.6mL/min；檢測波長：225nm；柱溫箱25℃；進(jìn)樣量15μL。理論塔板數(shù)按照馬兜鈴酸A計(jì)算應(yīng)不低于5000[7-9]。

2.2 對照品溶液的制備

采用分析天平精密稱定馬兜鈴酸A 標(biāo)準(zhǔn)品5.30mg，置于10mL 容量瓶中，加入甲醇溶解至刻度線，搖勻，制得對照品儲(chǔ)備液。

采用分析天平精密稱定木香烴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品5.52mg，去氫木香內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品5.64mg，置于10mL 容量瓶中，加入甲醇溶解至刻度線，搖勻，制得對照品儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液的制備

九味牛黃膠囊超聲提取供試品制備：打開膠囊殼，倒出粉末，用分析天平精密稱定藥材粉末，兩批藥材分別為0.1655g、0.1558g，放入錐形瓶，分別加入100倍量的甲醇，浸泡0.5h 后，超聲提取40min，過濾，取1mL 濾液再過0.22μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依照已確立的方法進(jìn)樣，得馬兜鈴酸A 色譜圖（圖1、圖2）、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯色譜圖（圖3、圖4）。計(jì)算峰面積，代入線性回歸方程（以峰面積（y，mAU）對進(jìn)樣量（x，μg）進(jìn)行線性回歸。回歸方程分別為：馬兜鈴酸Ay=632.3x+53.386（n=8），R2=0.9997，線性范圍0.065μg～8.333μg；木香烴內(nèi)酯y=1295.9x+72.756（n=7），R2=0.9998，線性范圍0.117μg～7.5μg；去氫木香內(nèi)酯y=1787.9x+115.4（n=7），R2=0.9997，線性范圍0.117μg～7.5μg），計(jì)算馬兜鈴酸A、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。

表1 兩批九味牛黃膠囊馬兜鈴酸A含量測定結(jié)果（n=3）

表2 兩批九味牛黃膠囊中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量測定結(jié)果（n=3）

圖1 馬兜鈴酸A（RT=18.800）色譜圖（225nm）

圖2 九味牛黃膠囊HPLC圖譜-馬兜鈴酸A（225nm）

圖3 木香烴內(nèi)酯（RT=27.829）、去氫木香內(nèi)酯（RT=29.336）色譜圖（225nm）

圖4 九味牛黃膠囊HPLC圖譜-木香烴內(nèi)酯＆去氫木香內(nèi)酯（225nm）

3 小結(jié)與討論

在系統(tǒng)分析文獻(xiàn)及前期化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC-DAD）對實(shí)驗(yàn)中制備的第1 批和第2 批九味牛黃膠囊進(jìn)行檢查，測定其中馬兜鈴酸A 和木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量。測定結(jié)果顯示在兩批樣品中，馬兜鈴酸A 和木香烴內(nèi)酯含量低于儀器的檢測限，去氫木香內(nèi)酯含量在1 批和2批九味牛黃膠囊中分別為0.660%和0.659%.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明九味牛黃膠囊中馬兜鈴酸A 含量低于檢測限，安全性良好，無腎毒性。木香烴內(nèi)酯含量低于檢測限，原因可能是不同產(chǎn)地木香中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量存在差異，或者粉末狀態(tài)下木香烴內(nèi)酯與其他藥材中某些物質(zhì)發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，具體原因有待下一步實(shí)驗(yàn)分析確定。去氫木香內(nèi)酯含量在1 批和2 批九味牛黃膠囊中分別為0.660%和0.659%，可為九味牛黃膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

從我國肝臟疾病的發(fā)病情況來看，隨著國內(nèi)各種預(yù)防措施的不斷加強(qiáng)，病毒性肝炎的發(fā)病率將會(huì)有所下降，但由于現(xiàn)代社會(huì)人們生活的規(guī)律、暴飲暴食及酗酒等影響，非酒精性脂肪肝、酒精肝的發(fā)病率正逐年攀升［10-12］，而非酒精性脂肪肝、酒精肝的治療藥物主要以保肝護(hù)肝藥物為主［13］。但九味牛黃丸作為保肝護(hù)肝藥，由于丸劑劑型限制，且需搗碎后服用，患者依從性差，臨床起效慢，不利于其推廣。通過將其制成膠囊劑，不僅服用方面，提高患者的依從性，而且起效快，因此九味牛黃方劑型改造具有良好的發(fā)展前景。