肖灑 鄧曉東 賀常皓 李亞軍 費小雯*

（1.海南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571199；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101）

RNAi（RNA interference）技術(shù)是一項基因沉默技術(shù)，由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，從而阻斷特定目的基因的表達(dá)，最終影響蛋白質(zhì)合成。作為一種高效的基因抑制技術(shù)，目前在農(nóng)業(yè)抗害蟲、作物改良、醫(yī)學(xué)疾病治療、未知基因功能探究等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

1 RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

Guo等在1995年從事RNAi的研究，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）胚胎生長發(fā)育時期，成功地將外源的Part 1基因雙鏈RNA導(dǎo)入體內(nèi)，可導(dǎo)致線蟲該基因表達(dá)明顯下調(diào)［1］，同樣Fire等在1998年，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)肌肉注射外源dsRNA于線蟲體內(nèi)，該目的基因的表達(dá)明顯被抑制［2］。

2 RNA干擾機制

真核生物在RNAi基因沉默過程中包含3種重要的非編碼小RNA,即mi RNA（microRNA）、siRNA（small interference RNA）和piRNA（Piwi-interacting RNA）。由siRNA介導(dǎo)的基因沉默過程包含以下部分：（1）首先將人工合成的或與體內(nèi)相同的dsRNA，與靶基因相同序列的有義RNA和反義RNA結(jié)合，然后經(jīng)RNaseIII家族特異性Dicer酶識別，切割成21～23nt siRNA，當(dāng)R2D2蛋白和Dicer酶形成異源二聚體，緊接著與siRNA結(jié)合形成RISC裝載復(fù)合物，然后AGO蛋白與Dicer交換，結(jié)合到siRNA的一端，再與R2D2替換，將整個siRNA轉(zhuǎn)載到AGO蛋白中，形成有活性的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex），由于AGO蛋白含有PAZ、MID、PIWI三個重要功能結(jié)構(gòu)域，siRNA引導(dǎo)鏈的5’端與MID結(jié)合，與3’端露出的兩個核苷酸與其PAZ結(jié)合，通常siR?NA的第28個核苷酸與靶mRNA特異性配對，長約10個核苷酸的mRNA一般切割在第9、10個核苷酸上，由PIWI催化將靶mRNA切斷，使其離開RISC，再通過胞外切酶進一步降解mRNA。（2）siRNA對基因沉默，包括轉(zhuǎn)錄水平mRNA轉(zhuǎn)錄尚未啟動，siRNA分子通過誘導(dǎo)DNAGC島中C和組蛋白H3的第9個lys甲基化、異染色體質(zhì)的形成、DNA分子消融和重組，轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默主要分為啟動、剪接、循環(huán)放大3個階段［3］。

3 dsRNA導(dǎo)入方式

目前對于RNAi干擾技術(shù)應(yīng)用，最主要突破點是選擇一種合適的RNAi導(dǎo)入途徑。現(xiàn)有的RNAi導(dǎo)入主要有三種方法。

3.1 顯微注射法

首先在體外合成dsRNA，通過顯微注射儀器成功注射至昆蟲體內(nèi)［4］，此方法直接作用于靶組織，避免了表皮、中腸等器官對dsRNA的干擾破壞。20世紀(jì)90年代至21世紀(jì)，Kennerdell［5］和Carthew［6］先后通過顯微注射法，將體外合成的目標(biāo)基因的dsRNA導(dǎo)入黑腹果蠅胚胎內(nèi)，從而得到這兩個基因的缺陷型果蠅。隨后Brown等越來越多的科研人員使用顯微注射法對鞘翅目、鱗翅目等類昆蟲實現(xiàn)RNAi的研究［7-9］。此方法對實驗儀器操作精確度要求高，且僅適用于實驗室基因功能方面的基礎(chǔ)研究。

3.2 浸泡法

首先將體外合成的目的dsRNA放在組織培養(yǎng)基內(nèi)，隨著細(xì)胞培育傳代便可吸收培養(yǎng)基中的dsRNA，從而誘導(dǎo)由siRNA介導(dǎo)的基因沉默，經(jīng)檢測和顯微注射法實現(xiàn)同樣效果，但是需要更高的dsRNA濃度［10］。2000年Caplen［11］等就曾成功實現(xiàn)了利用浸泡法，將組織培養(yǎng)的dsRNA對黑腹果蠅進行目的基因的缺失表達(dá)的實驗，亦有對白紋伊蚊（Aedes albopictus）和埃及伊蚊（A.aegypti）干擾目的基因功能的研究的報道［12,13］，該方法的不足之處是轉(zhuǎn)染dsRNA的方式對于操作過程和條件要求較高，首先轉(zhuǎn)染的細(xì)胞要處于狀態(tài)較好的特定發(fā)育時期，其次培養(yǎng)基的濃度和外部條件適宜等［14］。

3.3 飼喂法

依據(jù)昆蟲具有取食的特點，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目的片段轉(zhuǎn)入幼蟲取食的植株或菌株作為介質(zhì),通過喂飼以后經(jīng)腸粘膜細(xì)胞吸收dsRNA進入體內(nèi)循環(huán)，產(chǎn)生siRNA干擾機制，使致死靶基因特異性沉默，致使幼蟲發(fā)育成熟障礙，從而有望起到防控害蟲目的［15］。此方法遵循生物發(fā)育生長進食規(guī)律，對蟲體傷害性小，不需要精密的設(shè)備，操作相對簡單，易于走出實驗室在自然環(huán)境下實現(xiàn)。近年來根據(jù)有害昆蟲吃食喜好，飼喂轉(zhuǎn)基因植株、改良轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物用于防控害蟲的研究成為了探索的熱點。

4 RNAi技術(shù)防控害蟲的應(yīng)用

根據(jù)RNA干擾機制，以害蟲生長發(fā)育所需靶基因作為干擾目標(biāo)，將目標(biāo)基因dsRNA導(dǎo)入蟲體，影響其轉(zhuǎn)錄和翻譯蛋白合成過程，最終導(dǎo)致害蟲不能正常發(fā)育直至死亡［16］。

Tian等［17］研究害蟲甜菜夜蛾幼蟲幾丁質(zhì)合成酶基因A（SeCHSA）為靶基因，以大腸桿菌表達(dá)SeCH?SA dsRNA，喂食在4齡、5齡幼蟲、前蛹和蛹期dsRNA飼料，甜菜夜蛾平均存活率分別為88.64%、74.24%、68.43%和62.63%。玉米飛虱農(nóng)藝作物的主要害蟲，空泡ATPase（V-ATPase）是一種重要的酶，在水解ATP和質(zhì)子的運輸，維持膜離子平衡發(fā)揮重要作用，Jianxiu等［18］在本研究中以VATPase亞基的基因（V-ATPase B和V-ATPase D）作為RNAi的靶基因，實驗采用口服和微量注射，與對照組昆蟲相比，其死亡率更高，繁殖力更低，顯微鏡檢查這些昆蟲雌性生殖器官發(fā)育不正常。Zhou等［19］以害蟲黃胸白蟻為研究對象，一個編碼內(nèi)源性消化纖維素酶Cell-1為靶基因，另一個編碼調(diào)節(jié)六聚體儲存蛋白hex-2基因為靶目標(biāo)，采用dsRNA喂食的方法，內(nèi)葡聚糖酶基因沉默，對白蟻攝取營養(yǎng)能力明顯受損，降低了下游纖維素解聚酶活性，而六聚體儲存蛋白的沉默是通過聯(lián)合保幼激素的作用，進而抑制工蟻與兵蟻之間的表型分化。美洲錐蟲病（American try?panosomiasis）又名Chagas病重要的傳播媒介是嗜血錐蝽，無論是幼蟲、成蟲均喜好叮咬面部和較薄的皮膚區(qū)域，Araujo等［20］研究對唾液腺亞硝磷酸核糖核酸Nitrophorin 2（NP2）基因干擾，幼蟲蛻皮后7天提取的唾液腺用于活性試驗NPs表達(dá)減少、檸檬酸血漿再鈣化時間縮短、磷酸酶活性降低。Mao等［21］在研究飼喂棉鈴蟲幼蟲植物材料中表達(dá)細(xì)胞色素P450基因（CYP6AE14）特異的dsRNA，發(fā)現(xiàn)中腸P450單加氧酶被抑制，生長發(fā)育受到阻礙，對棉酚的耐受性明顯下降。另外還有報道玉米根蟲［22］甲殼動物［23］山楂葉螨［24］稻縱卷葉螟［25］等昆蟲的靶基因干擾和沉默效率研究。

5 RNAi技術(shù)與生物防控方法的重要結(jié)合

蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的Bt毒蛋白對多種昆蟲具有殺滅活性，被廣泛用于生產(chǎn)的生物殺蟲劑，以及轉(zhuǎn)基因Bt作物用于特異性生物殺蟲劑［26］。最新的研究表明，Bt毒素使害蟲產(chǎn)生了不同程度的抗性，嚴(yán)重影響了滅蟲效能，將RNAi技術(shù)沉默昆蟲體內(nèi)特異性基因，有利于提高昆蟲對Bt毒素的敏感性，提升Bt毒素的殺蟲效果。蘇云金芽孢桿菌Cry3Aa毒素對馬鈴薯甲蟲有毒殺作用，而研究結(jié)果也證明pro?hibitin-1蛋白與其產(chǎn)生抗性有關(guān)，Camila等［27］在研究中發(fā)現(xiàn)，通過喂食dsRNA，沉默了幼蟲體內(nèi)編碼prohibitin-1蛋白的基因，并在含有Cry3Aa的環(huán)境下培養(yǎng)5天，幼蟲的死亡率達(dá)到100%。利用RNAi和Bt毒素在昆蟲體內(nèi)的協(xié)同作用，可將兩者結(jié)合應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物，為植物抗蟲性的研究開辟新道路。

6 RNAi技術(shù)規(guī)避化學(xué)殺蟲劑耐藥性

目前化學(xué)殺蟲劑在農(nóng)業(yè)防控害蟲應(yīng)用過程中起到重要作用，但是近年來抗藥性逐漸顯現(xiàn)出來，劉凱亮等［28］于2017年開展深圳市南山區(qū)、寶安區(qū)、大鵬新區(qū)、福田區(qū)的白紋伊蚊對常用菊酯類殺蟲劑的抗藥性研究，得出白紋伊蚊抗性系數(shù)都有不同程度的提高。張雨等［29］于2017年針對上海市奉賢區(qū)家蠅對敵敵畏、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯的抗性現(xiàn)狀調(diào)查研究，該地區(qū)家蠅自然種群對以上三種藥物抗性級別均為高抗。賈尊尊等［30］對新疆地區(qū)煙粉虱開展檢測，結(jié)果表明煙粉虱對有機磷、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯等許多常規(guī)殺蟲劑產(chǎn)生了高水平抗性。另外長期大規(guī)模使用化學(xué)殺蟲劑勢必造成環(huán)境破壞，RNAi技術(shù)的探索和發(fā)展開辟了一項新的防控害蟲措施。

7 展望

盡管科研人員在RNAi技術(shù)的研究和利用方面做出了巨大的貢獻(xiàn)和發(fā)展，但是不可規(guī)避的是依然存在諸多局限性。例如靶外結(jié)合效應(yīng)，由于siRNA分子和非目標(biāo)mRNA序列相似發(fā)生沉默，產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，導(dǎo)致干擾效應(yīng)喪失甚至基因突變。另外還有轉(zhuǎn)基因作物在自然界當(dāng)中，是否給其他非靶標(biāo)物種帶來危害和潛在生態(tài)風(fēng)險等。雖然還有許多暫時未知利弊，但是作為一項新型防害舉措，相信隨著分子生物學(xué)不斷發(fā)展和科研學(xué)者們探索和努力，必定會不斷突破，將RNAi技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。