蓮蕷消癭湯對橋本甲狀腺炎患者外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞的影響*

劉曼曼，胡春平，馮珍鳳，高俊鳳，嚴(yán) 軍

（1.上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海 201899；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

橋本甲狀腺炎（hashimoto's thyroiditis，HT），又稱慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，是一種自身免疫性疾病，以甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPO-Ab）、甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TgAb）陽性為主要臨床特征，且伴甲狀腺不同程度的腫大，質(zhì)地較硬[1]。本病起病隱匿，大部分患者經(jīng)歷數(shù)年后可由于甲狀腺濾泡細(xì)胞的破壞，發(fā)展為甲狀腺功能減退，對全身產(chǎn)生影響[2]。甚至有研究顯示本病由于干擾免疫監(jiān)視，可誘發(fā)免疫逃逸，與惡性甲狀腺腫瘤有一定的聯(lián)系[3-4]。西醫(yī)目前尚無針對本病病因的治療方法，一旦出現(xiàn)甲狀腺功能減退和亞臨床甲狀腺功能減退則須終身服用甲狀腺素，有文獻(xiàn)報道[5]補(bǔ)硒治療可以降低患者血清TPO-Ab和TgAb陽性率，但尚缺乏大規(guī)模循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。目前的研究已證實，HT的發(fā)生發(fā)展過程中有多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子共同參與，而自身反應(yīng)性T細(xì)胞的激活在HT的病程進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[6]。研究[7]表明，CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在HT患者中顯著升高，CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)IFN-γ、IL-17分泌干預(yù)HT的疾病進(jìn)展。蓮蕷消癭湯是上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科治療橋本甲狀腺炎的經(jīng)驗方，前期研究證實此方可有效改善HT患者臨床癥狀，降低HT患者TPO-Ab、TgAb滴度，但相關(guān)機(jī)制尚未明確。為此，筆者團(tuán)隊選用本院132例甲狀腺功能正常的HT患者，檢測外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞水平，探討蓮蕷消癭湯治療HT相關(guān)作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合橋本甲狀腺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：（1）凡是彌漫性甲狀腺腫大，質(zhì)地較韌，特別是伴峽部錐體葉腫大，不論甲狀腺功能是否改變，均應(yīng)懷疑HT；（2）血清TPO-Ab和TgAb檢測呈陽性；（3）甲狀腺細(xì)針穿刺和細(xì)胞學(xué)檢查（FNAC）顯示橋本甲狀腺炎。甲狀腺功能指標(biāo)正常范圍內(nèi)，符合（1）和（2）或單獨具備（3）都可確認(rèn)診斷成立。

1.1.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[9]中癭病診斷標(biāo)準(zhǔn)制定肝郁脾虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)。（1）主癥：頸前不適或腫大，觸痛，煩躁易怒，疲勞乏力；（2）次癥：口干，口渴，健忘，納呆腹脹，便秘或排便無力或便溏不爽，月經(jīng)紊亂；（3）舌脈：舌淡紅苔薄白，舌體胖大或邊有齒痕，脈弦或細(xì)弱。舌象、脈象結(jié)合主癥加2項或以上次癥即可確立辨證。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合上述西醫(yī)、中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡18～50歲，性別不限；（3）近1個月未接受過中藥制劑等治療。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）年齡＜18歲或≥50歲；（2）妊娠或哺乳期婦女；（3）對本藥過敏者；（4）合并甲狀腺功能亢進(jìn)或甲狀腺功能減退者；（5）甲狀腺腫大明顯壓迫鄰近器官或伴有突眼者；（6）有嚴(yán)重的心、肝、腦、腎和造血系統(tǒng)及代謝性疾病，或伴有其他免疫性疾病，或合并精神疾病及抑郁癥的患者；（7）依從性差、中途退出及資料不全者。

1.4 研究對象 本研究通過上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理審查（嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院2017年倫理審查004號）。選取2017年1月至2019年7月在上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌門診就診符合西醫(yī)及中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)甲狀腺功能正常的肝郁脾虛證橋本甲狀腺炎患者132例。將納入病例隨機(jī)分為中藥組、西藥組及中藥聯(lián)合西藥組（聯(lián)合組），每組44例。

1.5 治療方法

1.5.1 對照組 予硒酵母片[5]（商品名：西維爾；牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司，50 μg/片）治療，餐后半小時口服，早晚各口服1次，2片/次。療程12周。

1.5.2 中藥組 予蓮蕷消癭湯，由本院藥劑科統(tǒng)一煎制，150 mL/包，方藥組成：柴胡6 g，香附10 g，郁金15 g，白芍15 g，麩炒白術(shù)12 g，白茯苓15 g，法半夏10 g，浙貝母10 g，穿山龍30 g，白花蛇舌草30 g，重樓10 g，半枝蓮15 g，生甘草6 g。餐后半小時口服，150 mL/次，早晚各1次。療程12周。

1.5.3 聯(lián)合組 予蓮蕷消癭湯和硒酵母片口服，劑量和方法同“對照組”及“中藥組”。療程12周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般項目 姓名、性別、年齡、病程、伴隨疾病及一般體格檢查（體溫、血壓、心率、呼吸、脈搏）等。

1.6.2 甲狀腺功能及相關(guān)因子 研究對象禁食8 h后抽取靜脈血10 mL，3 000 r/min離心分離血清，-20℃保存血清備用，采用化學(xué)發(fā)光免疫法（德國羅氏公司，Cobas6000型）測定游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺素（TSH）、TPO-Ab、TgAb；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA試劑盒由中國博士德生物工程有限公司提供）測定血清白細(xì)胞介素-17（IL-17）、干擾素-γ（IFN-γ）表達(dá)量；收集離心后下層血細(xì)胞采用流式細(xì)胞分析儀（美國BD公司，F(xiàn)ACS Calibur型）測定CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中的百分比。標(biāo)本處理時間在采血后4 h以內(nèi)完成。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用（±s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性，治療前后對比采用配對t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態(tài)分布和方差齊性者采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基線資料 由于患者依從性原因造成失訪12例（中藥組4例，西藥組4例，聯(lián)合組4例），失訪率9.10%（12/132），最終完成120例。3組患者基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。（見表1）

表1 3組患者基線資料比較

2.2 甲狀腺功能及TPO-Ab、TgAb檢測結(jié)果

2.2.1 3組患者甲狀腺功能比較3組患者治療前FT3、FT4、TSH比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。治療后3組患者FT3、FT4、TSH與治療前比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后3組患者FT3、FT4、TSH比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 3組患者甲狀腺功能比較（±s）

表2 3組患者甲狀腺功能比較（±s）

FT3（pg/mL） FT4（ng/mL） TSH（μIU/mL）治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P聯(lián)合組40 3.12±0.61 2.99±0.33 0.845 0.405 1.24±0.41 1.09±0.24 1.653 0.109 2.34±1.14 2.49±0.77-0.686 0.498中藥組40 3.01±0.51 2.96±0.37 0.392 0.698 1.08±0.40 1.05±0.31 0.287 0.777 2.60±1.17 2.28±0.73 1.338 0.192西藥組40 2.97±0.62 2.94±0.34 0.309 0.760 1.06±0.48 0.93±0.30 1.123 0.271 2.59±1.16 2.06±0.80 0.182 0.857 F 0.511 0.277 1.405 2.581 0.474 0.949 P 0.602 0.759 0.251 0.082 0.624 0.391組別 例數(shù)

2.2.2 3組患者甲狀腺抗體比較3組患者治療前TPO-Ab、TgAb比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。與治療前比較，3組患者治療后TPO-Ab、TgAb均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。治療后組間比較，聯(lián)合組、中藥組優(yōu)于西藥組（P＜0.01），聯(lián)合組優(yōu)于中藥組（P＜0.05）。（見表3）

表3 3組患者甲狀腺抗體比較（±s）

表3 3組患者甲狀腺抗體比較（±s）

注：與西藥組比較，aP＜0.01；與中藥組比較，bP＜0.05

TPO-Ab（IU/mL） TgAb（IU/mL）治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P聯(lián)合組 40 723.52±199.47 245.89±117.85a b 15.171 0.000 503.64±176.34 177.10±80.89a b 13.052 0.000中藥組40 714.12±205.35 399.45±108.38a 11.200 0.000 509.35±156.52 236.82±87.07a 14.471 0.000西藥組40 726.33±128.28 582.19±166.41 7.900 0.047 512.89±120.57 390.86±99.77 7.462 0.049 F 0.035 45.511 0.015 43.049 P 0.966 0.000 0.985 0.000組別 例數(shù)

2.3 血清IL-17、血清IFN-γ、外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞檢測結(jié)果

2.3.1 3組患者血清IL-17、IFN-γ比較3組患者治療前血清IL-17、IFN-γ比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。與治療前比較，聯(lián)合組、中藥組患者治療后血清IL-17、IFN-γ均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；西藥組患者治療后血清IL-17、IFN-γ與治療前比較有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后組間比較，聯(lián)合組、中藥組患者血清IL-17、IFN-γ均低于西藥組（P＜0.01）；聯(lián)合組患者血清IL-17、IFN-γ均低于中藥組（P＜0.05）。（見表4）

表4 3組患者血清IL-17、IFN-γ比較（±s，pg/mL）

表4 3組患者血清IL-17、IFN-γ比較（±s，pg/mL）

注：與西藥組比較，aP＜0.01；與中藥組比較，bP＜0.05

IL-17 IFN-γ治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P聯(lián)合組40 15.57±9.01 6.62±3.16ab 18.705 0.000 16.23±8.27 3.24±2.13ab 27.181 0.000中藥組40 14.71±8.40 9.98±4.90a 8.992 0.000 17.09±9.24 6.12±3.94a 26.370 0.000西藥組40 15.35±8.21 13.09±5.27 2.793 0.064 16.12±9.44 13.92±5.89 2.942 0.058 F 0.475 17.278 0.524 13.215 P 0.631 0.000 0.648 0.000組別 例數(shù)

2.3.2 3組患者外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在PBMC中百分比比較3組患者治療前外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在PBMC中百分比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。與治療前比較，聯(lián)合組、中藥組患者治療后外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在PBMC中的百分比顯著降低（P＜0.01），西藥組患者治療后外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在PBMC中的百分比與治療前比較有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05)；治療后組間比較，聯(lián)合組、中藥組患者CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在PBMC中的百分比明顯低于西藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；聯(lián)合組低于中藥組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表5）

表5 3組患者外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在PBMC中百分比比較（±s）

表5 3組患者外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在PBMC中百分比比較（±s）

注：與西藥組比較，aP＜0.01，bP＞0.05

組別 例數(shù) 治療前 治療后 t P聯(lián)合組 40 29.52±6.62藥組40 28.91±5.93藥組40 29.04±6.25 20.98±4.12ab 11.975 0.000中 22.63±5.46a 8.790 0.000西 26.87±3.07 2.236 0.069 F 1.217 24.378 P 0.348 0.000

3 討 論

HT已成為臨床上最常見的自身免疫性疾病，患病率近8/1 000，男、女患病比例為1∶8，以中青年女性居多[10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，隨著病情發(fā)展，大部分患者最終會變成甲狀腺功能減退，同時由于自身免疫缺陷的影響，會出現(xiàn)甲狀腺結(jié)節(jié)、突眼、怕冷、疲乏、便秘等癥狀。此外，HT嚴(yán)重影響女性生殖健康，易導(dǎo)致甲狀腺乳頭狀癌[3]及其他自身免疫性疾病的發(fā)生，嚴(yán)重危害生命健康，降低生活質(zhì)量，故甲狀腺功能正常HT的發(fā)病機(jī)制及如何阻止該疾病進(jìn)一步發(fā)展已成為目前的研究熱點。

HT發(fā)病是由于機(jī)體免疫耐受打破及過度甲狀腺免疫反應(yīng)造成。甲狀腺自身免疫破壞過程中多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子共同參與了HT的發(fā)生發(fā)展，其中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的激活是HT發(fā)病的關(guān)鍵[6]。記憶性T細(xì)胞由初始T細(xì)胞于外周淋巴器官內(nèi)接受抗原提呈細(xì)胞所提呈的抗原后活化直接分化而成，或由效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，記憶性T細(xì)胞與自身反應(yīng)性T細(xì)胞可以相互轉(zhuǎn)化。CD45RO分子是記憶性T細(xì)胞的表面標(biāo)志，在外周血中，自身反應(yīng)性T細(xì)胞在接觸抗原被活化后，細(xì)胞膜表面CD45RO分子表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)[12]，最新的研究發(fā)現(xiàn)其參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡等諸多自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。IFN-γ是由CD4+T細(xì)胞的輔助性T1細(xì)胞亞群產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，參與炎癥和甲狀腺疾病的發(fā)展，與甲狀腺功能減退等免疫系統(tǒng)疾病相關(guān)[14]。IL-17是CD4+T細(xì)胞的獨特譜系，主要由Th17分泌，LI D P等[15]發(fā)現(xiàn)HT的初診患者中，其局部甲狀腺組織的IL-17蛋白表達(dá)及血清IL-17的水平均明顯高于正常人，進(jìn)一步證實了IL-17與HT的病程密切相關(guān)。馬倩倩[7]研究發(fā)現(xiàn)，HT患者CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞及IFN-γ、IL-17水平顯著高于正常人群，且HT患者外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞水平與IL-17、IFN-γ、TPO-Ab、TgAb的表達(dá)量呈正相關(guān)，CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞占PBMC的比例越高，IFN-γ、IL-17水平則越高，進(jìn)一步提示CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞通過調(diào)節(jié)IFN-γ、IL-17等參與HT的發(fā)展。

近年來，中醫(yī)藥在治療橋本甲狀腺炎方面顯示出獨特的優(yōu)越性[16-18]，中醫(yī)學(xué)關(guān)于甲狀腺疾病的記載主要歸于“癭病”范疇。《諸病源候論》曰：“諸山水黑土中，出泉流者，不可久居，常食令人作癭，動氣增患”；“癭者，由憂患?xì)饨Y(jié)所生”。指出癭病的病因主要是情志內(nèi)傷、飲食水土失宜及體質(zhì)因素?？v觀文獻(xiàn)，本病初期以氣滯、痰凝為主，日久則肝脾失調(diào)，痰瘀互結(jié)，最終氣、痰、血相互搏結(jié)于頸前。而女子以肝為先天，以血為用，婦女的經(jīng)、孕、產(chǎn)、乳與肝經(jīng)氣血密切相關(guān)，故遇情志因素，常氣郁痰結(jié)，氣滯血瘀，這亦是女性更易患此病的原因，故肝郁氣滯為本病發(fā)病關(guān)鍵，正如王德雙等[19]對60例新診斷HT患者觀察發(fā)現(xiàn)肝郁者占81.67%。王小龍等[20]對HT在內(nèi)的甲狀腺疾病體質(zhì)學(xué)調(diào)查表明氣郁質(zhì)是主要的體質(zhì)類型或主要的兼夾體質(zhì)類型。而肝郁日久，木旺乘土，肝郁一分，脾虛一分，如影隨形，日久交結(jié)，津液運行受阻，津凝痰聚，痰氣搏結(jié)頸前，日久血脈瘀阻，終致氣、痰、瘀合而為患。另從經(jīng)脈循行部位而言，足厥陰肝經(jīng)“循喉嚨之后，上入頏顙”，足太陰脾經(jīng)“上膈，挾咽，連舌本，散舌下”，肝經(jīng)、脾經(jīng)均經(jīng)過甲狀腺所處喉咽附近，與甲狀腺密切相關(guān)。蓮蕷消癭湯為我院嚴(yán)軍根據(jù)HT病機(jī)結(jié)合臨床經(jīng)驗總結(jié)出的治療肝郁脾虛證甲狀腺功能正常橋本甲狀腺炎的驗方。方中柴胡、香附、郁金同用，疏肝解郁行氣之效顯著；白芍柔肝養(yǎng)肝，理氣而不傷陰；麩炒白術(shù)、白茯苓健脾化痰，以杜絕生痰之源；法半夏、穿山龍、浙貝母化痰散結(jié)消腫；生甘草調(diào)和諸藥；因“重陰之下，必有伏陽”，加重樓、半枝蓮、白花蛇舌草以“清熱”貫穿始終。全方行氣以助肝用，甘柔以潤肝體，體足則用強(qiáng)，氣無滯澀之弊。健脾助運，游溢水液，水無停滯則痰涎不生?！皻庠龆?，夭之由也”，雖然HT大法以散結(jié)為主，但在整體觀、運動觀的思想指導(dǎo)下，不能不兼顧長期使用香燥之品帶來的傷陰和助熱的弊端，因此運用清熱散結(jié)之品，清中有散?！皻庥杏啾闶腔稹?，邪熱內(nèi)生，更灼傷水液，煉津為痰，痰熱互結(jié)，壅滯更甚，清熱利于散結(jié)，散結(jié)有助清熱。諸藥合用，氣體得暢，津液得布，蘊結(jié)自開。

本研究結(jié)果表明，蓮蕷消癭湯可有效降低HT患者TPO-Ab、TgAb抗體，并可降低血清IL-17、IFN-γ的表達(dá)量及CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在PBMC所占的比例，而西藥組未見明顯優(yōu)勢，提示蓮蕷消癭湯可能通過下調(diào)肝郁脾虛證HT患者體內(nèi)CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞水平，降低血清IL-17、IFN-γ的表達(dá)量，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能進(jìn)而延緩HT的病程進(jìn)展。但由于隨訪時間短，樣本量較小，CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞與HT發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，今后應(yīng)進(jìn)行更大樣本量的研究及延長隨訪時間，對其之間的聯(lián)系進(jìn)行深入研究。