張莉芳 廖煥金 蔡 珺 何一鳴 彭艷霞 李光民 謝 彤 吳 平 劉華鋒 潘慶軍

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心,湛江524001)

記憶性B細(xì)胞體外擴(kuò)增影響因素的研究進(jìn)展①

張莉芳 廖煥金②蔡 珺③何一鳴④彭艷霞③李光民③謝 彤④吳 平 劉華鋒③潘慶軍③

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心,湛江524001)

記憶性B細(xì)胞(Memory B cells)是成熟的初始B細(xì)胞被抗原激活分化為具有記憶功能并持續(xù)存在于宿主的一類細(xì)胞。當(dāng)再次遇到相同抗原時，該細(xì)胞可迅速增殖分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生高親和力的抗原特異性抗體，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，從而保護(hù)機(jī)體免受再次入侵的抗原感染[1,2]。

記憶性B細(xì)胞在機(jī)體體液免疫應(yīng)答和疫苗開發(fā)中具有重要作用。通過對記憶性B細(xì)胞的研究，不僅能加深人們對記憶性B細(xì)胞生理特性和免疫記憶的認(rèn)識，而且能推動疫苗的設(shè)計(jì)開發(fā)，以及為體外生產(chǎn)大量抗體提供理論依據(jù)。然而，由于記憶性B細(xì)胞在外周血中的數(shù)量較少，并且沒有一種精確檢測和分離的方法，導(dǎo)致人們對記憶性B細(xì)胞的生理特性和再次參與免疫應(yīng)答的研究滯后[3]。因此，探索體外檢測、活化和擴(kuò)增記憶性B細(xì)胞的方法至關(guān)重要。本文就記憶性B細(xì)胞在體外檢測、活化及擴(kuò)增的影響因素作簡要綜述。

1 記憶性B細(xì)胞

記憶性B細(xì)胞被定義為：在入侵的抗原被清除后，接觸過抗原并持續(xù)存在于宿主中的一類細(xì)胞，當(dāng)再次遇到相同抗原時，該細(xì)胞能快速應(yīng)答產(chǎn)生高親和力的抗原特異性抗體，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[1,2]。人記憶性B細(xì)胞主要分為兩類[4,5]：①免疫球蛋白轉(zhuǎn)換的記憶性B細(xì)胞 (CD27+IgD-IgG+/IgA+/IgE+)；②非轉(zhuǎn)換IgM+記憶性B細(xì)胞，包括CD27+IgM+IgD-和CD27+IgM+IgD+的細(xì)胞亞群。雖然近期研究發(fā)現(xiàn)一群不表達(dá)CD27的B細(xì)胞也具有記憶性B細(xì)胞的特性[6]，但是，大家仍普遍認(rèn)為腫瘤壞死因子受體家族成員CD27可作為人記憶性B細(xì)胞的表面標(biāo)記物[7]。

抗體的產(chǎn)生和抗體記憶是體液免疫的基本功能。在感染或接種疫苗后，基于B細(xì)胞表達(dá)的B細(xì)胞受體(B cell receptor,BCR)對外來抗原的識別，成熟的初始B細(xì)胞被激活并分化為記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞，從而使機(jī)體具有免疫記憶功能[8,9]。維持機(jī)體免疫記憶的細(xì)胞主要是長壽命漿細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞。長壽命漿細(xì)胞定居于骨髓中，持續(xù)分泌抗體，中和入侵的病原微生物，執(zhí)行免疫保護(hù)功能；記憶性B細(xì)胞則主要循環(huán)于外周血或定居于次級淋巴組織和骨髓中[10,11]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體再次接觸相同抗原時，IgG+B細(xì)胞可快速被活化并增殖分化為產(chǎn)生高滴度、高親和力的IgG抗體分泌型細(xì)胞，以便能更有效清除入侵的病原體[8,12]。此外，在抵抗細(xì)菌和病毒入侵時，記憶性B細(xì)胞除了分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體外，還可通過產(chǎn)生細(xì)胞因子或提呈抗原給T細(xì)胞，從而影響免疫性疾病的進(jìn)展[13]。

2 記憶性B細(xì)胞體外檢測方法的研究進(jìn)展

傳統(tǒng)上，血清抗體滴度的檢測是反映機(jī)體疫苗接種后體液免疫應(yīng)答能力的最常用方法，主要是此方法簡單，成本低。目前，市場上的絕大多數(shù)疫苗的免疫力都可通過抗體滴度來檢測[2,14,15]。然而，長期的體液免疫記憶不僅依靠長壽命漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，同時也依賴于記憶性B細(xì)胞再次暴露在抗原時快速分化為漿細(xì)胞的能力[3]。也可通過檢測記憶性B細(xì)胞的種類和數(shù)量來確定體液免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和范圍[16]。所以，即使血清抗體滴度的檢測結(jié)果為陰性，記憶性B細(xì)胞也可能大量存在，不過只是處于靜息狀態(tài)[15]。單獨(dú)檢測免疫后血清的抗體滴度不足以反映機(jī)體的免疫記憶能力[17]，如果聯(lián)合檢測抗體和記憶性B細(xì)胞的水平就更能體現(xiàn)人B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能力。

目前，記憶性B細(xì)胞的檢測方法主要有兩種：①采取熒光素標(biāo)記的單體或四聚體抗原直接與記憶性B細(xì)胞結(jié)合，再通過多色流式細(xì)胞儀檢測，即可檢測出記憶性B細(xì)胞的數(shù)量和種類[18,19]；②體外用多克隆刺激劑預(yù)刺激記憶性B細(xì)胞，培養(yǎng)一定時間，待其分化為抗體分泌細(xì)胞(Antibody-secreting cells,ASC)后，通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(Enzyme-linked immunospot,ELISPOT)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測ASC分泌抗體的數(shù)量，從而達(dá)到對記憶性B細(xì)胞檢測的目的[20,21]。但是，由于記憶性B細(xì)胞在外周血中的數(shù)量較少，約占人外周血B細(xì)胞的30%～40%[5]，尚且無精確檢測和分離記憶性B細(xì)胞的有效方法。

1983年，ELISPOT實(shí)驗(yàn)第一次用于檢測B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以識別分泌IgG的B細(xì)胞[22]。研究發(fā)現(xiàn)ELISPOT試驗(yàn)是檢測記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞的重要方法。存在于外周血中的漿細(xì)胞不用體外預(yù)活化，通過ELISPOT試驗(yàn)即可檢測出來，但只有在抗原入侵或免疫后的特定時間才可檢測到[23]。記憶性B細(xì)胞則需預(yù)刺激5～6 d[21]，甚至更長時間[5]，待其激活分化為ASC后才能在ELISPOT板上檢測到。刺激時間的長短，主要與刺激劑、細(xì)胞活化潛能和細(xì)胞的純度(如PBMC、B細(xì)胞或提純的記憶性B細(xì)胞)有關(guān)[23]。目前，ELISPOT試驗(yàn)不僅能評估記憶性B細(xì)胞分泌的抗體是否發(fā)生類別的轉(zhuǎn)換，而且能評估記憶性B細(xì)胞在外周循環(huán)的數(shù)量，現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于疫苗接種學(xué)、腫瘤免疫治療學(xué)和移植免疫學(xué)等領(lǐng)域[24]。

3 記憶性B細(xì)胞體外活化方案

如何活化記憶性B細(xì)胞是在體外研究其生理特性時首先要解決的問題。因此，為精確評估記憶性B細(xì)胞的功能特性，探索快速有效的B細(xì)胞活化方案至關(guān)重要。

初始B細(xì)胞活化的經(jīng)典途徑涉及到B細(xì)胞與抗原特異性結(jié)合以及抗原特異性T、B淋巴細(xì)胞相互識別的過程[25]。但鑒于記憶性B細(xì)胞的功能特性與初始B細(xì)胞不同，兩者可能存在不同的活化方式。因此，研究者開始探索非抗原依賴的記憶性B細(xì)胞活化方案。研究發(fā)現(xiàn)，用非抗原依賴的多克隆刺激劑與其他刺激物聯(lián)合使用，能使大部分記憶性B細(xì)胞分化為ASC[26]。此外，Crotty等[21]聯(lián)合使用PWM(Pokeweed mitogen,PWM)+CpG (Cytosine-phosphate-guanine,CpG)+SAC(Staphylococcus aureus Cowan,SAC)于體外培養(yǎng)6 d，可以使抗原特異性記憶性B細(xì)胞(Antigen-specific memory B cell)分化為ASC。2014年，Huang等[27]聯(lián)合使用SAC、CpG和PWM刺激記憶性B細(xì)胞，通過ELISPOT試驗(yàn)檢測，發(fā)現(xiàn)記憶性B細(xì)胞能分化為ASC，并產(chǎn)生大量抗體，表明在體外通過非抗原依賴的多克隆刺激，記憶性B細(xì)胞能分化為ASC。

隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用多克隆刺激劑如CpG、PWM、SAC與CD40L或細(xì)胞因子IL-2 和IL-10等刺激記憶性B細(xì)胞，能更有效地讓其活化。Dugas等[28]用CD40-CD154體外培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，來源于持續(xù)性多克隆B淋巴細(xì)胞增多癥(Persistent polyclonal B cell lymphocytosis,PPBL) 的記憶性B細(xì)胞可大量增殖并分泌IgM和IgG，表明通過CD40可活化記憶性B細(xì)胞，使其增殖。同年，Ghamlouch等[5]聯(lián)合使用CpG、CD40L、IL-2、IL-10 和IL-15與來源于慢性B淋巴細(xì)胞白血病的記憶性B細(xì)胞共培養(yǎng)7 d，發(fā)現(xiàn)記憶性B細(xì)胞能分化為ASC，并分泌大量的IgM。此外，Karahan等[24]聯(lián)合使用α-CD40單克隆抗體、ODN-2006(Oligodeoxy-nuc-leotides(ODN)-2006)、CpG、IL-2、IL-10和IL-21與記憶性B細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)記憶性B細(xì)胞可活化增殖并分化為ASC，認(rèn)為該刺激方案可有效激活記憶性B細(xì)胞。

目前，研究者提出聯(lián)合使用R848(TLR7和TLR8激動劑)和IL-2才是刺激記憶性B細(xì)胞活化的最有效方案。2009年，Pinna等[29]評估記憶性B細(xì)胞的活化方案時，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用R848和IL-2刺激記憶性B細(xì)胞6天后的活化效果，優(yōu)于聯(lián)合使用PWM、CpG和SAC。2013年，Jahnmatz等[23]通過對多種刺激B細(xì)胞活化的方案進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用R848+IL-2預(yù)刺激72 h后，能最有效地使記憶性B細(xì)胞活化增殖并分泌IgG。與其他方案相比，該方案可提高檢測抗原特異性記憶性B細(xì)胞的靈敏度。同年，Walsh等[30]聯(lián)合使用R848+IL-2刺激記憶性B細(xì)胞5 d后，亦可誘導(dǎo)HIV特異性的記憶性B細(xì)胞分化為ASC。如今，聯(lián)合使用R848和IL-2刺激記憶性B細(xì)胞活化的方案已逐漸被眾多實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可。

雖然已有多種方案能使記憶性B細(xì)胞活化并增殖，但記憶性B細(xì)胞是如何接受環(huán)境信號刺激以及其非特異性多克隆激活的規(guī)律仍無確切結(jié)論，有待深入研究。

4 活化擴(kuò)增抗原特異性記憶性B細(xì)胞的方法

隨著檢測方法和記憶性B細(xì)胞活化方案的優(yōu)化，目前已有多種方案能使外周血中的記憶性B細(xì)胞分化為ASC并產(chǎn)生相關(guān)抗體。但是，這種活化方式是一種非特異性多克隆激活，分泌的是多克隆抗體。于是，研究者開始探索如何從眾多活化的記憶性B細(xì)胞中篩選出針對某種抗原的抗原特異性記憶性B細(xì)胞。

目前，最常用的方法是通過疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性記憶性B細(xì)胞，再通過體外多克隆刺激劑使其活化擴(kuò)增，在ELISPOT板上篩選獲得針對這種疫苗的抗原特異性記憶性B細(xì)胞。2004年，Crotty等[21]聯(lián)合應(yīng)用PWM、CpG和SAC刺激從炭疽疫苗接種者中分離出的記憶性B細(xì)胞，在ELISPOT實(shí)驗(yàn)中檢測發(fā)現(xiàn)炭疽特異性記憶性B細(xì)胞能分化為ASC，分泌保護(hù)性抗體，并證明該記憶性B細(xì)胞屬于IgG+亞群。2011年，Morris等[31]從HIV-1疫苗接種者外周血中分離出單個B細(xì)胞，克隆得到能識別HIV-1gp41保守位點(diǎn)及能中和多株HIV-1的抗體，并認(rèn)為在HIV-1gp41包被蛋白的C端存在多免疫原性靶點(diǎn)，可為單個B細(xì)胞抗體制備技術(shù)及疫苗設(shè)計(jì)提供依據(jù)。此外，Buisman等[26]在研究疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性的記憶性B細(xì)胞應(yīng)答時，發(fā)現(xiàn)每毫升血液中約有10個抗原特異性記憶性B細(xì)胞，并由此推算人的機(jī)體約有6×104個抗原特異性記憶性B細(xì)胞。

近年，聯(lián)合應(yīng)用ELISPOT試驗(yàn)方法和多克隆刺激劑，相繼檢測出了HIV特異性記憶性B細(xì)胞、惡性瘧原蟲特異性記憶性B細(xì)胞，Ro/SSA-和La/SSB特異性記憶性B細(xì)胞[31-33]等。隨著檢測方法和活化方案的優(yōu)化，必將會有越來越多的抗原特異性記憶性B細(xì)胞被檢測出來，為疫苗的設(shè)計(jì)及開發(fā)提供理論依據(jù)。

5 體外檢測、活化及擴(kuò)增記憶性B細(xì)胞的意義

免疫記憶是免疫系統(tǒng)中最顯著的特點(diǎn)。無論體液免疫或細(xì)胞免疫，再次應(yīng)答都具有迅速、強(qiáng)烈、特異性高和持久的特點(diǎn)[34]。但記憶性B細(xì)胞是如何接受環(huán)境信號刺激以及其非特異性多克隆激活的機(jī)制尚不明確。因此，通過體外檢測、活化和擴(kuò)增記憶性B細(xì)胞，不但能加深人們對記憶性B細(xì)胞功能特性和免疫記憶功能的認(rèn)識，使深入研究人體免疫記憶功能和機(jī)理成為可能，為體外制備全人源性抗體提供相關(guān)理論依據(jù)。

在疫苗領(lǐng)域，體外檢測、活化及擴(kuò)增記憶性B細(xì)胞對疫苗的設(shè)計(jì)開發(fā)具有重要意義[15]。檢測記憶性B細(xì)胞的應(yīng)答可評估疫苗的效能，并可篩選出對感染性疾病或癌癥免疫治療的疫苗無反應(yīng)的風(fēng)險群體[20，32]。同時，從免疫或感染個體中分離出的抗體有助于我們分析該疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體類型、生理功能并指導(dǎo)相關(guān)疫苗的設(shè)計(jì)和開發(fā)[15]。因此，檢測外周記憶性B細(xì)胞的應(yīng)答能力可為我們評估疫苗的療效及疫苗對人體的保護(hù)時間提供相關(guān)理論依據(jù)[35]。

體外擴(kuò)增記憶性B細(xì)胞制備抗體技術(shù)是一種潛在制備全人源性抗體的方法。目前，實(shí)驗(yàn)技術(shù)尚不能通過體外細(xì)胞培養(yǎng)獲得大量的人多克隆抗體，而臨床上運(yùn)用的治療性免疫球蛋白多克隆制劑或靜脈注射的免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulins，IVIg)是志愿者的血漿中分離出來的，其主要成分為IgG，因其來源途徑的限制，導(dǎo)致IVIg相當(dāng)緊缺[36]。因此，通過體外檢測、活化和擴(kuò)增記憶性B細(xì)胞有望在體外產(chǎn)生大量的全人源性多克隆抗體，以增加IVIg的來源。研究發(fā)現(xiàn)，利用多克隆刺激劑可誘導(dǎo)人記憶性B細(xì)胞向漿細(xì)胞轉(zhuǎn)換，分泌大量的多克隆抗體，并證明了該抗體與正常人血清的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4功能結(jié)構(gòu)相似[37]。此外，擴(kuò)增的記憶性B細(xì)胞也可結(jié)合單個B細(xì)胞抗體技術(shù)，生產(chǎn)混合的人單克隆抗體。研究表明單個B細(xì)胞抗體技術(shù)制備的單克隆抗體，具有全人源性、自身高度特異性和均一性的特點(diǎn)，在治療病原微生物感染、腫瘤、自身免疫性疾病及器官移植等方面有獨(dú)特的優(yōu)勢和良好的應(yīng)用前景[34]。

綜上，通過體外活化和擴(kuò)增記憶性B細(xì)胞，不僅有助于對記憶性B細(xì)胞功能特性及免疫記憶功能的認(rèn)識，而且為人工構(gòu)建親和力和特異性更高的抗體提供理論依據(jù)，將推動免疫學(xué)在醫(yī)學(xué)預(yù)防、治療等方面的應(yīng)用與發(fā)展。

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[收稿2016-02-19 修回2016-03-09]

(編輯 許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.031

①本文受國家自然科學(xué)基金(81471530)、廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313526)和廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研基金(A2014481)資助。

張莉芳(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制研究。

及指導(dǎo)教師：吳 平(1962年-)，男，博士，主任技師，主要從事風(fēng)濕免疫性疾病發(fā)病機(jī)制研究，E-mail：wpin62@126.com。 潘慶軍(1978年-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事自身免疫性疾病防治研究，E-mail:stilwapan@gmail.com。

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②并列第一作者。

③廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所，湛江524001。

④廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，湛江524001。