活動(dòng)期肺結(jié)核患者血漿miR-29家族及血清、外周血單個(gè)核細(xì)胞中γ干擾素的表達(dá)及意義

張國(guó)棟，丁雷，朱英斌，吳海良

肺結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性呼吸道傳染病，肺結(jié)核嚴(yán)重威脅患者健康，目前仍是導(dǎo)致人類死亡的十大原因之一[1]。2019年全球范圍內(nèi)估計(jì)有1 000萬(wàn)人罹患結(jié)核病[2]，我國(guó)結(jié)核病數(shù)量占全球第三，每年新增病例100萬(wàn)例。目前肺結(jié)核的診斷以病原學(xué)和病理學(xué)為基礎(chǔ)結(jié)合臨床輔助診斷技術(shù)進(jìn)行綜合判斷[3]。病原學(xué)分析培養(yǎng)周期長(zhǎng)，可長(zhǎng)達(dá)2～8周，電子支氣管鏡檢測(cè)假陰性較高，臨床上痰涂片法敏感度較低[4]。因此，開(kāi)發(fā)肺結(jié)核檢測(cè)新型指標(biāo)具有重要意義。肺結(jié)核感染分為潛伏期肺結(jié)核和活動(dòng)期肺結(jié)核，潛伏期肺結(jié)核患者無(wú)臨床癥狀，但是病原菌檢測(cè)為陽(yáng)性，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，可逐步發(fā)展為活動(dòng)期肺結(jié)核[5]。miRNA為一類短序列非編碼的小RNA，參與調(diào)控干細(xì)胞分化、胚胎造血、細(xì)胞增殖等生物學(xué)過(guò)程[6]。目前已有研究顯示，miRNA與肺結(jié)核的活動(dòng)性相關(guān)[7]。本研究比較了miR-29家族在不同人群中的表達(dá)差異，分析了miR-29a和靶基因γ干擾素(IFN-γ)與活動(dòng)期肺結(jié)核臨床癥狀的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2018年1月—2020年1月濟(jì)南市人民醫(yī)院、山東省胸科醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者104例，男53例，女51例，年齡30～75(42.31±16.72)歲?；颊甙从袩o(wú)臨床癥狀分為活動(dòng)性肺結(jié)核組和潛伏結(jié)核感染組，活動(dòng)性肺結(jié)核組患者52例，男26例，女26例，年齡(38.72±16.13)歲；潛伏結(jié)核感染組患者52例，男27例，女25例，年齡(43.21±17.24)歲。另選同期醫(yī)院體檢健康者45例作為健康對(duì)照組，男23例，女22例，年齡(40.31±20.22)歲。3組受試者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2018JN-16)，入選者及家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) 活動(dòng)期肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008) 肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》[8]。潛伏期肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)臨床癥狀，胸部X線正常，γ-干擾素或結(jié)核菌素陽(yáng)性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)單一肺結(jié)核感染；(2)年齡20～70歲；(3)肺結(jié)核初治；(4)肝腎功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肝炎或HIV感染；(2)合并腎炎；(3)免疫性疾?。?4)合并惡性腫瘤。

1.3 觀察指標(biāo)與方法 (1)收集受試者臨床資料，包括性別、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、臨床癥狀等資料。(2)檢測(cè)血清IFN-γ蛋白：取受試者清晨靜脈血，3 000 r/min、4℃離心10 min，取上層血清應(yīng)用ELISA法測(cè)定血清IFN-γ。(3)單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ mRNA和血漿miR-29a、miR-29b和miR-29c表達(dá)檢測(cè)：采集受試者清晨空腹肘靜脈血3 ml于EDTA抗凝管中,4 h內(nèi)以相對(duì)離心力2 000 g 離心20 min,棄上清,用淋巴細(xì)胞分離液按常規(guī)操作提取單個(gè)核細(xì)胞儲(chǔ)存于-80℃冰箱備檢，并將外周血分離血漿。血漿和單個(gè)核細(xì)胞提取mRNA,TRIzol裂解細(xì)胞,酚氯仿抽提總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 1 μg，PolyA聚合酶2 μl，RTase Mix 2 μl，5×緩沖液10 μl，ddH2O至50 μl。37℃ 60 min，85℃ 5 min滅活。所得cDNA進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)體系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 7 μl。RT-PCR程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 10 s，58℃退火延伸30 s， 35個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，各引物序列見(jiàn)表1，以2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本中基因的表達(dá)量。

表1 研究采用引物序列

2 結(jié) 果

2.1 3組受試者血液學(xué)相關(guān)指標(biāo)比較 3組受試者WBC、單核細(xì)胞比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ESR、CRP、淋巴細(xì)胞數(shù)比較，活動(dòng)性肺結(jié)核組>潛伏結(jié)核感染組>健康對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 3組受試者血液學(xué)相關(guān)指標(biāo)比較

2.2 3組受試者血漿miR-29a、miR-29b和miR-29c比較 血漿miR-29a表達(dá)比較，活動(dòng)性肺結(jié)核組>潛伏結(jié)核感染組>健康對(duì)照組(P<0.05)；3組血漿miR-29b和miR-29c比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 3組受試者血漿miR-29a、miR-29b和miR-29c比較

2.3 3組受試者單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ比較 單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平比較，活動(dòng)性肺結(jié)核組<潛伏結(jié)核感染組<健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 3組受試者單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ比較

2.4 血清IFN-γ、血漿miR-29a水平與活動(dòng)性肺結(jié)核臨床癥狀的關(guān)系 活動(dòng)性肺結(jié)核組患者依據(jù)是否有咳嗽、 胸痛、呼吸困難進(jìn)行分組，組間血清IFN-γ、血漿miR-29a水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；顒?dòng)性肺結(jié)核組內(nèi)有發(fā)熱、咯血癥狀患者的血清IFN-γ水平低于無(wú)發(fā)熱、咯血癥狀的患者；有發(fā)熱、咯血癥狀患者血漿miR-29a水平高于無(wú)發(fā)熱、咯血癥狀的患者(P<0.01)，見(jiàn)表5。

表5 血清IFN-γ、血漿miR-29a與活動(dòng)性肺結(jié)核臨床癥狀的關(guān)系

2.5 血清IFN-γ、血漿miR-29a水平對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的臨床診斷價(jià)值 ROC曲線顯示，血清IFN-γ、miR-29a診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的臨界值為257.31 pg/ml、1.13, 曲線下面積(AUC)為0.614、0.753，敏感度為0.573、0.682，特異度為0.801、0.802；二者聯(lián)合診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的AUC為0.784，敏感度為0.710，特異度為0.850，見(jiàn)表6、圖1。

表6 血清IFN-γ和血漿miR-29a對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的臨床診斷價(jià)值

圖1 血清IFN-γ、血漿miR-29a及二者聯(lián)合診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的ROC曲線

3 討 論

我國(guó)是肺結(jié)核高發(fā)國(guó)家之一，給居民健康和社會(huì)發(fā)展帶來(lái)巨大危害。目前肺結(jié)核診斷仍然缺乏特異度高且快速的檢測(cè)方法，尋找快速準(zhǔn)確的臨床檢測(cè)指標(biāo)具有重要意義。miRNA是一種源自內(nèi)源性染色體的非編碼單鏈RNA，miRNA參與機(jī)體的諸多生理功能，如細(xì)菌感染、細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育等過(guò)程[9-10]。miRNA具有檢測(cè)簡(jiǎn)單、樣品保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種潛在的肺結(jié)核檢測(cè)指標(biāo)。

目前研究顯示，已有多個(gè)miRNA與肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。樹(shù)突狀細(xì)胞被結(jié)核分枝桿菌感染后，miRNA-155可下調(diào)ATG3水平，從而引發(fā)細(xì)胞的自噬[11]。miRNA-144與活動(dòng)性肺結(jié)核相關(guān)，可通過(guò)下調(diào)TNF-α和IFN-γ的水平抑制機(jī)體保護(hù)性免疫過(guò)程，影響肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展[12]。體內(nèi)和體外研究中均證實(shí)miR-let-7與肺結(jié)核相關(guān)，結(jié)核分枝桿菌感染后巨噬細(xì)胞miR-let-7的表達(dá)下調(diào)，降低NF-κB通路的活性[13]。

此外，miR-21、miR-223等miRNA也被認(rèn)為與肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[14]。

miR-29家族主要分為miR-29a、miR-29b和miR-29c。目前的研究顯示，miR-29家族參與抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成，與肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、心肌纖維化均存在關(guān)聯(lián)[15-16]。miR-29家族通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白水平、誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，參與1型糖尿病的發(fā)生[17]。miR-29家族還參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在不同的腫瘤中分別起抑癌作用和促癌作用[18]。

目前有研究表明，miR-29家族可通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞分化，發(fā)揮機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)作用[19]，而在結(jié)核病發(fā)病過(guò)程中，其在T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫中發(fā)揮了重要作用，因此本研究比較了健康對(duì)照組、活動(dòng)性肺結(jié)核組和潛伏結(jié)核感染組患者miR-29a、miR-29b和miR-29c差異，結(jié)果顯示，活動(dòng)性肺結(jié)核組miR-29a表達(dá)上調(diào)，而miR-29b和miR-29c表達(dá)未出現(xiàn)十分明顯的數(shù)據(jù)變化。該結(jié)果提示，在人體感染結(jié)核分枝桿菌之后，miR-29a有可能負(fù)向調(diào)控人體對(duì)于病原體的免疫應(yīng)答情況，抑制機(jī)體對(duì)病原體抵抗能力，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌的活動(dòng)性增高。同時(shí)miR-29a可能通過(guò)調(diào)控p85等蛋白的表達(dá),使p53激活,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促使肺結(jié)核的病情加重。本研究結(jié)果中miR-29b和miR-29c在3組受試者中未見(jiàn)明顯的變化，推測(cè)這可能與受試者人群數(shù)量較少有關(guān)，同時(shí)miR-29b和miR-29c在肺結(jié)核中的作用尚不明確，這也成為今后研究的一個(gè)方向。

目前的主流研究認(rèn)為，miR-29a能通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因IFN-γ的表達(dá)而降低機(jī)體對(duì)胞內(nèi)病原體的免疫應(yīng)答水平[20]。本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)性肺結(jié)核患者單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平顯著下降，因此可以推測(cè)miR-29a主要參與了肺結(jié)核的發(fā)展。結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后，導(dǎo)致miR-29a水平上調(diào)，miR-29a可促進(jìn)IFN-γ mRNA與Ago2形成沉默復(fù)合物，抑制IFN-γ的表達(dá)，從而降低機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答[21]。IFN-γ是抗結(jié)核感染免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，miR-29 可通過(guò)上調(diào)靶向作用于細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞凋亡通路及促進(jìn)IFN-γ mRNA 降解，降低IFN-γ的產(chǎn)生和促進(jìn)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫細(xì)胞凋亡，從而使其得以逃避宿主免疫應(yīng)答。

此外本研究還初步分析了IFN-γ mRNA和miR-29a水平與肺結(jié)核患者多項(xiàng)典型臨床癥狀之間的關(guān)系，結(jié)果表明，IFN-γ mRNA和miR-29a水平與肺結(jié)核病變程度之間具有一定的相關(guān)性。為了進(jìn)一步評(píng)估IFN-γ和miR-29a在活動(dòng)性肺結(jié)核中的臨床價(jià)值，構(gòu)建了ROC曲線，確定了IFN-γ和miR-29a在活動(dòng)性肺結(jié)核中的臨界值，表明臨床可通過(guò)檢測(cè)IFN-γ和miR-29a水平用于活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷。然而，僅依靠IFN-γ mRNA和miR-29a水平對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核進(jìn)行診斷具有很大的誤差可能，因此在實(shí)際工作中，推薦利用多種指標(biāo)進(jìn)行綜合推斷。而本研究中所關(guān)注的這2個(gè)指標(biāo)，也同時(shí)需要進(jìn)行更加深入的分析，以期待具有更為客觀及實(shí)用的結(jié)果出現(xiàn)。

綜上所述，miR-29a可通過(guò)調(diào)節(jié)IFN-γ的表達(dá)參與結(jié)核病的發(fā)病，臨床研究可進(jìn)一步將miR-29a發(fā)展為結(jié)核病的檢測(cè)、評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究中miR-29b和miR-29c的作用不明，有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張國(guó)棟：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，起草論文；丁雷：數(shù)據(jù)收集，分析整理；朱英斌：進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與整理，修改論文；吳海良：提出研究方向，研究選題，論文終審