瑞舒伐他汀對晚期糖基化終產(chǎn)物修飾的低密度脂蛋白誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化的影響及其機(jī)制

趙馨娜，劉學(xué)波，吳宗貴

糖尿病是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，具有極強(qiáng)的致血管病變作用。糖尿病患者不僅冠心病的發(fā)病率是非糖尿病患者的數(shù)倍，且其冠狀動(dòng)脈病變常累及多支、全壁，病變血管狹窄程度重，病變處斑塊極不穩(wěn)定，容易破裂，可導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈綜合征,甚至猝死，具有較高的致死率、致殘率。因此，研究糖尿病中誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂的因素對糖尿病合并冠心病的防治具有重大意義。

近年來，糖尿病導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)分子機(jī)制研究取得了重大進(jìn)展，其中，LDL經(jīng)糖基化修飾后所形成的晚期糖基化修飾低密度脂蛋白(advanced glycation end product modified low density lipoprotein， AGE-LDL)，對動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展起到了非常關(guān)鍵的作用。研究表明，糖尿病患者體內(nèi)的AGE-LDL水平遠(yuǎn)高于非糖尿病患者，且其水平與心血管疾病的罹患風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[1]。而大量定植于血管周圍及外膜的肥大細(xì)胞在誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊失穩(wěn)定致突發(fā)破裂中亦扮演重要角色，其功能的發(fā)揮主要通過活化及脫顆粒來實(shí)現(xiàn)。肥大細(xì)胞活化及脫顆粒產(chǎn)物包括組胺、蛋白酶及多種炎性因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-8和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等，可誘發(fā)血管痙攣，降解基質(zhì)削弱纖維帽、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)血管新生增加斑塊內(nèi)出血及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)等[2]，增加斑塊不穩(wěn)定性。他汀類藥物是3羥基-3甲基-戊二酰—輔酶 A (HMG-CoA) 還原酶抑制劑，除降脂外，更具有直接的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[3]，從而成為臨床動(dòng)脈粥樣硬化治療中的常用藥物。近期研究表明，他汀類藥物能夠介導(dǎo)肥大細(xì)胞凋亡[4]。瑞舒伐他汀是目前指南推薦的高強(qiáng)度他汀類藥物之一，其對肥大細(xì)胞活性影響尚未見報(bào)道。本研究主要觀察瑞舒伐他汀對AGE-LDL激活肥大細(xì)胞的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～8周齡的雄性C57/BL6小鼠，購于中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號：SYXK(滬)2017-0004。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：RPMI1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，F(xiàn)BS(美國GIBCO公司)，小鼠 IL-6、TNF-α、MMP-9ELISA檢測試劑盒(北京達(dá)科為有限公司)，雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml，美國MP公司)，重組小鼠IL-3(rmIL-3)和重組小鼠干細(xì)胞因子(SCF，PeproTech公司)，PBS、FITC標(biāo)記的抗小鼠 CD117(c-Kit)單克隆抗體和PE標(biāo)記的抗小鼠FcεRIα單克隆抗體 (Biolegend公司)，流式緩沖液 (Miltenyi Biotec公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)，瑞舒伐他汀藥物原粉(阿斯利康公司)，PrimeScriptRRT Master Mix試劑盒、SYBRRPremix Ex TaqTM試劑盒[Takara，寶生物工程(大連)有限公司]?？功?Actin兔多克隆抗體(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，磷酸化p65(p-p65)、絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)磷酸化p38(p-p38)、 MAPK磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2(p-ERK1/2)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)兔單克隆抗體(Signaling Tecnology公司)，抗GAPDH鼠單克隆抗體(上?？党缮锕こ逃邢薰?。ECL化學(xué)發(fā)光液、Western預(yù)染蛋白 Marker、蛋白酶及磷酸酶抑制劑 Cocktail(Thermo公司)。RIPA(蛋白提取液)及PMSF(上海申能博彩生物技術(shù)有限公司)，Western抗體稀釋液(天恩澤生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2019年6月—2020年12月于海軍軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1 小鼠骨髓來源肥大細(xì)胞(mBMMCs)的分離、培養(yǎng)：將6～8周齡的雄性C57/BL6小鼠處死，無菌條件下沖洗小鼠長骨骨髓腔。收集沖得的骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為(0.5～1.0)×106/ml，加入RPMI 1640培養(yǎng)基(含50 μmol/L β-巰基乙醇、20 ng/ml rmIL-3，40 ng/ml rmSCF，10%FBS和雙抗)，置于37℃孵箱中培養(yǎng)。每3 d將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)4～6周后收集懸浮細(xì)胞，對形態(tài)和功能進(jìn)行鑒定[5]。鑒定mBMMCs表面標(biāo)記CD117和FcεRIα雙陽性表達(dá)率為95%以上。

1.2.2 AGE-LDL的制備：參照參考文獻(xiàn)[6]方法，用含EDTA和蔗糖的高糖反應(yīng)液在37℃下與LDL共同孵育2周，以不含糖的反應(yīng)液在相同條件下孵育LDL(n-LDL)作為對照。2周后在4℃下用無菌PBS充分透析，熒光檢測LDL糖化程度。經(jīng)0.22 μm無菌濾器在超凈臺內(nèi)過濾后加入保存液，分裝后于-80℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 mBMMCs分泌功能實(shí)驗(yàn)及分組：mBMMCs同步化后，以5×105/ml濃度種于6孔板中，分別加入PBS(Control組)、不同濃度的AGE-LDL(0.5 μg/ml、5 μg/ml、50 μg/ml,AGE-LDL組)、n-LDL 50 μg/ml(n-LDL組，陰性對照組)、LPS 100 ng/ml(LPS組,陽性對照組)、不同濃度的瑞舒伐他汀(1 mmol/L、10 mmol/L、50 mmol/L)預(yù)孵24 h后+AGE-LDL 50 μg/ml(瑞舒伐他汀+AGE-LDL組)，干預(yù)刺激6 h后收集細(xì)胞，留待抽提RNA，24 h后收集上清留待ELISA檢測TNF-α、IL-6和MMP-9含量。相同實(shí)驗(yàn)方案重復(fù)4次，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取其平均值。

1.2.4 Real-time PCR(RT-PCR)檢測炎性因子基因表達(dá)：用Trizol試劑抽提總RNA，參照TakaraPrimeScriptRRT Master Mix試劑說明制備cDNA。依照Takara SYBRRPremix Ex TaqTM試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μl，所用引物如下：TNF-α上游：5'- CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG-3',下游：5'- CCCGACTACGTGCTCCTCACC-3'；IL-6上游: 5'- TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG-3'，下游: 5'- TCTGACCCACAGTGAGGAATGTCCAC-3'；MMP-9上游：5'-TCTTCCCCAAAGACCTGAAAA-3'，下游：5'-TTTGGAATCGACCCACGTCT-3’；內(nèi)參基因β-actin上游：5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'，下游：5'- CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3。反應(yīng)條件為95℃ 30 s,95℃ 5 s、60℃ 30 s、72℃ 15 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)，最后95℃ 15 s,60℃ 15 s,95℃ 15 s。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)4次。以2-△△CT相對定量法計(jì)算目的基因表達(dá)。

1.2.5 ELISA檢測上清內(nèi)TNF-α、IL-6、MMP-9蛋白水平：嚴(yán)格按照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

1.2.6 Western-blot檢測MAPK、NF-κB信號通路表達(dá)及分組：mBMMCs同步化后，以5×105/ml濃度種于6孔板中，分別加入PBS(Control組)、AGE-LDL 50 μg/ml (AGE-LDL組)、n-LDL 50 μg/ml(n-LDL組)、瑞舒伐他汀10 mmol/L + AGE-LDL 50 μg/ml(瑞舒伐他汀+AGE-LDL組)，干預(yù)刺激30 min后收集細(xì)胞。同步化后的mBMMCs再分別與MAPK p38、ERK1/2及NF-κB抑制劑SB203580(10 mmol/L)、PD98059(20 mmol/L)及PDTC(20 mmol/L)預(yù)孵2 h，加入 AGE-LDL(50 μg/ml)，作用1 h后收集細(xì)胞。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，使用200 μl含抑制劑的預(yù)冷RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，4 ℃ 16 000 g離心30 min后收集上清。用SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。按說明書推薦濃度稀釋一抗和二抗，先后孵育。使用超敏ECL發(fā)光液依照其說明書步驟進(jìn)行檢測。以上試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 AGE-LDL及瑞舒伐他汀對mBMMCs合成和分泌炎性因子TNF-α、IL-6、MMP-9的影響 mBMMCs經(jīng)AGE-LDL刺激作用6 h后，RT-PCR檢測顯示,與Control組比較，AGE-LDL(5.0 μg/ml、50.0 μg/ml)組、LPS組TNF-α、IL-6 及MMP-9 mRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中AGE-LDL 50 μg/ml亞組表達(dá)量最高；n-LDL組與Control組比較，TNF-α、IL-6和MMP-9 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。瑞舒伐他汀則可下調(diào)AGE-LDL誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和MMP-9 mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但進(jìn)一步調(diào)高瑞舒伐他汀濃度至50 mmol/L效果未再見增強(qiáng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。AGE-LDL刺激24 h后,細(xì)胞培養(yǎng)上清的ELISA檢測結(jié)果與上述炎性指標(biāo)mRNA表達(dá)結(jié)果一致，見表3。

表1 不同濃度的AGE-LDL對mBMMCs TNF-α、IL-6及MMP-9 mRNA表達(dá)影響

表2 不同濃度的瑞舒伐他汀對AGE-LDL促mBMMCs炎性因子TNF-α、IL-6及MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

表3 瑞舒伐他汀對AGE-LDL促mBMMCs炎性因子TNF-α、IL-6及MMP-9分泌的影響

3 討 論

肥大細(xì)胞來源于骨髓造血干細(xì)胞，經(jīng)外周循環(huán)后在相關(guān)細(xì)胞因子的作用下分化成熟，并經(jīng)外界刺激后能夠活化釋放其胞內(nèi)多種活性物質(zhì)，參與介導(dǎo)過敏反應(yīng)和免疫炎性反應(yīng)。相關(guān)研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化病變的血管外膜及斑塊內(nèi)均聚集有大量肥大細(xì)胞，激活后釋放胞內(nèi)生物活性物質(zhì)，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬，損傷內(nèi)皮功能，調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)血管平滑肌增殖及向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促使炎性細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)黏附分子表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，從而參與AS的發(fā)生與發(fā)展[7-8]。而激活的肥大細(xì)胞所釋放的炎性因子TNF-α、IL-6、MMP-9與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[9]。

圖1 AGE-LDL及瑞舒伐他汀對mBMMCs MAPK和NF-κB信號通路激活的影響

表4 AGE-LDL及瑞舒伐他汀對mBMMCs MAPK和NF-κB信號通路激活的影響

表5 p38-MAPK、ERK1/2、NF-κB抑制劑對AGE-LDL促TNF-α、IL-6及MMP-9分泌的影響

AGE-LDL作為一種不可逆的非酶糖基化產(chǎn)物，由機(jī)體內(nèi)的低密度脂蛋白在長期高糖環(huán)境下作用生成。與正常人相比，糖尿病患者體內(nèi)的AGE-LDL水平明顯升高，且其升高的水平與動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的罹患風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[10]。AGE-LDL通過增加血小板聚集，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低血管活性物質(zhì)NO的合成，增加氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮黏附分子(VCAM-1)及巨噬細(xì)胞清道夫受體表達(dá)，降低LDL的轉(zhuǎn)運(yùn)，誘發(fā)血管損傷等一系列機(jī)制，促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展[11]，是糖尿病致動(dòng)脈粥樣硬化的重要病因。以往研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AGE-LDL免疫過的糖尿病apoE和LDLR(-/-)小鼠的AS進(jìn)程可得到有效抑制[12]。目前，AGE-LDL針對血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生作用及其機(jī)制的研究均有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，而其對肥大細(xì)胞作用如何尚無相關(guān)報(bào)道。Sick等[14]的研究顯示，晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)在短時(shí)間內(nèi)(10 min內(nèi))即可激活肥大細(xì)胞，促使肥大細(xì)胞釋放組胺。由此筆者推測，同樣具有促炎效應(yīng)的AGE-LDL亦極有可能對肥大細(xì)胞具有類似激活效應(yīng)，使其分泌大量炎性介質(zhì)，促使糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊形成，發(fā)生急性血栓事件。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),AGE-LDL能夠促進(jìn)mBMMCs分泌炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6、MMP-9。AGE-LDL誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化的作用可能是糖尿病患者易患動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病的病因之一。

他汀類藥物除能強(qiáng)效降低血總膽固醇及LDL-C水平，還具有改善血管內(nèi)皮功能、抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移、抗氧化、抗炎、抑制血小板聚集等作用，防止動(dòng)脈粥樣硬化的形成，穩(wěn)定和縮小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，從而顯著降低AS高?；颊咧饕难苁录陌l(fā)生率和病死率。目前指南推薦，對糖尿病伴心血管疾病者，無論其基線LDL-C水平如何，均建議采用他汀類藥物治療?，F(xiàn)有多項(xiàng)研究表明，阿托伐他汀、辛伐他汀和氟伐他汀等臨床常用的他汀類藥物均可抑制肥大細(xì)胞分泌活性炎性介質(zhì)，穩(wěn)定肥大細(xì)胞[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，作為目前血脂管理中優(yōu)選的他汀類藥物，瑞舒伐他汀能夠抑制AGE-LDL誘導(dǎo)mBMMCs活化、分泌促炎性因子，具有穩(wěn)定肥大細(xì)胞的作用。

促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號通路作為真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，參與介導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控及細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)。大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)存在MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞外被刺激激活后，形成不同轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)及核內(nèi)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等過程。

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，其過度激活與細(xì)胞凋亡、損傷應(yīng)激密切相關(guān)[16]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，AGEs能夠通過激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，而肥大細(xì)胞激活后生成的多種炎性因子如TNF-α、IL-6等均又與NF-κB信號通路的激活相關(guān)[17-18]。

本研究發(fā)現(xiàn),AGE-LDL能夠激活p38 MAPK、ERK1/2和NF-κB信號通路，促進(jìn)磷酸化p38 MAPK、ERK1/2和NF-κB的表達(dá)，對JNK信號通路則無激活作用。瑞舒伐他汀能夠抑制AGE-LDL所誘導(dǎo)的p38 MAPK、ERK1/2和NF-κB激活。ERK1/2抑制劑PD98059、NF-κB抑制劑PDTC和瑞舒伐他汀均能夠抑制AGE-LDL誘導(dǎo)mBMMCs合成和分泌促炎性介質(zhì)。而P38抑制劑SB203580則無該作用。上述結(jié)果表明，AGE-LDL主要是通過激活ERK1/2和NF-κB信號通路激活mBMMCs，促進(jìn)其合成和分泌TNF-α、IL-6等炎性因子。該激活效應(yīng)能夠被瑞舒伐他汀所抑制，其作用可能通過其對ERK1/2和NF-κB信號通路的抑制得以實(shí)現(xiàn)。

總之，本實(shí)驗(yàn)初步明確了AGE-LDL對肥大細(xì)胞活化的影響及其相關(guān)的分子機(jī)制，并且發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀具有穩(wěn)定肥大細(xì)胞的作用，為糖尿病合并AS的防治提供了新的理論基礎(chǔ)。必須指出的是，AS在人體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展過程相當(dāng)復(fù)雜，本研究作為體外單一因素研究，難免存在一定局限性。隨著肥大細(xì)胞與AS研究的不斷深入，本研究將會為糖尿病合并AS的形成機(jī)制和防治提供新視角和新靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

趙馨娜：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，統(tǒng)計(jì)分析，論文撰寫；劉學(xué)波：提出研究思路，論文修改和審核;吳宗貴：課題設(shè)計(jì)，論文審閱和修改