規(guī)?；i場非洲豬瘟采樣檢測關(guān)鍵點和常見誤區(qū)

張小剛 ，虞志強(qiáng) ，李雪平 ＊

（1．廣州悅洋生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510320；2．廣州華醫(yī)測檢測科技有限公司，廣東 廣州 510320）

自從2018年8月國內(nèi)暴發(fā)第一例非洲豬瘟（African swine fever，ASF）疫情起，規(guī)?；i場的發(fā)展模式就從快速轉(zhuǎn)為穩(wěn)健，生產(chǎn)流程都圍繞著ASF防控為前提。在ASF防控過程中，對非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的采樣和檢測十分重要[1-3]。截止稿前，隨著多種變異毒株的出現(xiàn)，國內(nèi)很多大中小規(guī)模化豬場都經(jīng)歷了“發(fā)病-清場-復(fù)產(chǎn)-發(fā)病”的過程，其中多數(shù)是由于豬場ASFV采樣存在交叉擴(kuò)散，以及檢測不及時、不準(zhǔn)確、檢不出等原因造成的[4-5]。

因此，文章總結(jié)了當(dāng)前規(guī)模化豬場現(xiàn)場采樣和檢測的一些關(guān)鍵點和常見誤區(qū)，以期防止國內(nèi)規(guī)模化豬場再次出現(xiàn)“發(fā)病-清場-復(fù)產(chǎn)-發(fā)病”無限死循環(huán)的現(xiàn)象。

1 豬場ASFV采樣關(guān)鍵點及注意事項

1.1 豬場采樣規(guī)范

1.1.1成立應(yīng)急采樣專業(yè)隊

中大型豬場應(yīng)根據(jù)場內(nèi)人員編制，提前成立應(yīng)急采樣專業(yè)隊，可以由飼養(yǎng)員組成（可考慮各組/環(huán)節(jié)抽人組成，可兼任日常異常豬場采樣監(jiān)控），采樣專業(yè)隊建議由隊長、副隊長及4名隊員組成（分兩組進(jìn)行，風(fēng)險高低分開），隊長和副隊長分別帶隊進(jìn)行采樣并監(jiān)控隊員采樣規(guī)范性，并具有采樣防污染及發(fā)生污染應(yīng)急處理能力；應(yīng)急采樣隊可以根據(jù)實際情況兼任本公司區(qū)域內(nèi)其他豬場的采樣（最好省內(nèi)，考慮到人員能否及時到位），特殊情況除外，有條件的盡量配備應(yīng)急采樣專業(yè)隊。

1.1.2采樣培訓(xùn)、準(zhǔn)備到位

平時培訓(xùn)好采樣專業(yè)隊對豬只（大欄/定位欄、大中小豬只、血液/唾液/咽拭子）、環(huán)境（重點是豬舍內(nèi)區(qū)域，包括但不限于欄桿、過道、風(fēng)機(jī)、門把手、工具、水鞋等）的采樣，準(zhǔn)備好采樣方式使用的棉拭子、紗布等。在豬場出現(xiàn)異常情況下，人員能夠快速到位組建采樣隊，確保在最短的時間里完成豬群幾輪的普篩，第一時間找到感染豬只。

1.1.3采樣效果監(jiān)控與評估

采樣專業(yè)隊隊長及副隊長應(yīng)該由公司負(fù)責(zé)技術(shù)的一把手考核認(rèn)定，具有全部類型標(biāo)準(zhǔn)采樣操作能力，隊長對隊員們采樣是否規(guī)范進(jìn)行培訓(xùn)和考核，并對他們進(jìn)行打分，盡可能減少可知錯誤采樣操作，要求全部隊員都能通過考核后才算采樣隊成立。豬場要時刻注意是否在過程中需要后補(bǔ)人員，防止隊員在需要時出現(xiàn)特殊情況，通常需要提前多預(yù)留一些人員進(jìn)行培訓(xùn)考核，保障發(fā)生異常情況時人員能夠及時補(bǔ)充。

1.1.4關(guān)注采樣準(zhǔn)確性

采集唾液時，豬只咀嚼時間不得小于10 s，確保收集到足夠量的唾液。采集咽拭子時，應(yīng)用棉絨拭子快速捅到咽喉，防止采集到的大部分是唾液，最好拔出時觀察是否有黏液（鼻涕狀），若沒有，建議重新采一次。唾液或咽拭子采樣盡可能控水?dāng)嗔?，控水盡可能在30 min以上，不喂料有利于豬只唾液分泌，另外也促進(jìn)豬只應(yīng)激，激發(fā)排毒作用，有利于提高部分豬只的檢出率。

采集血液準(zhǔn)，雖然前腔靜脈血、耳根血較尾根血較準(zhǔn)，但前兩者相對操作較難，通常需要保定豬操作，若大批量采集仍建議尾根血較為穩(wěn)妥，不過采尾根血也注意保護(hù)自身，避免血滴落到鞋上而擴(kuò)散到其他區(qū)域（通常操作完一條過道盡可能換一次鞋套等）。

環(huán)境采樣要求在消毒前或者與上一次間隔12 h（經(jīng)驗值）后采樣，避免消毒藥對檢測帶來的影響。一般來說，在豬場各個區(qū)域都需要日常消毒，但監(jiān)控環(huán)境是否帶毒，需要避免消毒藥（破壞核酸的消毒劑氯制劑、過氧乙酸、燒堿）的影響[6]。如果采集的樣品中含有消毒藥，那消毒藥可能將采集到的核酸降解，這樣可能會結(jié)果誤判，影響下一步的環(huán)境消毒。應(yīng)注意如果采用戊二醛等無法裂解核酸的消毒藥，如果之前環(huán)境樣檢出陽性，那無論采用這些消毒藥消毒多久，此時采樣必要性不強(qiáng)（屬于無效采樣）。采樣要在理論上行得通，而不是一刀切，一“采”到底。

1.1.5采樣隊自身防護(hù)與監(jiān)控

采樣隊進(jìn)出豬舍、豬舍內(nèi)操作以及當(dāng)天跨單元/棟等須嚴(yán)格控制防止交叉污染，做好沖涼、穿戴防護(hù)服、手套（膠手套+PE手套）、鞋套操作流程，防止擴(kuò)散（這些都有正確的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，需要注意）；每次采樣結(jié)束后，每個采樣隊員對自身頭發(fā)、臉、手、鞋底、外衣褲等進(jìn)行采樣，評估采樣過程中是否存在污染擴(kuò)散的現(xiàn)象，此過程可以通過專業(yè)采樣隊員互相協(xié)助采樣，盡量采樣精準(zhǔn)到位。

1.1.6豬場非洲豬瘟采樣方面注意事項

小型豬場（低于1 500頭母豬）建議各區(qū)域有采樣責(zé)任人，必要時可以考慮全員皆“兵”，既所有干部員工都非常熟悉采樣的全部流程；另外無論豬場大小，平時都需要做好日常異常/非正常豬只采樣監(jiān)測；任何采樣隊在采樣過程都可能會出現(xiàn)擴(kuò)散的可能，因此無論任何一種采樣方式都需要嚴(yán)格監(jiān)控人員操作（監(jiān)控方式可以雙崗制、視頻監(jiān)控如配執(zhí)法儀等，方便后續(xù)復(fù)盤與改正），避免污染擴(kuò)散。

1.2 豬場送樣規(guī)范

1.2.1編號信息完整簡潔

采樣管（不同規(guī)格EP管）清晰表明樣品信息編號，編號通常由場部根據(jù)棟舍規(guī)定，如第1棟用A1→An；第2棟用B1→Bn，以此類推。若實驗室為區(qū)域?qū)嶒炇遥ㄉ婕岸鄠€豬場，應(yīng)在前面表明好豬場代號，最好也是單個字母），其次各區(qū)域?qū)⒕幋a對應(yīng)的唾液/咽拭子/血液/環(huán)境等類型對應(yīng)，并且注明豬只欄號或具體環(huán)境區(qū)域，再由豬場統(tǒng)一將送檢表發(fā)至實驗室。具體見表1。

表1 豬場樣品送檢表及舉例說明

1.2.2樣品固定防污染

為防止樣品溢撒，要求樣品編號好放入樣品盒中進(jìn)行固定，并且對EP管蓋再一次進(jìn)行按壓，確保管蓋蓋緊，在送樣過程不會被震動崩開。通常多數(shù)豬場很少配備足量的樣品盒，可采用硬皮紙板/泡沫板替代（根據(jù)PE管大小間隔插孔）編號插入后，將蓋子再按壓一次，確保都蓋緊后，再在蓋子上方用一層未插孔的硬皮紙板/泡沫板蓋住，用橡皮筋捆綁好，并在其上次標(biāo)注好采樣時間、編號、區(qū)域和各類型樣品份數(shù)以及總份數(shù)。

1.2.3場內(nèi)送樣流程可控

樣品由生產(chǎn)線送至豬場大門口過程中，要確保單向流程，樣品做好雙層包裝，避免存在潛在風(fēng)險傳播到不同區(qū)域，尤其是大門口。整個傳遞過程由專人負(fù)責(zé)，防止交叉污染。

1.2.4送實驗室規(guī)范

將上述樣品，由場部統(tǒng)一收集，按規(guī)定時間送樣，安排專車第一時間送至實驗室（各豬場按實際情況確定，最好15:00前送樣，及時送樣可以在當(dāng)天出結(jié)果）。要根據(jù)實驗室人員、設(shè)備、檢測項目、檢測強(qiáng)度等情況，合理安排樣品送檢數(shù)，避免樣品長時間存放或?qū)嶒瀱T夜班疲勞檢測，影響樣品檢測的及時性和準(zhǔn)確性。若實驗室較近且實驗室能第一時間檢測，樣品盒可考慮不用加冰；若實驗室較遠(yuǎn)或者實驗室待檢樣品過多（同時檢測幾個豬場樣品等特殊情況），需要在樣品盒中加入適當(dāng)?shù)谋鶋K。

2 豬場ASFV檢測關(guān)鍵點及注意事項

2.1 專業(yè)人員操作

2.1.1實驗員持證上崗

實驗操作人員需要培訓(xùn)合格上崗，非專業(yè)人員可能會存在漏檢，錯位檢、錯誤檢等情況，影響檢測準(zhǔn)確性和時間性，大大影響到實際生產(chǎn)過程中的“拔牙”/隔離等操作。了解樣品檢測混樣檢測原則，通常核酸混樣不超過5個?？贵w不得混樣。

2.1.2掌握新技術(shù)手段

由于ASFV變異毒株的大量出現(xiàn)，傳統(tǒng)單重PCR不能滿足變異毒株的鑒定，并且部分未及時采樣豬只檢測后，會出現(xiàn)抗原無法檢出，但抗體能檢出的情況。因此在當(dāng)前背景下，要掌握多重PCR、抗原抗體同步檢測以及微滴數(shù)字PCR等多項新技術(shù)手段，確保能夠準(zhǔn)確鑒定、檢出，甚至實現(xiàn)痕量核酸的檢出。

2.1.3定期培訓(xùn)與考核

定期（最好半年）對實驗員進(jìn)行理論和實操等方面進(jìn)行培訓(xùn)考核，包括操作流程、各類實驗設(shè)備儀器的操作和使用，結(jié)果的準(zhǔn)確判斷，異常情況處理等，盡可能減少緊急狀況下出現(xiàn)異常結(jié)果，讓實驗室的檢測結(jié)果有真實指導(dǎo)意義，而非誤導(dǎo)。

2.1.4儀器設(shè)備精密高效

要求檢測抗原抗體儀器設(shè)備（含移液槍、漩渦器等）要具有設(shè)備穩(wěn)定、準(zhǔn)確性高、壽命長、性價比高以及與試劑盒磨合度高等多種優(yōu)勢。移液槍需要定期校準(zhǔn)，并且每次實驗結(jié)束后要調(diào)至最大刻度，防止彈簧壓死，影響移液準(zhǔn)確性。

2.1.5試劑盒選擇要科學(xué)合理

用于ASFV抗原抗體檢測的試劑盒必須具備批內(nèi)和批間穩(wěn)定性高，靈敏度高、準(zhǔn)確性高、性價比高等特點，確保能將不同變異毒株準(zhǔn)確檢測出來。包括病毒DNA/RNA提取試劑盒、鑒別ASFV野毒株和CD2V/MGF基因缺失毒株三重?zé)晒釶CR檢測試劑盒、非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒（UNG）、非洲豬瘟抗體間接ELISA檢測試劑盒（p30）、非洲豬瘟抗體C-ELISA檢測試劑盒（p54）等多種抗原抗體檢測試劑盒，用于對豬場不同毒株的檢測。

2.2 實驗數(shù)據(jù)精準(zhǔn)分析

2.2.1檢測結(jié)果判定準(zhǔn)確

實驗室人員要根據(jù)檢測試劑盒說明書將實驗結(jié)果準(zhǔn)確判定，如對擴(kuò)增曲線的讀取和異常評估，通過CT值判斷陰性、可疑和陽性值以及對抗體陽性值的計算和判定，這些需要實驗員都熟透于心，確保不出現(xiàn)任何差錯。

2.2.2異常結(jié)果復(fù)檢合理化

對于異常數(shù)據(jù)，實驗員對原樣品需進(jìn)行一次復(fù)檢，包括對核酸提取和反應(yīng)擴(kuò)增等，若復(fù)檢檢測陰性，則判斷陰性。若復(fù)檢結(jié)果仍然出現(xiàn)異常，要根據(jù)結(jié)果果斷判斷是否要求豬場進(jìn)行同1頭豬只再采樣（適當(dāng)時候可以結(jié)合環(huán)境樣/血液樣同步評估），重復(fù)采樣后根據(jù)檢測結(jié)果，實驗室給出具有指導(dǎo)意義的檢測結(jié)果。

2.2.3豬場非洲豬瘟檢測方面注意事項

CT值容易因為樣品被生理鹽水等的稀釋導(dǎo)致升高，如果樣品稀釋過多，雖不影響陽性判斷，但容易影響現(xiàn)場對下一步的操作，比如“拔牙”的力度和區(qū)域等。

2.3 實驗室防污染

實驗室容易受到實驗樣品、陽性對照、實驗操作、擴(kuò)增產(chǎn)物、樣品廢棄物等的污染，如果處理不當(dāng)，很容易造成檢測結(jié)果出現(xiàn)異常[7-8]。尤其在當(dāng)前病毒低毒株橫行的時期，如果實驗室污染造成實驗結(jié)果陽性偏多，那對于豬場“拔牙”損失也是巨大的，所以實驗室防污染是十分重要的。

2.3.1選用防污染的檢測試劑

如為防止PCR室擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可以選用加入UNG酶的試劑盒，可大大減少擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠污染。

2.3.2實驗員操作規(guī)范

實驗員需要具有很強(qiáng)的生物安全意識。正常情況下，進(jìn)入到實驗室需要沖涼更衣，這些大型企業(yè)是具備條件的。但中小型豬場實驗室目前不具備這種條件，這就需要實驗前洗手（或者消毒濕紙巾擦拭手臉等）、換實驗服以及換鞋等操作，盡可能防止外界將風(fēng)險傳到實驗室內(nèi)，又可以避免實驗室污染擴(kuò)散到外界。

樣品預(yù)處理需要特別小心實驗污染，如唾液大棉簽可以采取螺絲釘方式進(jìn)行離心取樣，如果采取擠脫方式，不小心會造成實驗室地面及樣品污染，甚至污染到實驗員本身，導(dǎo)致實驗室整體污染。在加入陽性對照時，要在特定區(qū)域或空曠區(qū)域加入，加樣時要特別小心，避免灑落和槍頭的無害化處理，確保陽性對照不會污染實驗室或污染到其他樣本。

2.3.3實驗室合理分區(qū)

實驗室根據(jù)不同功能區(qū)可以分成試劑配制區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)等三大區(qū)，有條件的豬場還可以增加物資儲備區(qū)、樣本處理區(qū)和廢棄物處理區(qū)等。正常區(qū)域應(yīng)該配有傳遞窗（具有僅能單一打開的雙層門，含有紫外照射）方便樣品傳遞以及防止外界污染。各區(qū)域要控制好空氣流動，防止由于氣溶膠循環(huán)污染。

2.3.4實驗室日常消毒和監(jiān)測

通常實驗室每天對臺面等區(qū)域進(jìn)行清理清潔，并采用84消毒液進(jìn)行日常消毒；通常情況下，操作臺、自動抽提機(jī)、實驗室各區(qū)域，每天操作結(jié)束后需要定時紫外消毒，包括每天晚上，定時照射紫外半小時以上；移液槍、離心機(jī)、PCR儀、抽提機(jī)等需要定期用84消毒液進(jìn)行消毒，必要時需要廠家專業(yè)人員進(jìn)行拆洗，如移液槍等設(shè)備；定期對實驗室人員、地面、操作臺、各處理間、儀器設(shè)備等進(jìn)行采樣檢測評估（空氣沉降法和表面擦拭法），評估是否實驗室造成污染，如果出現(xiàn)污染，立即對實驗室進(jìn)行消殺，確保實驗操作不受污染。

2.3.5實驗廢棄物處理

廢棄物包括豬場送樣的風(fēng)險樣品（預(yù)處理前）、預(yù)處理過程中使用的槍頭/一次性手套等、抽取樣品和核酸以及陽性對照的槍頭、核酸提取反應(yīng)板、擴(kuò)增后產(chǎn)物等。這些物品通常需要高壓滅菌（121 ℃30 min）后再處理，也可以在合適區(qū)域，加入柴油等及時進(jìn)行焚燒處理。應(yīng)注意存在陽性風(fēng)險的實驗廢棄物不得在空地長時間放置，要避免動物媒介將污染擴(kuò)散，任何廢棄物建議第一時間處理或密封存放。

2.4 實驗室設(shè)備維護(hù)

2.4.1定期維護(hù)

實驗室移液槍需要定期維護(hù)好（包括定期廠家校準(zhǔn)，正常半年一次；并且每天上下午實驗結(jié)束后要調(diào)至最大刻度，防止彈簧壓死，影響移液量），避免出現(xiàn)漏液、少液等情況，以免導(dǎo)致實驗結(jié)果不太精準(zhǔn)。

2.4.2及時清理消毒

全自動抽提機(jī)和PCR儀需要及時清理、消毒，每次做完實驗后，及時定期進(jìn)行紫外照射，長時間不用設(shè)備時，可以考慮及時將電源關(guān)閉，避免長時間待機(jī)不使用，影響使用年限。

2.4.3避免受潮及斷電保護(hù)

實驗室設(shè)備要進(jìn)行適當(dāng)合理分區(qū)擺放，設(shè)備放置區(qū)域要保住通風(fēng)干燥，通常與冰箱以及清洗區(qū)適當(dāng)分開，有利于避免設(shè)備受潮，而降低設(shè)備的使用壽命。貴重設(shè)備建議安裝設(shè)備斷電保護(hù)器，防止運(yùn)行時斷電可能造成對設(shè)備的損壞情況等。

3 豬場非洲豬瘟采樣檢測過程的一些常見誤區(qū)

3.1 生物安全意識低

若采樣未成立專業(yè)采樣隊，采樣過程和消毒過程一樣，都可能會發(fā)生不小心導(dǎo)致疫情擴(kuò)散的情況，若非專業(yè)隊操作，可能會導(dǎo)致陽性豬樣品擴(kuò)散給其他豬只。并且在送樣過程中未對樣品進(jìn)行固定擺放（樣品盒或紙板等），容易導(dǎo)致某個樣品溢出后污染全部樣品，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。送樣過程未做到專人單向運(yùn)輸，或者傳遞完樣品后又接著送生產(chǎn)物資等，可能造成全場交叉污染，對生物安全的威脅巨大。

3.2 豬場現(xiàn)場采樣不合理

3.2.1環(huán)境采樣不合理

注意消毒藥的影響，尤其是氯制劑、過氧乙酸等容易對核酸進(jìn)行降解的消毒藥，若這類消毒藥對環(huán)境進(jìn)行消毒后不得立即采樣，應(yīng)注意藥物揮發(fā)后再采樣。另外若用戊二醛消毒，采樣檢測ASFV核酸也是沒有必要的。

3.2.2唾液樣品采集不到位

豬只咀嚼時間不足，或者未控水采樣，導(dǎo)致部分低毒量豬只無法檢出的情況，無法及時對陽性豬只進(jìn)行清除，從而導(dǎo)致陽性豬只長期存在而傳染給周邊豬只或同棟其他區(qū)域豬只。

3.2.3異常豬采樣不確保

若無法采集到豬只唾液（不咀嚼棉簽或長時間未喝水導(dǎo)致口干），建議深部咽拭子采樣，若仍然采集不到，可以考慮采集血液或者豬頭能接觸的欄桿料槽等環(huán)境樣，確保盡可能收集到能準(zhǔn)確評估豬只狀況的樣品。

3.3 實驗室操作不專業(yè)

3.3.1實驗員培訓(xùn)不到位

實驗員對實驗操作不熟悉，可能導(dǎo)致加樣時混樣、串樣或者污染其他樣品，導(dǎo)致陽性樣本污染陰性樣本的情況，影響實驗結(jié)果。另外檢測過程中也需要防止各種污染，包括日常進(jìn)出實驗室操作、日常消毒和監(jiān)控以及污染物的無害化處理等措施。

3.3.2樣品合并檢測不合理

抗原檢測時，核酸混樣超過5個，這樣容易導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，如部分病毒量比較低的樣品可能會由于混樣導(dǎo)致檢測陰性?？贵w混樣檢測會增加實驗操作，而且對出結(jié)果的時間也會大大降低。

3.3.3處理不當(dāng)造成假陰性

實驗室或采樣人員處理樣品時，可能會存在樣品采集不足或運(yùn)輸過程風(fēng)干等情況，實驗員可能涉及到加入稀釋液或緩沖液將樣品進(jìn)行稀釋，但如果檢測結(jié)果與實際偏差太大，容易導(dǎo)致生產(chǎn)一線對疫情暴發(fā)程度的誤判，容易導(dǎo)致現(xiàn)場制定錯誤的清除策略。

3.3.4實驗數(shù)據(jù)分析不準(zhǔn)確

非專業(yè)人員，不會判斷儀器設(shè)備出現(xiàn)故障或者出現(xiàn)異常，則很容易導(dǎo)致誤判，影響到生產(chǎn)一線的下一步操作。

3.3.5儀器維護(hù)不及時

實驗室移液槍等未定期維護(hù)好（或日常未調(diào)節(jié)好刻度），可能存在漏液、少液等情況，影響到檢測結(jié)果，導(dǎo)致實驗結(jié)果不太精準(zhǔn)；其他設(shè)備應(yīng)定期清理清潔，并且電源要定時關(guān)閉，設(shè)備最好不要長時間處于待機(jī)狀態(tài)。

3.3.6使用低性價比的產(chǎn)品

實驗設(shè)備不穩(wěn)定、試劑盒準(zhǔn)確度和靈敏度不高，雖然價格上占優(yōu)勢，但得出的結(jié)果和實際偏差很大，往往會導(dǎo)致豬場帶來嚴(yán)重的后果。建議選用高品質(zhì)的實驗設(shè)備和試劑盒，配套全方位正確方案，才能讓豬場實際生產(chǎn)得到保障。

4 總結(jié)

我們知道，ASF疫情一直都是可防可控，即使變異病毒的出現(xiàn)算是雪上加霜，國內(nèi)仍有大量規(guī)模化豬場“拔牙”成功，表明只要控制好生物安全、采樣檢測、豬群流動等一系列關(guān)鍵點，任何毒株造成的疫情都能成功穩(wěn)定控制。我們堅信，在有效疫苗出現(xiàn)前的若干時間里，在國內(nèi)規(guī)?；i場采樣和檢測環(huán)節(jié)，若能做到人員操作行為專業(yè)、方法手段新穎好用、污染擴(kuò)散控制有效、檢測分析精準(zhǔn)可靠等一系列關(guān)鍵節(jié)點，一定能將ASFV拒之大門之外；哪怕有ASFV進(jìn)入到豬場，也能借助科學(xué)手段做到精準(zhǔn)快速清除，繼而實現(xiàn)豬場穩(wěn)定生產(chǎn)。