王若帆，侯 茂，謝夢憶，游 川，李敬東,*

（1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川南充 637200；2.川北醫(yī)學院肝膽胰腸疾病研究所，四川南充 637200；3.宜賓學院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000）

除中草藥外，傳統(tǒng)發(fā)酵食品正在成為一些生理活性物質(zhì)的重要來源[1]，特別是一些采用自然混菌固態(tài)發(fā)酵方式加工的食品[2]。以濃香型白酒為例，其實質(zhì)為窖池連續(xù)發(fā)酵容器，在涵養(yǎng)了大量微生物的發(fā)酵糟醅中不斷補充新原料、新微生物（糧食、大曲），取出發(fā)酵產(chǎn)物（白酒）的混菌固態(tài)連續(xù)培養(yǎng)體系，經(jīng)多輪次生產(chǎn)，這一獨特的連續(xù)培養(yǎng)體系（酒糟）中匯集了多種復雜代謝產(chǎn)物[3?6]。其中容易揮發(fā)的微生物代謝產(chǎn)物傾向于通過蒸餾進入餾出液（白酒）中，難揮發(fā)的多肽、多糖等活性成分則更容易殘留在酒糟中，這些物質(zhì)可能具有一定的生理活性。

近年來由于人們飲食結(jié)構的變化，肝臟承受了遠超過去的解毒壓力，肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）已成為導致死亡的第二大癌癥[7]，具有保肝護肝作用的保健食品開發(fā)一直是功能食品領域的研究熱點，現(xiàn)有研究主要通過這些天然產(chǎn)物對肝癌細胞的抑制作用來評價其護肝效果。人肝癌細胞HepG2 細胞易于培養(yǎng)，是肝癌研究中使用最廣泛的細胞系，此類研究多集中于天然產(chǎn)物對HepG2 細胞增殖的抑制作用、對HepG2 細胞生長過程中關鍵蛋白表達的影響及細胞凋亡的影響等方面，但同時開展上述研究的報道較少。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)多種食源性天然產(chǎn)物具有護肝作用[8]，包括藍莓、懷槐、獼猴桃、金銀花、松花粉、葛根、余甘子、小麥胚芽等，一些植物經(jīng)發(fā)酵后還會產(chǎn)生新的護肝活性成分[9]。對食品而言，當前的研究主要是在揭示護肝活性成分及藥理的基礎上，發(fā)現(xiàn)一些新的護肝原料，并提取其活性成分或直接以原料配伍，開發(fā)風味及護肝效果均較好的護肝食品。酒糟作為谷物發(fā)酵產(chǎn)物，其毒副作用相對較低[10]，具有作為保健食品原料的潛力，但迄今為止對固態(tài)發(fā)酵的糧食酒糟中活性成分的研究還很少。本研究在初步測定酒糟粗提物的成分的基礎上，探究其對肝癌HepG2細胞的抑制作用及其相關機制，不僅可為各白酒產(chǎn)區(qū)酒糟資源的深度開發(fā)提供參考，減少生產(chǎn)旺季因酒糟積壓而造成的環(huán)境壓力，也可為護肝功能食品的開發(fā)提供一些新的思路，提高白酒產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物酒糟的綜合利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HepG2 細胞 由美國愛因斯坦醫(yī)學院惠贈；酒糟粗提物 提取自五糧液股份有限公司提供的出窖糟；DMEM 高糖培養(yǎng)基（生化試劑） Thermo Scientific；胎牛血清、0.25%胰酶（2500 U/mL）、鏈霉素/青霉素雙抗液（生化試劑） Gibco；DMSO、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（生化試劑） 碧云天；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIZOL、SYBR-GREEN（生化試劑）Takara；所有抗體（生化試劑） CST；PCR 96 孔板Roche；10 cm 及4 cm 培養(yǎng)皿 康寧公司；RTCA 增殖板 艾森生物公司；所用引物（生化試劑） 上海生工，見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

6530Accurate-Mass Q-TOF 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Agilent；xCElligence RTCA DP 實時無標記細胞分析儀、 NovoCyte 流式細胞儀 ACEA；NanoDrop One 微量分光光度計、GeneAmp 9700 PCR 儀 Thermo Scientific；LightCycler96 實時熒光定量PCR 儀 Roche；Fusion Solo 化學發(fā)光成像儀VILBER。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒糟粗提物的制備及活性成分測定 100 g 出甑酒糟加入95%乙醇1200 mL，75 ℃回流提取2 h后，75 ℃、200 mbar 旋蒸濃縮至100 mL，取10 mL經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，分裝入2 mL 樣品瓶，采用液質(zhì)聯(lián)用色譜儀檢測其組分，其余繼續(xù)濃縮至近干，取出，50 ℃烘干至恒重。

色譜條件[11]：hermo-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動相為0.1 %甲酸溶液（A）和甲醇（B），流速0.2 mL/min，進樣量5 μL，ESI 離子源掃描范圍50～1000 m/z，干燥溫度350 ℃，干燥氣流速8.0 L/min，噴霧壓力40 psig。采用面積歸一化法進行相對定量，采用Agilent 公司TCM 數(shù)據(jù)庫檢索對離子進行定性。

1.2.2 樣品溶液的制備 將酒糟粗提物稱重0.2 g，并將其溶于1 mL DMSO 溶液中混勻，再用DMEM培養(yǎng)基加至40 mL，配成濃度為5 mg/mL 的酒糟粗提物樣品溶液。在超凈工作臺里，用0.22 μm 濾器過濾后放4 ℃冰箱保存并取少量進行無菌測試。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 將HepG2 細胞從液氮中取出置于10 mL 離心管中，37 ℃恒溫水浴鍋中融化復蘇，與6 mL DMEM 培養(yǎng)基（1% 雙抗液和10% 胎牛血清）混勻后，以1200 r/min 常溫離心5 min，丟棄上清液，加入6 mL DMEM 培養(yǎng)基，輕吹制成細胞懸液后將其轉(zhuǎn)移至10 cm 培養(yǎng)皿中，放在恒溫孵箱（37 ℃、5% CO2）中培養(yǎng)1～2 d，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿表面積的90%以上進行傳代。加入300 μL 濃度為0.25%、酶活為10000 U/mL 的胰酶消化離心獲得細胞混懸液，將細胞接分盤接種到2～3 個培養(yǎng)皿中，完成傳代培養(yǎng)。

1.2.4 酒糟粗提物對細胞增殖的影響 首先將加入60 μL/孔完全培養(yǎng)基的16 孔增殖板放入實時細胞分析儀（RTCA）中測量基線，再將HepG2 細胞以6000 個/孔接種到16 孔增殖板中，放入孵箱培養(yǎng)至細胞進入對數(shù)生長期后，在每孔中加入不同濃度的酒糟粗提物并設置無藥物的對照組，再次將加完藥物的16 孔板放回孵箱中，設定程序每10 min 進行一次阻抗值讀數(shù)，48 h 后獲得完整的細胞生長曲線[12]，實驗重復3 次。

1.2.5 酒糟粗提物對細胞周期及細胞凋亡的影響細胞周期實驗：取2 mL 密度為1.5×105個/mL 的HepG2 接種到6 孔板中，使用不同濃度的酒糟粗提物分別刺激肝癌HepG2 細胞24 h，再收集細胞于流式管中，加入4 mL PBS 清洗細胞兩次，離心棄上清液，逐滴加入預冷的75%乙醇，4 ℃避光過夜后離心棄上清液，先后用PBS 和染液清洗細胞，除去乙醇，最后將PI/RNase 染液0.5 mL 重懸清洗后的細胞，室溫孵育15 min 后上流式細胞儀檢測[13]。

細胞凋亡實驗：使用預冷的PBS 溶液清洗不同濃度酒糟粗提物處理后的HepG2 細胞2 次，再將不含EDTA 的胰酶500 mL 滴入培養(yǎng)皿，37 ℃消化細胞90 s 并轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫1500 r/min 離心5 min，再用預冷的PBS 洗滌細胞1 次，用400 μL 1×Binding Buffer 重懸細胞，再加5 μL Annexin VFITC 混勻后避光室溫孵育15 min，上機前5 min 再加5 μL PI 染色，并在上機前補加200 μL 1×Binding Buffer[14]，上述實驗重復3 次。

1.2.6 酒糟粗提物對HepG2 細胞CyclinA、CDK2、Bax、Bcl-2 基因表達的影響 采用TRIZOL 法提取使用不同濃度的酒糟粗提物分別刺激肝癌HepG2細胞24 h 的細胞總RNA，測定RNA 純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進一步合成20 μL 體系的cDNA，采用TRIZOL 法 PCR Master Mix 10 μL、上下引物各0.5 μL、ddH2O 7 μL 以及cDNA 2 μL 構成20 μL 的反應體系，為減少誤差，每個樣本設置三個復孔。將96 孔板放入PCR 儀進行反應：95 ℃預變性2 min，三步擴增共39 個循環(huán)（95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s），95 ℃溶解10 s、65 ℃退火60 s、97 ℃解鏈1 s，37 ℃冷卻30 s[15]。引物表見表1，實驗重復3 次。

1.2.7 酒糟粗提物對HepG2 細胞凋亡標志蛋白表達的影響 使用PBS 清洗3 次不同濃度酒糟粗提物刺激24 h 后的細胞，收集并轉(zhuǎn)移至1.5 mL 的離心管中，加入300 μL RIPA 裂解液，充分混勻，放置在水平搖床上冰浴反應30 min（適時加入蛋白酶抑制劑PMSF）。上述蛋白液與BCA 試劑盒中的適量A、B 液混勻，放入酶標儀中測量并計算濃度確定上樣量后，另取上述蛋白液加入1/4 蛋白液體積的5×蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸10 min 后采用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，PVDF 轉(zhuǎn)膜2 h，后用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉PVDF 膜大于1 h，TBST 洗膜3 次（每次10 min），PVDF 膜孵育一抗過夜，清洗后加入二抗孵育2 h，最后向PVDF 膜滴加ECL 超敏發(fā)光液A、B 各300 μL 進行顯影，使用軟件Image J 進行灰度分析[16]，實驗重復3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS Statistics 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±S）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD 法），P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-MS 檢測酒糟粗提物的組成成分

酒糟粗提物中含有43 種物質(zhì)，由表2 可知，其中包括多種曾被報道具有護肝作用的活性物質(zhì)或其結(jié)構類似物，如相對含量最高（4.670%）的氟代木犀草素，其結(jié)構類似物木犀草素對5-氟尿嘧啶抗肝癌具有增敏作用[17]，相對含量為0.207%的環(huán)小葉黃楊堿，其結(jié)構類似物黃楊堿可調(diào)節(jié)肝癌周期[18]。小檗紅堿具有多種抗癌活性[19]，雷藤三萜內(nèi)酯A、呋喃甲酰胺、異葉烏頭堿、榛仁球蛋白、植醇、異葉烏頭堿、加拿大麻醇甙、ζ-胡蘿卜素等8 種成分也體現(xiàn)出抗肝癌或其他癌細胞的作用[20?24]。

表2 酒糟粗提物的主要活性成分Table 2 Components of abstract from distillers' grains

2.2 酒糟粗提物對HepG2 細胞增殖的抑制作用

不同濃度的酒糟粗提物處理HepG2 細胞后2 d 內(nèi)每10 min 連續(xù)讀取HepG2 細胞的NCI 值（Normalized Cell Index），結(jié)果見圖1。從添加酒糟提取物后12、24、36 及48 h 的不同濃度的NCI 值可以看出，隨著作用時間的增加，24 h 后酒糟提取物抑制HepG2 細胞生長的作用開始顯現(xiàn)，這與多種中藥提取物的作用時間接近[25]。24 h 后，酒糟提取物對HepG2 細胞增殖的抑制作用與酒糟提取物濃度有關，與0 μg/mL 相比，酒糟粗提物在濃度20 μg/mL時對HepG2 細胞NCI 值影響不大，但從濃度60 μg/mL 開始能夠顯著降低NCI 值（即抑制HepG2細胞的增殖）（P<0.05），差異有統(tǒng)計學意義。根據(jù)RTCA 2.1 軟件計算得到酒糟粗提物在12 h 的IC50=110 μg/mL。

圖1 酒糟粗提物對HepG2 細胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibition on proliferation of HepG2 cells of crude extraction from distillers' grains

2.3 酒糟粗提物對HepG2 細胞周期的影響

流式細胞儀細胞周期分析顯示，HepG2 細胞在S 期的比例明顯高于對照組（P<0.05），推測酒糟提取物可能導致HepG2 細胞阻滯在S 期，當酒糟粗提物的濃度升高S 期占比逐漸升高，見圖2A。Real-time PCR 結(jié)果表明，添加濃度為78.9 μg/mL 和98.0 μg/mL的酒糟粗提物后，Cyclin A 和CDK2 蛋白的mRNA表達量顯著低于對照（P<0.05），見圖2B、C，可能是由于酒糟提取物抑制了Cyclin A 及CDK2 的生成，Western-Blot 證實，S 期的周期蛋白CyclinA 及其激酶CDK2 表達量顯著低于對照（P<0.05），見圖2D、E、F，表明酒糟粗提物使HepG2 細胞周期被阻滯在S 期的機制主要在于DNA 合成期相關的周期蛋白CyclinA 及其激酶CDK2 的mRNA 和蛋白的表達量隨酒糟粗提物濃度的增加而降低，使肝癌HepG2細胞不能通過S 期的檢查點，無法進入G2/M 期，從而抑制了其增殖[26?29]。

圖2 酒糟粗提物對HepG2 細胞周期的影響Fig.2 Effects of crude extraction from distillers' grains on HepG2 cell cycle

2.4 酒糟粗提物對HepG2 細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測HepG2 細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示藥物處理組的細胞凋亡要顯著多于對照組0 μg/mL 且與酒糟粗提物的濃度成正相關（P<0.05），見圖3A。Real-time PCR 結(jié)果表明，與對照組0 μg/mL相比，隨著酒糟粗提物濃度的增加，Bcl-2 的mRNA表達量逐漸降低，49.5、78.9 和98.0 μg/mL 這3 組有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而Bax的mRNA 表達量逐漸升高，78.9 和98.0 μg/mL 這兩組有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖3B、C。Western Blot 進一步驗證表明，酒糟粗提物刺激后的肝癌HepG2 細胞的Bcl-2 的表達量隨濃度升高而顯著降低，Bax 的表達量隨濃度升高而顯著升高（P<0.001），見圖3D。這表明酒糟提取物誘導HepG2 細胞凋亡與細胞內(nèi)決定細胞凋亡敏感性起重要作用的Bcl-2 與Bax[30?31]相對表達量有關，其誘導HepG2 細胞凋亡的主要機制在于通過調(diào)節(jié)Bcl-2 和Bax 的相對表達量，從而誘導HepG2 細胞發(fā)生凋亡，該機制類似于5-FU、順鉑、喜樹堿等[32]抗癌藥物。

圖3 酒糟粗提物對HepG2 細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of crude extraction from distillers' grains on apoptosis of HepG2 cells

2.5 酒糟粗提物對介導凋亡的線粒體通路的影響

Western Blot 檢測表明，經(jīng)藥物刺激后的肝癌HepG2 細胞，CYTC、Cleaved-Caspase-9 及Cleaved-Caspase-3 的表達量顯著升高（P<0.05），Caspase-9 及Caspase-3 的表達量顯著降低（P<0.05），見圖4，這表明在Bcl-2、Bax 介導凋亡的三條通路（線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路）中，酒糟粗提物促進肝癌HepG2 細胞發(fā)生凋亡可能和凋亡的線粒體途徑被激活相關。

圖4 酒糟粗提物對凋亡相關蛋白的影響Fig.4 Effects of crude extraction from distillers' grains on the protein levels of apoptosis-related proteins

3 討論與結(jié)論

本研究主要針對酒糟中的生理活性物質(zhì)開展研究，采用中藥數(shù)據(jù)庫從濃香型白酒糟中鑒定出氟代木犀草素、環(huán)小葉黃楊堿、榛仁球蛋白、植醇、異葉烏頭堿、加拿大麻醇甙、ζ-胡蘿卜素、吐葉醇、小檗紅堿等多種具有抗癌活性的成分。體外實驗表明，酒糟粗提物可抑制HepG2 細胞的增殖，并通過激活介導凋亡的線粒體通路誘導肝癌HepG2 細胞發(fā)生凋亡。

與來源于藥物或昂貴天然產(chǎn)物不同，酒糟提取物來源于糧食發(fā)酵后的副產(chǎn)物，具有廉價、無害的屬性，這不僅為綠色保健食品的開發(fā)提出了新的思路，也在酒糟現(xiàn)有利用途徑（飼料、肥料、燃料等）的基礎上，為酒糟資源的深度綜合開發(fā)提供了新的視角。但與活性成分含量相對較高的中藥相比，酒糟活性成分的提取還存在活性成分濃度相對較低、雜質(zhì)干擾等問題，后續(xù)將進一步優(yōu)化提取純化方法，同時采用代謝組學方法進一步分離酒糟粗提物，聚焦其中的抗癌活性成分，解析其分子結(jié)構，為相關抗癌藥物的研發(fā)提供新的思路。