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      基于代謝組學(xué)分析工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中代謝物的變化

      2021-11-23 08:30:44宮連瑾薄佳慧杜哲儒孫紅玉陳義琴裴若云肖力爭(zhēng)
      食品工業(yè)科技 2021年21期
      關(guān)鍵詞:黃酮醇類物質(zhì)工夫

      宮連瑾,薄佳慧,杜哲儒,李 瑾,孫紅玉,陳義琴,裴若云,肖力爭(zhēng),3,*

      (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南長(zhǎng)沙 410128;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南長(zhǎng)沙 410128)

      工夫紅茶是我國(guó)特有的傳統(tǒng)茶類,具有滋味甘甜醇厚、香氣優(yōu)雅高長(zhǎng)、湯色明亮的典型特征[1]。工夫紅茶的初制過(guò)程為萎凋、揉捻、發(fā)酵(氧化)和干燥,其中發(fā)酵過(guò)程是其色、香、味形成的關(guān)鍵工序[2]。因此,探索工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)的變化,是了解工夫紅茶品質(zhì)形成的重要途徑。然而,由于分析方法的限制,對(duì)于復(fù)雜的發(fā)酵過(guò)程往往不能進(jìn)行全面的研究。

      如今,隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,檢測(cè)茶葉各方面指標(biāo)的方法也開(kāi)始增多,其中代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于茶葉研究[3]。代謝組學(xué)研究主要采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振、毛細(xì)血管電泳技術(shù)等方法,闡明茶葉加工過(guò)程中的化學(xué)變化,更加全面的展現(xiàn)了茶葉從種植到加工過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,從而揭示茶葉特殊風(fēng)味的形成原理[4?6]。例如,研究證明,運(yùn)用GC-MS(氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用)可分離和鑒定紅茶中微量和芳香活性成分[7]。鄭起帆等[8]通過(guò)研究不同山頭普洱生茶的差異代謝物,運(yùn)用1H-NMR(核磁共振)方法為普洱茶的品質(zhì)評(píng)價(jià)找到新思路。戴宇樵等[9]采用HPLC-MS(超高相液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù))探究云南大葉種“云抗10 號(hào)”曬青茶加工過(guò)程中代謝產(chǎn)物的變化,確定了影響曬青茶品質(zhì)形成的標(biāo)志性代謝物。

      保靖黃金茶產(chǎn)于湖南湘西,其內(nèi)含物質(zhì)豐富、氨基酸含量高,所制綠茶“香、綠、爽、濃”,紅茶則“湯色紅艷、香高味濃”[10?11]。目前,關(guān)于黃金茶工夫紅茶的各方面研究都相對(duì)較少,探究其品質(zhì)形成原因的研究更為稀少?;诖?,本研究采用黃金茶為原料制作成工夫紅茶,利用代謝組學(xué)的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LCMS/MS)探究其發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)物的變化,以期為湖南工夫紅茶加工過(guò)程中的品質(zhì)調(diào)控提供理論參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      鮮葉原料 均采自湖南湘西妙古金茶葉公司茶園,品種為保靖黃金茶,原料等級(jí)為一芽二葉,采摘時(shí)間為2020 年8 月上旬;甲醇、醋酸銨 色譜級(jí),Thermo 公司;水 Merck 公司;甲酸 Fisher 公司。

      Q Exactive? HF-X 質(zhì)譜儀、Vanquish UHPLC色譜儀 Thermo 公司; Hypesil Gold column C18(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)色譜柱 Thermo Fisher 公司;D3024R 低溫離心機(jī) Scilogex 公司;涼青架、涼青篩、55 型揉捻機(jī) 福建佳友公司;鏈板式烘干機(jī) 四川省農(nóng)副產(chǎn)品加工技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 樣品加工工藝 萎凋:準(zhǔn)確稱取25 kg 鮮葉,進(jìn)行室內(nèi)萎凋(鮮葉薄攤2~3 cm,平均氣溫20 ℃);揉捻:待萎凋至鮮葉含水量為62%~63%時(shí),將萎凋葉轉(zhuǎn)入55 型揉捻機(jī)進(jìn)行揉捻(不加壓5 min、輕壓10 min、重壓10 min、輕壓5 min、重壓10 min、輕壓5 min);發(fā)酵:將揉捻葉轉(zhuǎn)入發(fā)酵室進(jìn)行發(fā)酵(環(huán)境溫度28 ℃、相對(duì)濕度90%以上,發(fā)酵4 h);干燥:發(fā)酵后,采用鏈板式烘干機(jī)進(jìn)行干燥(毛火溫度120 ℃、足火溫度100 ℃,干燥至成品茶含水量為4%~5%止)。取樣:工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中,于發(fā)酵0、2、4 h 分別取樣,記為FJ0h、FJ2h、FJ4h;隨后將樣品迅速用液氮固定、置于-80 ℃儲(chǔ)存待進(jìn)一步分析。每組樣品包含3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

      1.2.2 代謝物提取 取100 mg 液氮研磨的組織樣本,置于EP 管中,加入500 μL 含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液,渦旋振蕩,冰浴靜置5 min,15000 r/min、4 ℃離心10 min,取一定量的上清液加質(zhì)譜級(jí)水稀釋至甲醇含量為53%,并置于離心管中,15000 r/min、4 ℃離心10 min,收集上清液,進(jìn)樣LC-MS 進(jìn)行分析[12]。

      質(zhì)控(QC)樣本:每組待測(cè)樣本中的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品分別取等體積的樣本混勻制成QC 樣本,每組茶葉樣品均獨(dú)立制備質(zhì)控樣品,用于平衡色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)和監(jiān)測(cè)儀器狀態(tài),在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)系統(tǒng)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

      空白(blank)樣本:含0.1%甲酸的53%甲醇水溶液代替實(shí)驗(yàn)樣本,前處理過(guò)程與實(shí)驗(yàn)樣本相同,主要用于去除背景離子。

      1.2.3 色譜條件 色譜柱:Hypesil Gold column C18(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)、柱溫:40 ℃、流速:0.2 mL/min、正離子模式:流動(dòng)相A:0.1%甲酸、流動(dòng)相B:甲醇;負(fù)離子模式:流動(dòng)相A:5 mol/L 醋酸銨,pH9.0;流動(dòng)相B:甲醇,洗脫條件如表1 所示。

      表1 色譜梯度洗脫程序Table 1 Chromatographic gradient elution procedure

      1.2.4 質(zhì)譜條件 掃描范圍選擇m/z 70~1050;ESI 源的設(shè)置如下:噴霧電壓:3.2 kV;鞘層氣體流速:40 arb;輔助氣體流量率:10 arb;毛細(xì)管溫度:320 ℃;極性:正,負(fù);MS/MS,二級(jí)掃描為數(shù)據(jù)相關(guān)掃描。

      1.3 數(shù)據(jù)處理

      下機(jī)原始數(shù)據(jù)使用CD3.1 軟件根據(jù)保留時(shí)間、質(zhì)荷比等參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。對(duì)于不同樣本,根據(jù)保留時(shí)間偏差和質(zhì)量偏差(Part per million, ppm)進(jìn)行峰對(duì)齊;隨后根據(jù)設(shè)置的ppm、信噪比(Signal-tonoise ratio, S/N)、加合離子等信息進(jìn)行峰提取,并對(duì)峰面積進(jìn)行定量。然后比對(duì)高分辨二級(jí)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)mzCloud、mzVault 以及MassList 一級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索(數(shù)據(jù)庫(kù)由北京諾禾致源生物科技股份有限公司提供),進(jìn)行代謝物鑒定。用Blank 樣本去除背景離子,并對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化,最后得到數(shù)據(jù)的鑒定和定量結(jié)果。保留QC 樣本中變異系數(shù)(Coefficient of Variance, CV)小于30%的代謝物作為最終的鑒定結(jié)果,進(jìn)行后續(xù)分析[13]。主成分分析采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)分析采用Excel 2019 及SPSS 22.0 軟件,熱圖繪制使用TBtools 軟件。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 主成分分析

      以三個(gè)樣品組(正離子模式和負(fù)離子模式檢測(cè)結(jié)果合并)的代謝物進(jìn)行主成分分析,根據(jù)離散度分析樣品重復(fù)性及差異性,判斷儀器穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)有效性。若樣品離散度小,則儀器穩(wěn)定,檢測(cè)結(jié)果可靠。如圖1 所示,三個(gè)樣品組明顯分開(kāi),插入的QC 樣本可以很好的重疊,說(shuō)明儀器具有較好的穩(wěn)定性。且樣品組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)樣品離散度小,表明生物學(xué)重復(fù)樣品的重復(fù)性好,具有代表性,為后續(xù)代謝物分析結(jié)果的準(zhǔn)確提供了依據(jù)。另外,由圖1 可知,工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中代謝物逐漸變化。發(fā)酵0 h 樣品與發(fā)酵2、4 h 樣品距離較遠(yuǎn),而發(fā)酵2 h 與發(fā)酵4 h 樣品組較為接近。由此可見(jiàn),發(fā)酵前期物質(zhì)變化明顯,提示發(fā)酵前期是工夫紅茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵階段。

      圖1 工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中代謝物主成分分析得分圖Fig.1 Principal component analysis scores of metabolites during the congou black tea fermentation

      2.2 差異代謝物分析

      本次實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到1415 種代謝物(正離子模式和負(fù)離子模式檢測(cè)結(jié)果合并),參考岳文杰等[14]、Yue 等[15]的數(shù)據(jù)處理方法,利用SPSS 軟件,以1415個(gè)代謝物的響應(yīng)強(qiáng)度(峰面積)為指標(biāo),進(jìn)行單因素方差分析,以獲得每個(gè)代謝物的P值,并以P<0.05(Bonferroni 校正)篩選工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中的差異代謝物,共篩選到493 個(gè)差異代謝物。對(duì)獲得的所有差異代謝物進(jìn)行層次聚類分析,這些差異代謝物在發(fā)酵過(guò)程中的變化規(guī)律如圖2 所示。在發(fā)酵過(guò)程中,493 個(gè)差異代謝物的含量變化趨勢(shì)主要分為四個(gè)類型:第一類呈現(xiàn)“較高→高→較低”的變化趨勢(shì),這類代謝物在發(fā)酵前期含量較高,隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸降低;第二類呈現(xiàn)“較高→低→較低”的變化趨勢(shì),在發(fā)酵前期的含量最高,而隨著發(fā)酵的進(jìn)行,含量不斷下降,特別是發(fā)酵至4 h 時(shí),含量出現(xiàn)比較明顯的下降趨勢(shì);第三類呈現(xiàn)“較低→高→較高”的變化趨勢(shì),這類代謝物在發(fā)酵前期的含量低,而發(fā)酵至2 h 時(shí)含量明顯上升,直至發(fā)酵結(jié)束;第四類呈現(xiàn)“較低→低→較高”的變化趨勢(shì),這類代謝物直至發(fā)酵后期,即發(fā)酵至4 h,含量才明顯上升。此外還對(duì)兩組間的差異代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,如表2 所示。結(jié)果顯示,F(xiàn)J2 h vs FJ0 h、FJ4 h vs FJ0 h、FJ4 h vs FJ2 h 分別篩選到206、482、112 個(gè)差異代謝物,其中上調(diào)表達(dá)的分別有175、368、81 個(gè),下調(diào)表達(dá)的分別有31、114、31 個(gè)。綜上所述,工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中,差異代謝物變化趨勢(shì)明顯,且發(fā)酵過(guò)程中上調(diào)的差異代謝物數(shù)量均大于下調(diào)的差異代謝物數(shù)量;發(fā)酵2 h 后代謝物明顯差異于發(fā)酵0 h;發(fā)酵前期差異代謝物數(shù)量多于發(fā)酵后期,物質(zhì)代謝更加活躍。

      表2 各組間代謝物差異篩選結(jié)果Table 2 Screening results of metabolite differences among groups

      圖2 工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中總差異代謝物的變化熱圖Fig.2 Heat map of changes in total differential metabolites during the fermentation of congou black tea

      2.3 不同類別差異代謝物的鑒定與分析

      以上述493 種差異代謝物進(jìn)行定性分析,共鑒定到90 個(gè)代謝物,包括15 種兒茶素及其聚合物、22 種氨基酸、10 種有機(jī)酸、3 種核苷、20 種黃酮醇及其糖苷、12 種生物堿、8 種可溶性糖。

      2.3.1 兒茶素及其聚合物類物質(zhì)的變化分析 如圖3 所示,15 種鑒定到的具有差異變化的兒茶素及其聚合物:(-)-EGC((-)-Epigallocatechin)、CG(Catechin gallate)、(-)-EGCG((-)-Epigallocatechin gallate)、EC(Epicatechin)、ECG(Epicatechin-3-Ogallate)、ETFGg(Epitheaflagallin 3-O-gallate)、(-)-GC((-)-Gallocatechin)、C(Catechin)、(-)-CG((-)-Catechin Gallate)、EGC(Epigallocatechin)、茶黃素-3,3'-雙沒(méi)食子酸酯(Theaflavine-3,3-digallate)、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯(Theaflavin monogallate)、原花青素A2(Procyanidin A2)、原花青素B2(Procyanidin B2)、原花青素B1(Procyanidin B1)。在發(fā)酵過(guò)程中,這15 種物質(zhì)表現(xiàn)為兩種變化趨勢(shì),第一種:兒茶素類與原花青素類物質(zhì)呈明顯下調(diào)趨勢(shì);第二種:茶黃素類物質(zhì)呈顯著上調(diào)趨勢(shì),這與前人的研究結(jié)果一致[16?18]。茶黃素是紅茶特有的代謝物,對(duì)紅茶茶湯滋味和色澤品質(zhì)起著決定性的作用,在紅茶發(fā)酵時(shí),兒茶素與酶結(jié)合發(fā)生酶促氧化生成大量茶黃素類物質(zhì)[19],故在此過(guò)程中可觀察到兒茶素類物質(zhì)的大幅度下降以及茶黃素類物質(zhì)的明顯增加。原花青素是以兒茶素單體為結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的一種二聚體化合物,廣泛存在于自然界的眾多植物中。茶葉不同的加工方式會(huì)導(dǎo)致其含量發(fā)生明顯變化,其中以綠茶中原花青素含量最高,紅茶和黑茶最低[20?22],表明原花青素含量隨茶葉的發(fā)酵程度的加深而減少,這在本實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。原花青素含量在紅茶發(fā)酵過(guò)程中逐漸降低,初步推斷可能是原花青素在紅茶發(fā)酵環(huán)境下發(fā)生了氧化導(dǎo)致其含量下降,但其氧化機(jī)理有待進(jìn)一步解析。

      圖3 工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中兒茶素及其聚合物的變化Fig.3 Changes of catechins and their polymers during the fermentation of congou black tea

      2.3.2 氨基酸類物質(zhì)的變化分析 氨基酸作為茶葉中重要的化學(xué)成分,與茶葉的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值密切相關(guān)。目前,從茶葉中已鑒定出的氨基酸共有26 種。按照滋味特征劃分,茶葉中的氨基酸主要包括鮮甜的茶氨酸,鮮酸的谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺,甜味的甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸,苦味的精氨酸[23?24]。其中茶氨酸是茶葉中含量最高的氨基酸,也是茶葉的特有成分[25]。茶葉的風(fēng)味口感主要由谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸等鮮味和鮮爽類的氨基酸決定[26]。此外,高溫條件下氨基酸可脫水釋放烘烤香,也可在高溫低濕條件下與糖類發(fā)生美拉德反應(yīng),產(chǎn)生焦糖香[23]。

      如圖4 所示,在發(fā)酵工序中,鑒定到的22 種差異表達(dá)的氨基酸,除L-蘇氨酸呈現(xiàn)波動(dòng)變化外,其余氨基酸都呈極顯著變化,產(chǎn)生大幅度下調(diào),這與從前關(guān)于氨基酸變化規(guī)律的研究結(jié)果相似[27?28]。有研究指出,紅茶加工過(guò)程中,氨基酸含量的下降可能是由于其轉(zhuǎn)化成了其他物質(zhì),并認(rèn)為有兩種可能的途徑可以將游離氨基酸轉(zhuǎn)化為茶葉香氣化合物或揮發(fā)性化合物。一是氨基酸與兒茶素氧化產(chǎn)物—鄰醌結(jié)合,二是一些氨基酸,如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸等,部分轉(zhuǎn)化為醛、醇等物質(zhì)[27,29?30]。

      圖4 工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中氨基酸類物質(zhì)的變化Fig.4 Changes of amino acids during the fermentation of congou black tea

      2.3.3 黃酮醇及其糖苷類物質(zhì)的變化分析 黃酮類化合物是茶葉中一類低分子量的酚類化合物,分為黃酮、黃酮醇。紅茶中的黃酮類物質(zhì)主要是異黃酮、黃烷酮和黃酮醇等[31]。大多數(shù)情況下,黃酮醇常與糖結(jié)合成糖苷以碳糖基的形式存在,茶葉中黃酮醇類主要以槲皮素(苷)和山奈素(苷)和楊梅素(苷)的形式存在[32?33]。據(jù)報(bào)道,在紅茶茶湯中,除了兒茶素外,一系列的黃酮-3-醇吡喃糖苷也是影響紅茶口感的重要因素[34?35]。這類黃酮-3-醇苷在極低的閾值濃度下不僅能產(chǎn)生天鵝絨般的苦澀感,還能通過(guò)增強(qiáng)咖啡堿的苦味強(qiáng)度促進(jìn)紅茶茶湯的苦味。

      如圖5 所示在本研究的工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程樣中共鑒定到20 種差異表達(dá)的黃酮及其糖苷物質(zhì),包括15 種黃酮醇:車前草苷、蕓香柚皮苷、新橙皮苷二氫查爾酮、高麗槐素、槲皮素、異鼠李素、二氫槲皮素、異丹葉大黃素、二氫楊梅素、楊梅素、異甘草苷、山奈酚、橙皮素、矢車菊素、熊果苷;5 種黃酮醇糖苷:楊梅素3-O-β-D-半乳糖苷、花青素鼠李葡糖苷、槲皮素-3-D-木糖甙、槲皮素-3,4’-O-D-β-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷。工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中,這20 種物質(zhì)的變化趨勢(shì)分為三種類型,第一類:發(fā)酵2 h 后下調(diào)表達(dá)(二氫槲皮素、二氫楊梅素、楊梅素、異甘草苷、矢車菊素、楊梅素3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-D-木糖甙、槲皮素-3,4’-O-D-β-葡萄糖苷);第二類:發(fā)酵2 h 后上調(diào)表達(dá)(車前草苷、蕓香柚皮苷、新橙皮苷二氫查爾酮、高麗槐素、槲皮素、異丹葉大黃素、橙皮素、熊果苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷);第三類:發(fā)酵2 h 后上調(diào)表達(dá),發(fā)酵4 h 后下調(diào)表達(dá)(異鼠李素、山奈酚、花青素鼠李葡糖苷)。Guo 等[36]進(jìn)行了PPO+POD 處理黃酮糖苷的體外研究,驗(yàn)證了PPO、POD 能促進(jìn)茶葉中黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化,從而導(dǎo)致其含量的下降。但目前針對(duì)茶葉加工過(guò)程中黃酮醇及其糖苷物質(zhì)變化的研究較少,因此,對(duì)于工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中黃酮醇及其糖苷類物質(zhì)具體的變化機(jī)理還需做進(jìn)一步探索。

      圖5 工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中黃酮醇及其糖苷類物質(zhì)的變化Fig.5 Changes of Flavonols and their glycosides during the fermentation of congou black tea

      2.3.4 生物堿類物質(zhì)的變化分析 茶葉中的生物堿以嘌呤類為主,其中,含量最多的是咖啡堿(2%~5%)[37]??Х葔A是一種結(jié)構(gòu)為1,3,7-三甲基黃嘌呤的生物堿,是茶葉中重要的生物活性成分和呈味物質(zhì),一般茶葉品質(zhì)越好,咖啡堿含量越高[38]??Х葔A呈苦味,且閾值較低,據(jù)研究表明,多酚類物質(zhì)可增強(qiáng)其苦味強(qiáng)度,而氨基酸則能減弱其苦味強(qiáng)度[39]。茶湯中含有豐富復(fù)雜的化合物種類,既存在氨基酸,也包括多酚類物質(zhì),會(huì)對(duì)茶湯中咖啡堿的呈味產(chǎn)生綜合影響[40]。

      如圖6 所示本次研究共鑒定到12 種差異表達(dá)的生物堿,前人重點(diǎn)研究關(guān)注的咖啡堿、可可堿、茶堿也包括其中??Х葔A在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢(shì),而可可堿和茶堿則是表現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的變化趨勢(shì)。這與先前的研究結(jié)果略有出入,初步推斷,這可能與茶葉加工工藝及品種不同有關(guān)[41?42]。其余生物堿,除大麥芽新堿與山蠟梅堿外,均是上調(diào)表達(dá)。

      圖6 工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中生物堿類物質(zhì)的變化Fig.6 Changes of alkaloids during the fermentation of congou black tea

      2.3.5 其他類物質(zhì)的變化分析 此外,還鑒定到了10 種有機(jī)酸、3 種核苷以及8 種可溶性糖??扇苄蕴鞘遣枞~中主要的水溶性碳水化合物[43],其主要包括三類,可溶于水的單糖(果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、木酮糖和阿拉伯糖等)和雙糖(蔗糖、乳糖、麥芽糖、棉子糖等),以及不溶于水的多糖(淀粉、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠),單糖和雙糖均具有甜味[37],一定程度上能削弱茶湯的苦澀[44],是構(gòu)成茶湯甜醇滋味的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。在本實(shí)驗(yàn)中,D-阿拉伯糖、蔗糖、水蘇糖、纖維三糖、D(-)-來(lái)蘇糖、L(-)巖藻糖、D-木糖、D(-)-果糖是主要差異表達(dá)的可溶性糖類,且變化趨勢(shì)為總體上調(diào),這對(duì)工夫紅茶甜醇滋味的品質(zhì)形成具有重要意義。

      如圖7 所示10 種鑒定到的有機(jī)酸在工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中均上調(diào)表達(dá),3 種核苷在發(fā)酵2 h 時(shí)上調(diào)表達(dá),發(fā)酵4 h 后下調(diào)表達(dá)。有機(jī)酸是構(gòu)成茶葉香氣和滋味的主要成分之一,占茶葉干物質(zhì)總量的3%左右[45]。前人的研究表明,在紅茶加工中,有機(jī)酸代謝對(duì)于紅茶香氣的形成及轉(zhuǎn)化具有重要影響[46],基于此,猜測(cè)有機(jī)酸類物質(zhì)在發(fā)酵階段的上調(diào)表達(dá)有利于紅茶香氣物質(zhì)在加工后期的積累。

      圖7 工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中其他類物質(zhì)的變化Fig.7 Changes of other substances during the fermentation of congou black tea

      3 結(jié)論

      發(fā)酵是工夫紅茶加工過(guò)程中的關(guān)鍵工序,在發(fā)酵過(guò)程中,豐富的內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生著復(fù)雜的化學(xué)變化,為形成工夫紅茶特有的品質(zhì)特征奠定基礎(chǔ)[47]。前期的研究主要集中在工夫紅茶發(fā)酵工藝的改善及品質(zhì)化學(xué)分析方面,對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中眾多小分子代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律仍不清晰[48?49]。

      本實(shí)驗(yàn)采用基于代謝組學(xué)的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LCMS/MS)對(duì)工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中的代謝物進(jìn)行鑒定分析,實(shí)現(xiàn)了對(duì)發(fā)酵各個(gè)階段的明顯區(qū)分,同時(shí)發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵過(guò)程中,工夫紅茶的代謝物含量變化以發(fā)酵2 h 和發(fā)酵4 h 為時(shí)間節(jié)點(diǎn),分為發(fā)酵前期(0~2 h)和發(fā)酵后期(2~4 h)。在這兩個(gè)不同的發(fā)酵階段,上調(diào)的差異代謝物數(shù)量均大于下調(diào)的差異代謝物數(shù)量;發(fā)酵2 h 后代謝物明顯差異于發(fā)酵0 h;發(fā)酵前期差異代謝物數(shù)量多于發(fā)酵后期,物質(zhì)代謝更加活躍,暗示發(fā)酵前期是工夫紅茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵階段;此外,還對(duì)鑒定到的差異表達(dá)的代謝物進(jìn)行了分析鑒定,結(jié)果顯示,在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,呈澀味代謝物下調(diào)表達(dá),可溶性糖、茶黃素類呈甜醇、鮮爽滋味的代謝物明顯上調(diào)表達(dá)。綜上,此研究的分析結(jié)果不僅為探索發(fā)酵時(shí)間與滋味品質(zhì)形成的關(guān)系提供了理論依據(jù),同時(shí)也可以利用這些代謝物的變化規(guī)律為生產(chǎn)某些高含量成分的工夫紅茶產(chǎn)品提供參考,對(duì)湖南省工夫紅茶的生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義。但由于未采用精確定量的樣品檢測(cè)方法,且實(shí)驗(yàn)品種過(guò)于單一,本研究工作還存在許多不足。接下來(lái)應(yīng)采取絕對(duì)定量的方法以及選取豐富的紅茶適制品種進(jìn)行研究,以期能全面解析工夫紅茶發(fā)酵過(guò)程中具體物質(zhì)的變化機(jī)理。

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