王文靜,劉雪梅,張桂琴
(包頭市第四醫(yī)院,內(nèi)蒙古 包頭 014030)
慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD)是常見慢性呼吸道疾病,主要特征為氣流持續(xù)受限、肺功能下降,臨床表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難等。本病病程長(zhǎng),易反復(fù)發(fā)作,后期可引起慢性肺源性心臟病、呼吸衰竭等多種并發(fā)癥,嚴(yán)重危害人類生命健康[1]。氣道重塑是COPD的基本病理特征,是導(dǎo)致氣道狹窄及肺功能下降的重要因素[2]。目前臨床尚缺乏有效抑制氣道重塑的藥物,探索有效治療藥物對(duì)于延緩COPD進(jìn)展、抑制氣道重塑具有重要意義。紫蘇是常用傳統(tǒng)中藥,已有研究證實(shí),紫蘇在COPD中具有抗炎作用,可延緩疾病進(jìn)展[3]。紫蘇葉是紫蘇的重要藥用部位,含有豐富維生素和蛋白質(zhì),具有較高食用和保健價(jià)值[4]。多糖是紫蘇葉重要活性成分之一,目前關(guān)于其對(duì)COPD是否有效報(bào)道尚少。本研究通過建立COPD大鼠模型,擬探討紫蘇葉多糖對(duì)COPD的影響及可能作用機(jī)制,為臨床治療COPD提供實(shí)驗(yàn)參考。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠50只,體質(zhì)量200~220 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005。購(gòu)入后飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院,使用許可證號(hào):SYXK(蒙)2016-0004,保持溫度22~24℃,濕度50%~60%,明暗循環(huán)12 h/12 h,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,飼喂標(biāo)準(zhǔn)鼠糧及純凈水,大鼠自由采食飲水。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》,確保動(dòng)物福利倫理,經(jīng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審核批準(zhǔn),倫理審批號(hào):BT201800036。
1.2 藥物與試劑 紫蘇葉多糖(陜西斯諾特生物科技有限公司,純度:98%,批號(hào):2018112506);中南海牌過濾嘴香煙(北京卷煙廠,批號(hào):118204);無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族(wingless-type MMTV integration site family,Wnt)激動(dòng)劑氯化鋰(lithium chloride,LiCl)(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):213233);脂多糖(lip opolysacchari de,LPS)(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):L2280);大鼠白介素-8(interleukin-8,IL-8)ELISA試劑盒(批號(hào):SEKR-0071)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(批號(hào):YM-A7056)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司);兔抗大鼠Wnt5a抗體(批號(hào):ab227229)、ras同源蛋白A(ras-homologous A,RhoA)抗體(批號(hào):ab187027)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)抗體(批號(hào):ab126424)、p-JNK抗體(批號(hào):ab2074477)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)。
1.3 主要儀器FlexiVent動(dòng)物肺功能儀(加拿大SCIREQ公司);JJ-12J脫水機(jī)和JB-P5包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);RM2016病理切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司);BA210T顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);164-5056電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。
1.4 造模與分組 取40只大鼠,參照文獻(xiàn)[5],采用煙熏聯(lián)合氣管滴入LPS復(fù)合法建立COPD大鼠模型。煙熏方法:自制有機(jī)玻璃煙熏箱,四周留直徑約1.5 cm的排氣孔,燃燒12支香煙,每次約10 min,間隔2 h,再燃燒1次。氣管內(nèi)注入LPS:腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,頸部消毒,切開皮膚后分離皮下組織,暴露氣管,向氣管內(nèi)注入200 μL(1 μg/μL)LPS,注射完畢后使大鼠直立并左右旋轉(zhuǎn),使LPS均勻分散至肺中,縫合皮膚,消毒創(chuàng)口。分別于實(shí)驗(yàn)的第1天和第15天,氣管各注入1次LPS,其余時(shí)間每天將大鼠放入煙熏箱內(nèi)按上述方法進(jìn)行煙熏,共持續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)過程中,大鼠表現(xiàn)為精神萎靡,毛發(fā)無光澤并發(fā)生脫落,少動(dòng),呼吸急促,出現(xiàn)明顯咳嗽癥狀,表示造模成功,本實(shí)驗(yàn)所有大鼠均造模成功。造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、LiCl組、紫蘇葉多糖組、紫蘇葉多糖+LiCl組,每組10只。另取10只大鼠作為假手術(shù)組,采用相同方法暴露氣管,注入等量生理鹽水,不進(jìn)行煙熏。
1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 末次煙熏后24 h,LiCl組大鼠皮下注射LiCl,60 mg/kg,并灌胃生理鹽水;紫蘇葉多糖組大鼠皮下注射生理鹽水,并灌胃紫蘇葉多糖,20 mg/kg;紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠皮下注射LiCl,60 mg/kg,并灌胃紫蘇葉多糖,20 mg/kg;假手術(shù)組和模型組大鼠皮下注射并灌胃等量生理鹽水,1次/d,連續(xù)4周。
1.6 觀察指標(biāo)
1.6.1 肺功能 末次干預(yù)后2 h,麻醉大鼠,頸部備皮,暴露氣管,進(jìn)行氣管插管,采用肺功能儀檢測(cè)用力肺活量(forced vital capacity,F(xiàn)VC),1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second,F(xiàn)EV1),呼氣峰流速(peak expiratory flow,PEF)。
1.6.2 IL-8、TNF-α水平 肺功能檢測(cè)完畢后,隨機(jī)取5只大鼠,結(jié)扎右支氣管,用注射器抽取10 mL生理鹽水,分3次灌洗,30 s后緩慢回抽,收取肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),回收率>80%。1 500 r/min,4℃離心10 min,取上清,按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,使用酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-8、TNF-α水平。
1.6.3 肺組織學(xué)觀察 灌洗完畢后,脫頸椎處死大鼠,切取右肺組織,浸入4%多聚甲醛中進(jìn)行固定24 h,乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,切片(片厚4 μm),常規(guī)HE染色,透明、脫水、封片,光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,參照李佳藝等[6]的方法,測(cè)量視野長(zhǎng)度和寬度,計(jì)算視野面積,計(jì)數(shù)視野中肺泡總數(shù),計(jì)算平均肺泡數(shù)(mean alveolar number,MAN),MAN=肺泡總數(shù)/視野面積;標(biāo)記視野中央“十”字線的肺泡間隔數(shù),測(cè)量“十”字線長(zhǎng)度,計(jì)算肺泡平均間隔內(nèi)襯(mean linear intercept,MLI),MLI=“十”字線長(zhǎng)度/肺泡間隔數(shù)。
1.6.4 氣管壁及氣管平滑肌厚度 隨機(jī)選取每只大鼠HE切片中3個(gè)完整支氣管(直徑1 000~1 500 μm),使用Image圖像分析系統(tǒng)測(cè)定支氣管總面積、管腔面積、管壁內(nèi)周長(zhǎng)、平滑肌外側(cè)面積和平滑肌內(nèi)側(cè)面積,支氣管壁厚度=(支氣管總面積-管腔面積)/管壁內(nèi)周長(zhǎng),平滑肌厚度=(平滑肌外側(cè)面積-內(nèi)側(cè)面積)/管壁內(nèi)周長(zhǎng)。
1.6.5 肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白 各組剩余大鼠脫頸椎處死后,取肺保存于液氮中,取100 mg凍存肺組織提取總蛋白,并進(jìn)行定量,制備SDS-PAGE膠,蛋白上樣進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜,加入封閉液室溫封閉1 h,加一抗4℃孵育過夜,洗膜,加二抗室溫孵育2 h,ECL發(fā)光,顯影,Image軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以(s)表示,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠FVC、FEV1、PEF均降低(P<0.05);與模型組比較,LiCl組大鼠FVC、FEV1、PEF均降低,紫蘇葉多糖組大鼠FVC、FEV1、PEF均升高(P<0.05);紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠FVC、FEV1、PEF高于LiCl組(P<0.05),而低于紫蘇葉多糖組(P<0.05)。(見表1)
表1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較
表1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較
注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與LiCl組比較,cP<0.05;與紫蘇葉多糖組比較,dP<0.05
組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)FVC(mL)FEV1(mL) PEF(L/s)假手術(shù)組 10 - 10.36±0.65 5.13±0.15 35.52±1.59模型組 10 - 4.27±0.45a 2.09±0.09a 18.79±0.96a LiCl組 10 60 2.89±0.36b 1.65±0.08b 12.48±0.83b紫蘇葉多糖組 10 20 8.47±0.59b 4.21±0.13b 28.79±1.32b紫蘇葉多糖+LiCl組10 20+60 6.05±0.53c d 3.17±0.11c d 23.51±1.24c d F 333.782 434.076 531.774 P 0.000 0.000 0.000
2.2 各組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平均升高(P<0.05);與模型組比較,LiCl組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平均升高(P<0.05),紫蘇葉多糖組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平均降低(P<0.05);紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平低于LiCl組(P<0.05),而高于紫蘇葉多糖組(P<0.05)。(見表2)
表2 各組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平比較,ng/L)
表2 各組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平比較,ng/L)
注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與LiCl組比較,cP<0.05;與紫蘇葉多糖組比較,dP<0.05
組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)IL-8 TNF-α假手術(shù)組 5 - 254.13±26.42 265.46±13.49模型組 5 - 605.27±32.48a 365.79±18.16a LiCl組 5 60 687.61±33.51b 396.97±17.62b紫蘇葉多糖組 5 20 424.52±29.43b 303.58±14.79b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 538.91±31.46cd 331.62±15.67cd F 150.474 51.476 P 0.000 0.000
2.3 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化 肺部大體觀察:假手術(shù)組大鼠肺表面光滑,體積正常,無斑點(diǎn),呈粉紅色;模型組大鼠肺體積明顯增大,表面可見黑色斑點(diǎn),呈蒼白色;LiCl組大鼠肺大體觀察與模型組相似,表面黑色斑點(diǎn)較多,呈蒼白色;紫蘇葉多糖組大鼠肺體積較模型組略大,斑點(diǎn)較少,呈粉紅色;紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠肺表面斑點(diǎn)多于紫蘇葉多糖組,但少于模型組,體積較大,呈粉白色。(見圖1)
圖1 各組大鼠肺組織大體觀察
HE染色顯示,假手術(shù)組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常,肺泡腔未見擴(kuò)大,肺間隔未見增厚,未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);模型組大鼠肺泡腔擴(kuò)大,部分融合成肺大泡,肺泡壁增厚,可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);LiCl組大鼠肺組織病理變化與模型組相似,肺泡腔擴(kuò)大、斷裂、融合,肺間隔增厚,出現(xiàn)的大量炎癥細(xì)胞;紫蘇葉多糖組大鼠肺組織病變較模型組明顯改善,肺泡結(jié)構(gòu)大致正常,肺泡擴(kuò)張明顯減少,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少;紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠肺組織病變較模型組明顯改善,但較紫蘇葉多糖組肺泡擴(kuò)張嚴(yán)重,炎癥細(xì)胞增加。(見圖2)
圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化比較(HE,×200)
與假手術(shù)組比較,模型組大鼠MLI增加,而MAN減少(P<0.05);與模型組比較,LiCl組大鼠MLI增加,而MAN減少(P<0.05),紫蘇葉多糖組大鼠MLI減少,而MAN增加(P<0.05);與紫蘇葉多糖組比較,紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠MLI增加,而MAN減少(P<0.05)。(見表3)
表3 各組大鼠MLI、MAN比較
表3 各組大鼠MLI、MAN比較
注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與LiCl組比較,cP<0.05;與紫蘇葉多糖組比較,dP<0.05
組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)MLI(×10-6m)MAN(×106個(gè)/m2)假手術(shù)組 5 - 52.56±6.52 174.32±10.52模型組 5 - 102.49±8.96a 92.16±7.45a LiCl組 5 60 121.24±10.85b 76.85±7.16b紫蘇葉多糖組 5 20 71.23±8.15b 136.58±11.85b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 85.63±8.49cd 108.71±9.87cd F 46.969 81.875 P 0.000 0.000
2.4 各組大鼠支氣管壁及氣管平滑肌厚度比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度均增加(P<0.05);與模型組比較,LiCl組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度均增加(P<0.05),紫蘇葉多糖組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度均減?。≒<0.05);紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度低于LiCl組,而高于紫蘇葉多糖組(P<0.05)。(見表4)
表4 各組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度比較±s,μm2/μm)
表4 各組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度比較±s,μm2/μm)
注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與LiCl組比較,cP<0.05;與紫蘇葉多糖組比較,dP<0.05
組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)支氣管壁厚度 平滑肌厚度假手術(shù)組 5 - 18.26±1.35 11.47±1.13模型組 5 - 35.49±2.54a 24.56±1.87a LiCl組 5 60 43.76±3.32b 32.48±1.92b紫蘇葉多糖組 5 20 25.92±2.12b 14.39±1.26b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 29.96±2.35c d 19.65±1.49c d F 79.242 142.444 P 0.000 0.000
2.5 各組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白水平比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量均增加(P<0.05);與模型組比較,LiCl組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量均增加(P<0.05),紫蘇葉多糖組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量均減少(P<0.05);紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量低于LiCl組(P<0.05),而高于紫蘇葉多糖組(P<0.05)。5組大鼠肺組織JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見表5、圖3)
表5 各組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白水平比較
表5 各組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白水平比較
注:與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與LiCl組比較,cP<0.05;與紫蘇葉多糖組比較,dP<0.05
組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)Wnt5a RhoA JNK p-JNK假手術(shù)組 5 - 0.13±0.03 0.25±0.04 1.08±0.11 0.26±0.05模型組 5 - 0.81±0.07a 0.79±0.07a 1.03±0.10 0.82±0.08a LiCl組 5 60 1.26±0.08b 0.93±0.08b 1.05±0.13 0.95±0.08b紫蘇葉多糖組 5 20 0.43±0.05b 0.51±0.05b 1.06±0.11 0.56±0.06b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 0.70±0.06cd 0.68±0.06cd 1.02±0.12 0.69±0.07cd F 245.123 91.079 0.218 73.666 P 0.000 0.000 0.926 0.000
圖3 各組大鼠肺組織中Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)電泳圖
COPD與慢性炎癥有關(guān),反復(fù)慢性炎癥引起的氣道重塑是COPD進(jìn)展的關(guān)鍵病理因素,氣道重塑過程始終伴隨氣道炎癥[7]。吸入煙霧或其他有害顆粒,可激活COPD患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等釋放一系列炎癥介質(zhì),導(dǎo)致肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);氣道壁釋放各種細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)等損傷局部組織,并介導(dǎo)異常修復(fù)過程,引起氣道壁增厚、氣道平滑肌增生肥大、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等,發(fā)生氣道重塑,最終造成氣管管腔狹窄,進(jìn)行性氣流阻力增加[8-9]。本研究采用煙熏聯(lián)合LPS方法建立COPD大鼠模型,結(jié)果顯示,模型組大鼠肺體積增大,出現(xiàn)明顯斑點(diǎn),呈蒼白色,MLI增加,MAN減少,支氣管壁及氣管平滑肌厚度增加,表明COPD模型建立成功,符合氣道重塑病理改變。
減輕炎癥反應(yīng),防治氣道重塑,是延緩COPD進(jìn)展的關(guān)鍵。紫蘇葉具有止咳平喘、降氣化痰、潤(rùn)腸通便、理氣止痛等功效?,F(xiàn)代藥理學(xué)表明,紫蘇葉中含有黃酮類、多糖類、揮發(fā)油類等多種生物活性成分,具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[10]。PARK D D等[11]研究表明,紫蘇葉提取物可減輕TNF-α誘導(dǎo)的促炎反應(yīng),對(duì)小鼠結(jié)腸炎具有預(yù)防作用。有研究[12]顯示,紫蘇葉提取物可減輕LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究采用紫蘇葉多糖治療COPD大鼠,結(jié)果顯示大鼠肺功能有所提高,BALF中IL-8、TNF-α等炎癥因子水平下降,HE染色結(jié)果顯示肺泡結(jié)構(gòu)大致正常,肺泡擴(kuò)張明顯減少,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,MLI減少,MAN增加,支氣管壁厚度、平滑肌厚度減小,提示紫蘇葉多糖可抑制COPD大鼠炎癥反應(yīng),減輕氣道重塑,改善肺組織病理損傷。
Wnt信號(hào)通路異?;罨c呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),Wnt5a可激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路,引起機(jī)體炎癥反應(yīng)損傷氣道上皮[13]。平面細(xì)胞極性(planar cell polarity,PCP)途徑即Wnt/PCP途徑,是非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路之一,主要通過調(diào)節(jié)下游RhoA等表達(dá),激活JNK途徑,破壞組織形態(tài)[14]。RhoA是Wnt/PCP途徑中的關(guān)鍵蛋白,能夠通過細(xì)胞張力調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,與肺部血管重建有關(guān),其表達(dá)水平與慢性阻塞性肺疾病畸形加重期患者疾病嚴(yán)重程度成正相關(guān)[15]。JNK磷酸化進(jìn)入活化狀態(tài)后,可調(diào)節(jié)下游信號(hào)分子,參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等多種過程。已有研究證實(shí),Wnt/PCP通路在肺發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用,能參與肺氣腫、肺動(dòng)脈高壓等肺部疾病的發(fā)生[16-17]。為進(jìn)一步研究紫蘇葉多糖對(duì)COPD的作用機(jī)制,本研究使用Wnt通路激動(dòng)劑LiCl干預(yù)COPD大鼠,結(jié)果顯示LiCl組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量高于模型組,大鼠肺功能、炎癥因子水平、肺部病理變化及氣道重塑情況更嚴(yán)重,表明Wnt/PCP通路激活可促進(jìn)COPD進(jìn)展;本研究在使用紫蘇葉多糖治療的基礎(chǔ)上同時(shí)使用LiCl干預(yù),結(jié)果顯示,LiCl可抵消部分紫蘇葉多糖的改善作用。由此證實(shí),紫蘇葉多糖改善COPD氣道重塑,可能與抑制Wnt/PCP通路有關(guān)。
綜上所述,紫蘇葉多糖可抑制COPD大鼠炎癥反應(yīng),減輕氣道重塑,可能與抑制Wnt/PCP通路有關(guān)。