氧糖剝奪對(duì)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞NKG2D受體及其配體表達(dá)的影響*

劉琳 李晶瑩 曹麗麗 杜俊蓉

(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.成都大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610106)

小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞。在腦缺血發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速向損傷部位遷移，通過釋放炎性介質(zhì)加重神經(jīng)炎癥，進(jìn)一步加重缺血后的腦損傷[1-2]。大量研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活在腦缺血炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。但是，目前基于神經(jīng)炎癥的干預(yù)策略均未能實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。自然殺傷細(xì)胞活化受體(Natural killer group 2 member D，NKG2D)是C型凝集素樣受體NKG2家族的重要成員，主要表達(dá)于NK 細(xì)胞、NKT 細(xì)胞、CD8+αβT 及部分γδ T等多種免疫細(xì)胞[5-6]。NKG2D可識(shí)別多種配體，這些配體屬于主要組織相容性復(fù)合體I類分子相關(guān)蛋白(MHC-Ⅰ)以及另一類MHC-I類相關(guān)分子ULBP[7-8]。研究表明，NKG2D配體是參與各種炎癥反應(yīng)的應(yīng)激誘導(dǎo)分子[9]。感染或炎癥刺激上調(diào)NKG2D配體表達(dá)，與NKG2D結(jié)合后，通過接頭蛋白DAP10傳遞活化信號(hào)，激活下游PI3K和GRB2進(jìn)而引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)[10-11]。但是，目前尚未見NKG2D與腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的相關(guān)性報(bào)道。氧葡萄糖剝奪(Oxygen-glucose deprivation，OGD)是體外誘導(dǎo)缺血性損傷的常用模型[12]。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠海馬HT22 神經(jīng)元細(xì)胞OGD模型，進(jìn)一步檢測HT22-OGD上清刺激小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后NKG2D信號(hào)通路的變化和炎癥反應(yīng)，以探究NKG2D在腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞系、BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系(廣州吉妮歐生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、Cell Counting Kit-8試劑(Wako)，TNF-α小鼠ELISA 試劑盒(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)。iMark 酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，BDS200 倒置生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)，Micro Drop 超微量分光光度計(jì)(BIO-DL)，LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞OGD模型建立 HT22、BV2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。HT22細(xì)胞棄原培養(yǎng)加入無糖DMEM培養(yǎng)基，95%N2 和 5%CO2、37℃條件培養(yǎng)19小時(shí)，復(fù)氧復(fù)糖24小時(shí)后收集HT22上清(OGD conditioned medium, OGD CM)，正常條件下培養(yǎng)上清(Normal CM)作為對(duì)照組。將BV2細(xì)胞分為Model組和Control組，分別用 OGD CM和Normal CM進(jìn)行刺激。HT22、BV2細(xì)胞分別接種于96孔板，經(jīng)造模處理后，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)后于450 nm波長處測定吸光度(OD)值，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率：OD sample/OD control mean×100%。

1.2.2 ELISA法測定促炎因子含量 分別收集HT22神經(jīng)元細(xì)胞的Normal CM和OGD CM刺激BV2細(xì)胞后的培養(yǎng)基上清，3500r/min 離心15分鐘后收集上清，按照ELISA試劑盒說明書，檢測TNF-α含量。

1.2.3 qPCR測定NKG2D受體信號(hào)通路及炎癥產(chǎn)物的mRNA水平 采用Trizol試劑提取BV2細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后用于qPCR測定NKG2D、H60、MULT1、RAE-1、DAP10及炎癥產(chǎn)物TNF-α的mRNA水平表達(dá)量，并歸一化為GAPDH，使用 2-ΔΔCT方法來分析目的基因的 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)PCR引物序列[13-17]，見表1。

表1 定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 OGD對(duì)HT22以及OGD CM對(duì)BV2細(xì)胞活力的影響 與HT22-Control組相比，OGD 19小時(shí)后HT22-Model組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)，表明氧糖剝奪對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞造成明顯的損傷。與BV2-Control組相比，BV2-Model組細(xì)胞活力無明顯變化(P>0.05)，表明HT22 OGD CM不會(huì)對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的活性造成影響，見圖1。

圖1 OGD對(duì)HT22細(xì)胞以及OGD CM對(duì)BV2細(xì)胞活力的影響(n=6)

2.2 OGD CM誘導(dǎo)BV2細(xì)胞NKG2D受體信號(hào)通路表達(dá) qPCR法檢測OGD CM刺激BV2細(xì)胞后NKG2D信號(hào)通路的表達(dá)，相比BV2-Control組，BV2-Model組細(xì)胞NKG2D受體、配體H60以及接頭蛋白DAP10 mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.01)；而配體MULT1和RAE-1的表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)，見圖2。

圖2 OGD CM對(duì)BV2細(xì)胞NKG2D信號(hào)通路的影響(n=6)

2.3 OGD CM誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥因子的生成 qPCR法檢測OGD CM刺激BV2細(xì)胞后炎癥因子的表達(dá)，相比BV2-Control組，BV2-Model組TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)，見圖3。

圖3 OGD CM對(duì)BV2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響(n=6)

3 討論

腦卒中是世界范圍內(nèi)致死/致殘的疾病之一，其中缺血性腦卒中占絕大部分。缺血性腦卒中病理機(jī)制復(fù)雜，其中神經(jīng)炎癥在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在缺血性腦卒中初期，腦中常駐的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活、外周免疫細(xì)胞向缺血腦組織浸潤以及多種細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α等)產(chǎn)生，從而引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)[18-20]。研究表明，抑制腦缺血后神經(jīng)炎癥的發(fā)生，不僅能有效減輕腦缺血損傷，還能改善其預(yù)后[21]。

本實(shí)驗(yàn)建立小鼠海馬HT22神經(jīng)元細(xì)胞OGD模型，收集HT22上清刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，模擬體內(nèi)腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的相互作用狀態(tài)。結(jié)果顯示，與HT22-Control組比較，HT22-Model組細(xì)胞活性顯著降低，提示OGD造模成功。

NKG2D是一種免疫細(xì)胞表面的活性受體，可識(shí)別多種配體，研究發(fā)現(xiàn)小鼠NKG2D配體包括RAE-1、H60和MULT1[22]。NKG2D與其配體的相互作用是調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。在小鼠體內(nèi)NKG2D主要通過PI3K/STAT5和Syk/ZAP70兩條信號(hào)通路發(fā)揮效應(yīng)[10,23]。當(dāng)配體被識(shí)別時(shí)，含有NKG2D的NK細(xì)胞和T細(xì)胞被激活，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞的裂解或是觸發(fā)細(xì)胞因子和趨化因子(如干擾素-γ)的產(chǎn)生，以調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)[24]。有研究報(bào)道，NKG2D可在多種器官缺血性損傷炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Calabrese等[26]發(fā)現(xiàn)激活NK細(xì)胞表面NKG2D可加重肺缺血再灌注損傷，而阻斷NKG2D受體則可發(fā)揮保護(hù)作用。Feng等[26]報(bào)道，小鼠腎臟缺血再灌注可誘導(dǎo)NKG2D的配體RAE-1表達(dá)，從而激活NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞、加重腎損傷。本實(shí)驗(yàn)通過建立體外OGD模型探究BV2細(xì)胞中NKG2D信號(hào)通路的表達(dá)，結(jié)果表明BV2-Model組細(xì)胞NKG2D受體、配體H60、下游接頭蛋白DAP10的mRNA水平顯著增加。腦缺血發(fā)生后，炎性細(xì)胞因子的表達(dá)顯著增加。因此我們檢測了BV2-Model組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α的mRNA水平和蛋白水平，結(jié)果表明，TNF-α的mRNA水平和蛋白水平顯著上調(diào)。

4 結(jié)論

氧糖剝奪能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞H60/NKG2D/DAP10信號(hào)通路上調(diào)及炎癥因子產(chǎn)生，提示NKG2D信號(hào)通路可能在氧糖剝奪的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。