花冠閉合現(xiàn)象對(duì)高山植物喉毛花繁殖適合度的影響

安宇夢(mèng)，李先婷，王培正， 張嬋

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程受到多種環(huán)境因素的影響，植物的繁殖階段對(duì)外界環(huán)境變化尤為敏感[1].低溫脅迫、暴雨頻發(fā)是青藏高原及周邊高山地區(qū)的典型氣候特征[2]，惡劣的生境條件對(duì)植物的繁殖過(guò)程產(chǎn)生極大影響.低溫不僅限制高山生態(tài)系統(tǒng)中傳粉昆蟲的活動(dòng)能力，還影響受精后植物的胚胎發(fā)育過(guò)程，并最終影響果實(shí)和種子的發(fā)育和成熟[3]；雨水則直接沖刷花粉并降低花粉萌發(fā)率[4].因此，在青藏高原極端惡劣的生境條件下，高山植物進(jìn)化出一系列適應(yīng)性策略以保障繁殖成功，表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境高度特化的響應(yīng)[2].菊科的水母雪兔子(Saussureamedusa)和綿頭雪兔子(Saussurealaniceps)等棉毛植物的苞片上密布毛狀體，濃密絨毛具有吸熱和保溫作用的同時(shí)也可以防止雨水對(duì)繁殖器官造成傷害[4-5].蓼科的塔黃(Rheumnobile)和菊科的氈毛雪蓮(Saussureavelutina)等溫室植物花序外圍半透明的苞片可以起到保溫作用，有助于植物胚胎的早期發(fā)育，提高種子的產(chǎn)量[6-7].另外，一些植物在不同生活史階段采取相應(yīng)的進(jìn)化策略來(lái)適應(yīng)外部環(huán)境變化，例如茄科植物賽莨菪(Anisodusluridus)在花期時(shí)花梗向下彎曲，有效防止了雨水對(duì)花粉的沖刷；在果期時(shí)花梗直立，則可以使宿存花萼貯水；由于水具有維持溫度穩(wěn)定的作用，花萼貯水能夠有效促進(jìn)果實(shí)發(fā)育，提高種子數(shù)量和萌發(fā)率[8].

花冠閉合現(xiàn)象是高山植物應(yīng)對(duì)低溫多雨環(huán)境的又一獨(dú)特適應(yīng)機(jī)制[9].花冠閉合現(xiàn)象分為暫時(shí)性花冠閉合和永久性花冠閉合兩類.暫時(shí)性花冠閉合現(xiàn)象是指在夜晚或暴風(fēng)雨來(lái)臨前或者周圍環(huán)境溫度驟降時(shí)，植物花冠迅速閉合，當(dāng)天氣好轉(zhuǎn)或溫度回升后再重新開(kāi)放的現(xiàn)象，具有可逆性；而永久性花冠閉合現(xiàn)象是指植物花冠在完成授粉后永久閉合不再開(kāi)放的現(xiàn)象[5，10].兩種花冠閉合現(xiàn)象在龍膽科植物中均較為常見(jiàn)[11]，是龍膽科植物對(duì)低溫多雨高山環(huán)境的一種適應(yīng)性策略，但花冠閉合現(xiàn)象對(duì)植物雌雄繁殖適合度的影響及其適應(yīng)性意義的相關(guān)研究卻少有報(bào)道.本文以龍膽科一年生草本植物喉毛花(Comastomapulmonarium)為研究對(duì)象，測(cè)量花冠開(kāi)放和閉合過(guò)程中的環(huán)境溫度變化，觀測(cè)人工授粉對(duì)花冠開(kāi)合狀態(tài)的影響，并比較人為制止兩種花冠閉合現(xiàn)象后其雌雄繁殖適合度的變化情況，旨在探討喉毛花兩種花冠閉合現(xiàn)象的誘導(dǎo)機(jī)制，暫時(shí)性花冠閉合現(xiàn)象和永久性花冠閉合現(xiàn)象對(duì)喉毛花雌雄繁殖適合度的影響，以及喉毛花的花冠閉合現(xiàn)象對(duì)高山極端環(huán)境適應(yīng)性的意義.

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)

本研究于2016年7～8月在中國(guó)科學(xué)院海北高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)定位觀測(cè)站(下文簡(jiǎn)稱海北站)(N 37°29′～37°45′,E 101°12′～101°23′)開(kāi)展.海北站地處青藏高原東隅，祁連山北支冷龍嶺東段南麓的大通河河谷西段，海拔3 200～3 600 m.屬于典型的高原大陸性氣候，年平均氣溫-1.7 ℃，年極端最高氣溫27.6 ℃，極端最低氣溫-37.1 ℃，年內(nèi)沒(méi)有絕對(duì)無(wú)霜期.年平均降水量426～860 mm，且主要集中在5～9月.典型植被類型為以金露梅(Potentillafruticosa)為建群種的高寒灌叢草甸和以嵩草屬(Kobresia)植物為建群種的高寒嵩草草甸[12].

1.2 研究材料

喉毛花，龍膽科喉毛花屬一年生草本，分布在海拔3 000～4 800 m的高山地區(qū)，高5～30 cm.淡藍(lán)色花單生莖頂或枝頂，主花軸通常產(chǎn)生數(shù)個(gè)側(cè)枝.喉毛花的花冠呈管狀，裂片基部有一圈白色毛狀副冠.雄蕊5，著生于花冠筒上.果實(shí)為蒴果，種子小，微外露.海北站地區(qū)的喉毛花主要通過(guò)自交產(chǎn)生種子，并且存在嚴(yán)重的近交衰退現(xiàn)象[13].

1.3 研究方法

1.3.1 兩種花冠閉合現(xiàn)象的誘導(dǎo)機(jī)制

1.3.1.1 暫時(shí)性花冠閉合現(xiàn)象 在清晨花冠開(kāi)放和傍晚花冠閉合過(guò)程中，隨機(jī)標(biāo)記20朵喉毛花頂花，每5 min記錄一次花冠直徑并用手持式溫濕度記錄儀(OM-EL-USB-2-LCD,OMEGA,USA)測(cè)量花冠近旁氣溫，直至20朵頂花完全開(kāi)放或完全閉合.

1.3.1.2 永久性花冠閉合現(xiàn)象 隨機(jī)標(biāo)記40個(gè)植株，平均分為2組，在花蕾期對(duì)頂花進(jìn)行去雄，其中1組待柱頭張開(kāi)后人工授異花花粉，另外1組不授粉維持自然狀態(tài)，分別記錄兩組植株頂花的單花壽命.

1.3.2 兩種花冠閉合現(xiàn)象對(duì)喉毛花繁殖適合度的影響

1.3.2.1 發(fā)育胚珠數(shù)量、受精率 隨機(jī)選取并標(biāo)記60個(gè)植株的頂花花蕾，平均分為3組，一組待其頂花開(kāi)放后，用透明膠布粘貼固定其花瓣使之無(wú)法正常閉合，該處理目的為制止暫時(shí)性和永久性花冠閉合現(xiàn)象(T1)；第二組待其頂花自然授粉完成且花冠永久閉合后，將花瓣撥開(kāi)并用透明膠布固定以制止永久性花冠閉合現(xiàn)象(T2)；最后一組不作任何處理作為對(duì)照(CK).由于喉毛花的敗育種子在果實(shí)成熟時(shí)會(huì)消失而難以統(tǒng)計(jì)結(jié)籽率，但是其未受精的胚珠和受精胚珠可以清晰區(qū)分，因此該研究采用受精率代替結(jié)籽率.待開(kāi)花兩周后，取上述3組喉毛花的頂花，用解剖刀剖開(kāi)其子房，在體式顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)各子房?jī)?nèi)發(fā)育胚珠和未發(fā)育胚珠的數(shù)量，并計(jì)算受精率.

受精率=發(fā)育胚珠數(shù)/總胚珠數(shù)

1.3.2.2 種子數(shù)及百粒質(zhì)量 重復(fù)1.3.2.1中的3組處理，待各株的頂花果實(shí)發(fā)育成熟后，采集分裝在紙袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)種子數(shù)量.將各組種子自然干燥一個(gè)月后，用萬(wàn)分之一電子天平分別稱量其百粒質(zhì)量，重復(fù)20次.

1.3.2.3 種子萌發(fā)率 將1.3.2.2中稱量結(jié)束后的種子置于-20 ℃冰箱內(nèi)進(jìn)行一個(gè)月的春化處理，隨后在24 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行萌發(fā).將3組種子分別放置于表面被濕潤(rùn)濾紙包裹、直徑為6 cm的小培養(yǎng)皿上，每組重復(fù)3次.將每組的3個(gè)小培養(yǎng)皿放入直徑為15 cm、裝有少量蒸餾水的大培養(yǎng)皿中.每日兩次統(tǒng)計(jì)每個(gè)小培養(yǎng)皿上萌發(fā)的種子數(shù)量(當(dāng)胚根長(zhǎng)度大于0.5 mm時(shí)即視為萌發(fā))，注意將發(fā)霉種子移出培養(yǎng)皿并記錄數(shù)量，同時(shí)適時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分以保持濾紙濕潤(rùn).記錄持續(xù)進(jìn)行到連續(xù)5 d沒(méi)有新的種子萌發(fā)為止，最后計(jì)算每個(gè)小培養(yǎng)皿上的種子萌發(fā)率.

種子萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)量/總種子數(shù)量

1.3.2.4 剩余花粉數(shù)量 重復(fù)1.3.2.1中的3組處理.由于喉毛花的雄蕊先熟，單花花期為4～5 d，散粉期為2～3 d，在各植株頂花開(kāi)始散粉后注意觀察，若標(biāo)記植株的頂花在其花期第2天18∶00前經(jīng)歷1 h以上的較強(qiáng)降雨(即花藥經(jīng)歷了雨水沖刷)，則用鑷子摘取全部5枚雄蕊，統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)量以檢驗(yàn)兩種花冠閉合現(xiàn)象在削弱雨水對(duì)花粉沖刷過(guò)程中的作用.若標(biāo)記植株未經(jīng)歷雨水沖刷，則重新標(biāo)記新的頂花花蕾并重復(fù)1.3.2.1中的3組處理方法，直至所有用于統(tǒng)計(jì)剩余花粉數(shù)量的頂花在開(kāi)始散粉后均已經(jīng)歷降雨過(guò)程.將各處理中所取的雄蕊分別置于1 mL FAA固定液(福爾馬林∶乙酸∶95%乙醇體積比 5∶5∶90)中，依據(jù)Dafni[14]的方法，加入少量混合試劑(50%乙醇加入適量洗滌劑充分混勻)定容至2 mL，充分震蕩搖勻，使剩余花粉粒均勻分散在溶液中，用微量移液器吸取5 μL置于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)每滴溶液中的花粉數(shù)量，重復(fù)計(jì)數(shù)10次，按比例計(jì)算每朵花的剩余花粉數(shù)量.

1.3.2.5 花粉萌發(fā)率 選取50個(gè)正在散粉的喉毛花頂花，每朵隨機(jī)摘取1枚正在散粉的新鮮花藥，平均分為兩組，將其中一組25枚花藥分別置于裝有10%蔗糖溶液(常用于花粉體外萌發(fā)，接近于自然狀態(tài)下的花粉萌發(fā)環(huán)境[15])的離心管中；另外一組25枚花藥分別置于裝有蒸餾水的離心管中.兩組花粉各自萌發(fā)8 h后，在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，以檢測(cè)雨水浸泡對(duì)花粉萌發(fā)率的影響，當(dāng)花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑即視為萌發(fā)，最后計(jì)算花粉萌發(fā)率.

花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)量/總花粉數(shù)量

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0 for Windows軟件進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤的計(jì)算，用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD Post-hoc比較制止暫時(shí)性花冠閉合、制止永久性花冠閉合以及對(duì)照3組數(shù)據(jù)之間的差異性；用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較人工授粉與否對(duì)喉毛花單花壽命的影響，以及喉毛花在蔗糖溶液和蒸餾水中花粉萌發(fā)率之間的差異性.

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種花冠閉合現(xiàn)象的誘導(dǎo)機(jī)制

在花冠開(kāi)放和花冠閉合過(guò)程中，喉毛花的花冠直徑與近旁氣溫呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01,圖1)，說(shuō)明喉毛花暫時(shí)性花冠閉合現(xiàn)象受低溫誘導(dǎo).人工授粉處理組的單花壽命顯著低于自然狀態(tài)下的未授粉組(t=6.846,P<0.01,表1)，說(shuō)明授粉因素誘導(dǎo)喉毛花發(fā)生永久性花冠閉合.

表1 授粉對(duì)單花壽命的影響

圖1 花冠直徑與近旁溫度的回歸關(guān)系

2.2 兩種花冠閉合現(xiàn)象對(duì)繁殖適合度的影響

制止暫時(shí)性和永久性花冠閉合現(xiàn)象的T1處理組中受精率(P<0.01)、種子數(shù)量(P<0.01)、種子百粒質(zhì)量(P<0.01)、種子萌發(fā)率(P<0.01)和剩余花粉數(shù)量(P<0.01)均較對(duì)照(CK)顯著降低，而發(fā)育胚珠數(shù)在兩組間無(wú)顯著差異(P=0.221,表2).

制止永久性花冠閉合現(xiàn)象的T2處理組與對(duì)照(CK)相比，種子百粒質(zhì)量(P<0.01)和種子萌發(fā)率(P<0.01)顯著降低，而發(fā)育胚珠數(shù)(P=0.867)、受精率(P=0.581)、種子數(shù)量(P=0.492)和剩余花粉數(shù)量(P=0.446)與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(表2).另外，T1處理組中受精率(P<0.01)、種子數(shù)量(P<0.01)和剩余花粉數(shù)量(P<0.01)均顯著低于T2處理組(表2).

表2 花冠閉合現(xiàn)象對(duì)繁殖適合度的影響

在蒸餾水中浸泡萌發(fā)8 h后的花粉萌發(fā)率顯著低于在接近自然萌發(fā)環(huán)境的10%蔗糖溶液中浸泡萌發(fā)相同時(shí)間的花粉萌發(fā)率(t=30.67,P<0.01)(表 3).

表3 水浸泡對(duì)花粉萌發(fā)率的影響

3 討論

喉毛花的暫時(shí)性花冠閉合現(xiàn)象除影響剩余花粉數(shù)量及其雄性繁殖適合度，同時(shí)也通過(guò)影響種子數(shù)量影響其雌性繁殖適合度.制止暫時(shí)性花冠閉合現(xiàn)象后，喉毛花的剩余花粉數(shù)量減少，受精率降低，并最終引起種子數(shù)量減少.首先，由于缺少閉合花冠的保護(hù)作用，雨水會(huì)沖刷掉花藥和柱頭上落下的花粉，造成花粉的損失[8].另外，雨水的長(zhǎng)時(shí)間浸泡會(huì)使花粉粒吸水脹破失去活性，從而降低花粉質(zhì)量[9，16-17].

本研究中喉毛花的花粉在蒸餾水中浸泡后，其萌發(fā)率顯著低于浸泡在接近花粉萌發(fā)環(huán)境的10%的蔗糖溶液，這表明雨水浸泡影響花粉質(zhì)量.雨水對(duì)花粉數(shù)量和質(zhì)量的影響不僅會(huì)降低植物的雄性繁殖適合度，還會(huì)進(jìn)一步造成胚珠受精率的降低以及種子數(shù)量的減少，從而影響雌性繁殖適合度[18].前人也有研究證實(shí)了暫時(shí)性花冠閉合現(xiàn)象對(duì)龍膽科高山龍膽(Gentianaalgida)和麻花艽(Gentianastraminea)雌雄繁殖適合度的影響[9，19].青藏高原地區(qū)降雨集中發(fā)生于7月和8月，而此時(shí)正值喉毛花的盛花期，暴雨來(lái)臨前往往伴隨著周圍環(huán)境溫度的驟降，因此，這種低溫誘導(dǎo)的暫時(shí)性花冠閉合現(xiàn)象是喉毛花對(duì)該地區(qū)夏季頻發(fā)暴雨的一種適應(yīng)機(jī)制，能夠有效保護(hù)雌雄配子免受雨水的損害，提高喉毛花的雌雄繁殖適合度.

授粉因素誘導(dǎo)喉毛花發(fā)生永久性花冠閉合，人工授粉后單花壽命顯著縮短.以往的研究也表明，柱頭接受花粉后，植物的花壽命會(huì)顯著縮短[20-21].一種解釋是授粉后花壽命縮短受花粉提供者主導(dǎo)，花粉到達(dá)柱頭后就會(huì)排斥后來(lái)花粉，從而獨(dú)占受精的機(jī)會(huì)，授粉后植物組織內(nèi)產(chǎn)生乙烯，誘導(dǎo)花的萎蔫，縮短花壽命，從而在與其他花粉的父權(quán)競(jìng)爭(zhēng)中取得優(yōu)勢(shì)[22-25]；另一種解釋是授粉誘導(dǎo)的永久性花冠閉合降低了蒸騰作用引起的水分損失[26]以及花的呼吸作用[27]和花蜜生產(chǎn)[28]等資源消耗，這對(duì)于在高山極端生境下減少維持花冠開(kāi)放的資源消耗具有重要意義.永久性花冠閉合現(xiàn)象對(duì)喉毛花的雌性繁殖適合度具有重要影響，制止永久性花冠閉合現(xiàn)象后，喉毛花的種子百粒質(zhì)量和萌發(fā)率顯著降低.首先，永久性花冠閉合保護(hù)子房避免植食者啃食[19]，更為重要的是，青藏高原地區(qū)晝夜氣溫波動(dòng)較大且生長(zhǎng)季短暫，花冠永久性閉合可以保護(hù)生殖器官免受低溫傷害，使子房?jī)?nèi)部溫度趨于穩(wěn)定，促進(jìn)花粉管的伸長(zhǎng)，加速受精胚珠的生長(zhǎng)，為種子在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)育成熟提供保障，這對(duì)于種群后期開(kāi)放的花尤為重要[9-10，19，29].

在生長(zhǎng)季晝夜溫差波動(dòng)大，夏季暴雨頻發(fā)的高山地區(qū)，溫度、降水等非生物因素在高山植物花部特征演化中發(fā)揮著重要作用[30].喉毛花的花冠閉合現(xiàn)象是應(yīng)對(duì)高山地區(qū)惡劣生境和極端氣候條件的一種適應(yīng)性進(jìn)化策略.喉毛花的兩種花冠閉合現(xiàn)象在誘導(dǎo)機(jī)制以及對(duì)繁殖適合度的影響方面均存在差異，暫時(shí)性花冠閉合現(xiàn)象受低溫誘導(dǎo)，而永久性花冠閉合現(xiàn)象受到授粉因素的影響；暫時(shí)性花冠閉合現(xiàn)象通過(guò)影響花粉數(shù)量和質(zhì)量進(jìn)而影響種子數(shù)量，而永久性花冠閉合現(xiàn)象通過(guò)影響授粉后胚胎發(fā)育過(guò)程影響種子質(zhì)量，兩種花冠閉合機(jī)制共同影響喉毛花的雌雄繁殖適合度.龍膽科植物中普遍存在的花冠閉合現(xiàn)象是自然界長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果，是龍膽科植物能夠廣布于高山地區(qū)，對(duì)嚴(yán)酷的高山環(huán)境具有極強(qiáng)適應(yīng)能力的原因之一.