王鑫鑫，蘇世平，李毅，馬彥軍，扁紅英

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

一般情況下，在自然條件下種子老化需要花費大量的時間，但是人工老化技術(shù)則能夠很好地模擬種子在自然狀況下的老化和劣變過程，所以很多研究者采用人工老化的處理方法對種子的生理生化和遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)進行研究[1].

人工老化種子的方法最早由 Roderts E H 等[2]提出，稱人工加速種子老化法，即種子在高溫高濕的環(huán)境下，活力不斷降低乃至最后喪失壽命.國內(nèi)外許多學(xué)者對老化條件下種子活力及生理特性的變化做了諸多研究，以期在生理層面揭示種子活力下降的原因，進而探討延緩種子老化的技術(shù)措施[3].Kim等[4]在對紅松種子長期貯藏過程中發(fā)現(xiàn)，老化處理后種子的丙二醛含量比對照種子高出21倍.Bhanuprakash等[5]在對洋蔥的老化種子生理生化研究中發(fā)現(xiàn)，老化處理后的種子丙二醛含量比對照組增加26.2%.王鶴冰等[6]、高華偉等[7]通過對芥菜、大豆種子進行老化處理發(fā)現(xiàn)，老化處理均不同程度地降低了種子發(fā)芽率、種子活力、平均發(fā)芽時間，在萌發(fā)過程中對逆境條件的適應(yīng)性減弱，對不良環(huán)境的耐受力降低.韓熠等[8]以高粱吉雜127和吉雜355為試材，人工老化處理下對高粱種子生理特性研究表明，老化處理能顯著降低氧化還原酶活性和蛋白質(zhì)代謝能力、同時脂質(zhì)過氧化作用加劇等.姚俠妹等[9]在高溫(40 ℃)、相對濕度95%的條件下，通過對桔梗種子在不同時間的研究中發(fā)現(xiàn)，桔梗種子細胞膜受損，抗逆性物質(zhì)脯氨酸含量增加，造成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累和保護酶系統(tǒng)受到破壞，致使種子活力喪失.雷雄等[10]在對西伯利亞龍須草(SiberianWildrye)的研究中同樣也發(fā)現(xiàn)，衰老處理嚴重破壞了包括碳水化合物代謝、脂肪代謝和抗氧化活性在內(nèi)的一系列關(guān)鍵途徑.因此，人工控制植物種子老化可以為模擬自然老化過程中種子活力的變化提供可靠的理論依據(jù).

紅砂(Reaumuriasoongorica)隸屬于檉柳科(Tamaricaceae)紅砂屬(ReaumuriaLinn.)，以紅砂為建群種或優(yōu)勢種的植被群落是我國溫帶荒漠的主要植被類型之一[11].紅砂具有很強的抗旱、耐鹽和集沙能力[12-13]，對維護荒漠區(qū)生態(tài)安全具有重要作用[14].近年來很多學(xué)者對紅砂進行了大量研究，大多數(shù)研究針對干旱或鹽脅迫等逆境環(huán)境下紅砂植株的生理生化特征為主[15-19]，劉娟麗[20]通過對紅砂種子活力的研究發(fā)現(xiàn)，隨著老化溫度的升高，紅砂種子發(fā)芽率逐漸下降，其中45 ℃老化處理時種子發(fā)芽率顯著降低.而有關(guān)紅砂種子在老化條件下的生理生化特性的研究卻未見報道.因此，本研究采用人工老化處理方法，對紅砂種子進行不同溫度及時間的處理，以期總結(jié)出紅砂種子在老化處理中的生理響應(yīng)機制，從而為延長紅砂種子貯藏壽命以及種質(zhì)資源的保存提供可靠依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紅砂種子于2019年11月采自甘肅省武威市林業(yè)技術(shù)服務(wù)中心實驗基地(N 38°24′、E 103°9′，海拔1 378 m).種子采回后置于室內(nèi)陰干后搓除果殼，用1 mm孔徑的篩子除去雜物及小種子，選取飽滿、無機械損傷和無蟲害的種子備用.

1.2 人工老化處理

利用人工老化方法對紅砂種子進行處理,模擬荒漠區(qū)種子的老化劣變過程,為了縮短試驗時間，稱取挑選好千粒質(zhì)量為0.97 g的紅砂種子，每6 g為一份，每份約為6 185粒種子，共稱取3份，設(shè)置6個溫度處理(25(CK)、30、35、40、45、50 ℃)；3個時間處理(24、48、72 h )，置于老化箱內(nèi)進行處理，各處理完成后，浸種24 h后進行發(fā)芽試驗及各項生理指標測定.

1.3 指標的測定

發(fā)芽率測定：處理后挑選大小、飽滿度基本一致的種子裝于紙袋中封口備用.在選取好的直徑為90 mm且鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿底部做好標記，每個處理設(shè)置3個重復(fù).對老化處理的種子用10%的84液消毒處理0.5 h，然后用蒸餾水洗凈，分別均勻擺放在其中，并且加入蒸餾水，每個培養(yǎng)皿中擺放100粒種子.將裝有種子的培養(yǎng)皿放置在實驗室中的實驗臺上，在室溫25 ℃下觀察發(fā)芽情況(種子萌發(fā)以胚根突破種皮為標準).每天按時觀察并用滴管補充足量水分(蒸餾水)，以浸潤濾紙為標準，每隔48 h更換一次濾紙，保持苗床干凈，防止種子發(fā)霉.觀察種子發(fā)芽間隔時間為24 h，安置發(fā)芽當天為第1天，每天按時觀察并統(tǒng)計記錄種子發(fā)芽數(shù)量，連續(xù)3 d沒有種子發(fā)芽時結(jié)束發(fā)芽試驗.

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽總數(shù)/試驗種子數(shù)×100%[21]

電導(dǎo)率測定：分別取不同老化處理的種子50 粒，并分別稱質(zhì)量、記錄，重復(fù)3次.分別用兩層紗布包住，做好標記；然后用去離子水對種子進行清洗并用吸水紙吸干種子表面殘留水分，分別裝入25 mL具塞試管中，同時設(shè)置空白對照，分別加入20 mL的去離子水，在室溫條件下浸泡24 h搖晃5 min，再用電導(dǎo)率儀測定浸泡液的電導(dǎo)率,最后參照國際種子檢驗協(xié)會《種子活力測定方法手冊》[22]計算種子相對電導(dǎo)率.

丙二醛(MDA) 含量采用硫代巴比妥酸比色法，過氧化氫酶(CAT) 活性采用H2O2標準溶液法，過氧化物酶(POD) 活性采用愈創(chuàng)木酚法，超氧化物歧化酶(SOD) 活性采用氮藍四唑(NBT)光還原法，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(G-250) 染色法、可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[23].

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2019b軟件作圖；采用SPSS 19.0軟件進行方差分析及多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 老化對紅砂種子發(fā)芽率的影響

經(jīng)老化處理后，發(fā)芽率隨著老化程度的加深總體呈下降趨勢(表1).在同一時間處理下，隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，且隨著老化溫度的升高差異均顯著(P<0.05)；在24 h發(fā)芽率出現(xiàn)峰值，為96%，且比對照高出21.88%.在同一溫度處理下，隨老化時間的延長，發(fā)芽率變化規(guī)律比較一致，均表現(xiàn)出下降的變化趨勢.在30 ℃和35 ℃處理下均高于對照，分別高出對照20.21%(24 h)、18.18%和16.97%(24 h)、12.79%(48 h)、8.17%(72 h)；40、45、50 ℃下隨著溫度與時間的增加均低于對照，并且在50 ℃時發(fā)芽率為零.同時在35 ℃與45 ℃時隨著處理時間的延長發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)，其余溫度處理中發(fā)芽率差異不顯著(P>0.05).

表1 老化處理對紅砂種子發(fā)芽率的影響

2.2 老化處理對紅砂種子相對電導(dǎo)率的影響

經(jīng)老化處理后，電導(dǎo)率隨老化程度的加深總體呈現(xiàn)上升趨勢，老化處理后的電導(dǎo)率均大于CK(圖1).在30、35 ℃老化處理時隨處理時間的延長，電導(dǎo)率呈上升趨勢，且隨著老化處理時間的延長差異不顯著(P>0.05)；40、 45、50 ℃時隨老化時間延長，電導(dǎo)率呈先升后降的趨勢，隨著老化處理時間的延長差異顯著(P<0.05).其中老化溫度達到50 ℃時電導(dǎo)率出現(xiàn)峰值，為70.23%，與對照相比高出38.3%；在相同老化時間，隨著老化處理的溫度升高電導(dǎo)率呈現(xiàn)出升—降—升的趨勢，且與CK相比均差異顯著(P<0.05).老化處理時間在24 h時紅砂種子的電導(dǎo)率出現(xiàn)最低值，為56.34%，且略高于對照19.2%.

不同小寫字母表示相同老化溫度下不同處理時間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理時間不同老化溫度間差異顯著(P<0.05).

2.3 老化處理對紅砂種子過氧化氫酶(CAT)活性的影響

經(jīng)老化處理后，在同一溫度處理下，隨老化時間的延長，紅砂種子CAT活性變化規(guī)律比較一致，表現(xiàn)出下降的變化趨勢，且隨著處理時間的延長差異顯著(P<0.05)(圖2).其中50 ℃處理下CAT活性最低，為104.69 U/g，與對照相比減少了72.8%.30 ℃時CAT活性最高，為855.81 U/g，與對照相比增加了55%.相同老化時間，不同老化溫度之間，隨著老化溫度的增加表現(xiàn)出降—升—降的變化趨勢，在30～35 ℃處理時呈現(xiàn)下降趨勢，且下降幅度最大，為72.0%，35～45 ℃呈現(xiàn)上升趨勢，在50 ℃時再次出現(xiàn)下降，且隨著老化溫度的升高差異顯著(P<0.05).與對照相比除30 ℃ 24 h高于對照外，其他處理均低于對照.

不同小寫字母表示相同老化溫度下不同處理時間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理時間不同老化溫度間差異顯著(P<0.05).

2.4 老化處理對紅砂種子過氧化物酶(POD)活性的影響

經(jīng)老化處理后，相同老化時間，不同老化溫度之間，隨著老化溫度的升高呈先上升后下降的變化趨勢，與對照相比差異顯著(P<0.05)(圖3).并且在老化溫度30 ℃時， POD 的活性出現(xiàn)了峰值，為420 U/g，與對照相比，高出94.1%.老化溫度達到50 ℃時POD 的活性最低，為11.56 U/g，比對照減少了53.6%.相同老化溫度，隨著老化時間的延長POD活性均呈下降的變化規(guī)律，且在30～45 ℃差異顯著(P<0.05)，在50 ℃差異不顯著(P>0.05)，在老化處理時間到24 h時降幅最高，為95.6%，老化處理時間到72 h時降幅最低，為92.3%.

不同小寫字母表示相同老化溫度下不同處理時間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理時間不同老化溫度間差異顯著(P<0.05).

2.5 老化處理對紅砂種子超氧化物歧化酶(SOD)的影響

老化處理過后的紅砂種子，在相同老化溫度，紅砂種子的 SOD 活性隨老化時間的延長整體上表現(xiàn)出下降的趨勢，且變化差異顯著(P<0.05，圖4).

不同小寫字母表示相同老化溫度下不同處理時間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理時間不同老化溫度間差異顯著(P<0.05).

其中在40 ℃時活性出現(xiàn)峰值，為416.20 U/g，高于對照30.54%；同時SOD 活性除40 ℃高于對照外，其余均低于對照.老化處理時間一樣時，隨著溫度的升高SOD活性呈先上升后下降的趨勢.老化時間為24 h時，老化溫度在30～35 ℃差異不顯著(P>0.05)，處理時間72 h時出現(xiàn)最低值，與對照相比下降了60.95%.

2.6 老化處理對紅砂種子丙二醛(MDA)含量的影響

紅砂種子經(jīng)老化處理后，在溫度相同的情況下，隨著老化時間的延長，種子中MDA含量的變化除了35 ℃老化處理下逐漸下降外，其余處理下均呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，50 ℃老化處理下，各處理時間間差異不顯著(P>0.05)(圖5).30 ℃老化處理時MDA含量最高，并且高出對照19.5%.老化溫度在35 ℃老化時間72 h以及老化溫度在45℃老化時間在48、72 h條件下，MDA 含量低于對照，分別比對照降低5.6%、2.7%、1.9%.而其余的不同老化處理條件下與對照相比，分別都高出對照，最大比對照高出19.5%.在老化處理時間相同情況下隨著溫度的提升，MDA 含量呈升-降-升的趨勢，且隨著老化溫度的變化差異顯著(P<0.05).

不同小寫字母表示相同老化溫度下不同處理時間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理時間不同老化溫度間差異顯著(P<0.05).

2.7 老化處理對紅砂種子可溶性蛋白(SP)含量的影響

經(jīng)老化處理后，老化溫度一樣時，隨著老化時間的延長，紅砂種子可溶性蛋白含量呈上升的變化趨勢，總體變化較平穩(wěn)，且差異顯著(P<0.05)(圖6).其中老化處理在30、35 ℃時與對照相比種子可溶性蛋白增加，在老化溫度達到45 ℃時，種子可溶性蛋白含量最低，與對照相比分別下降了91.8%、82.9%、73.0%.在老化時間相同的情況下，隨著老化溫度的升高，老化的紅砂種子可溶性蛋白呈升—降—升的變化趨勢，且差異顯著(P<0.05).在40 ℃處理72 h時與對照相比增加了11.3%，在 72 h時可溶性蛋白含量出現(xiàn)一個高峰，為31.02 mg/g，與對照相比增加了3.2%，在老化24 h時出現(xiàn)一個低峰，且隨著溫度升高，24 h下降幅度最大，為92.03%.

不同小寫字母表示相同老化溫度下不同處理時間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理時間不同老化溫度間差異顯著(P<0.05).

2.8 老化處理對紅砂種子可溶性糖(SS)含量的影響

在老化處理后，SS含量隨老化程度的加深總體呈現(xiàn)上升趨勢，老化處理后的SS含量均大于CK(圖7).在老化處理溫度相同時，不同老化時間處理下，除了老化溫度在40 ℃處理下，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢之外，其余溫度均呈先上升后下降的變化趨勢，且各老化溫度的處理下差異顯著(P<0.05).其中老化溫度在40 ℃處理下可溶性糖含量出現(xiàn)高峰，為4.59 mg/g，比對照升高了 44.52%.在處理時間不變的情況下，隨著老化溫度的升高，紅砂種子SS含量的變化整體上呈先上升后下降的趨勢，并且老化處理后紅砂種子SS含量與對照相比均呈現(xiàn)上升趨勢，且差異顯著(P<0.05).

不同小寫字母表示相同老化溫度下不同處理時間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理時間不同老化溫度間差異顯著(P<0.05).

2.9 老化處理對紅砂種子脯氨酸(Pro)含量的影響

經(jīng)老化處理，在老化處理溫度相同時，隨著處理時間的延長，30、40、50 ℃時紅砂種子中Pro含量的變化呈下降趨勢，而在35、45 ℃時隨著處理時間的延長，紅砂種子中Pro含量呈先上升后下降的變化趨勢，且各老化溫度的處理下差異顯著(P<0.05)(圖8).在老化處理達到40 ℃時出現(xiàn)峰值，為984.59 μg/g，與對照相比分別提升了40.3%.而在老化處理時間一樣時，隨著處理溫度的上升Pro含量整體呈先下降后上升再下降的趨勢，且差異顯著(P<0.05)，其中老化時間在72 h處理下，種子Pro含量出現(xiàn)最小值，與對照相比減小了32.7%.

不同小寫字母表示相同老化溫度下不同處理時間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理時間不同老化溫度間差異顯著(P<0.05).

3 討論

人工加速老化法是研究自然老化過程中物質(zhì)代謝和遺傳物質(zhì)變化的重要方式[24].本研究發(fā)現(xiàn)，隨著處理溫度升高和處理時間延長，紅砂種子的發(fā)芽率均表現(xiàn)出先上升后降低的趨勢，表明老化導(dǎo)致種子活力降低.其中在溫度30 ℃時間24 h時最佳，在溫度達到50 ℃時發(fā)芽率為零.這與周晶等[24]對垂穗披堿草種子活力的研究和張詩慧等[25]對白刺花種子活力的研究結(jié)果一致.吳濱等[21]對紅砂種子在不同高溫下處理研究中也指出，隨著溫度的增加活力會降低.并且Sananda等[26]通過對兩個小麥品種(Hur-468和Huw-234) 的萌發(fā)研究發(fā)現(xiàn)，兩個品種的種子均以24 h老化種子、對照種子和42 h老化種子為最大值.

老化處理可導(dǎo)致植物器官在生理生化方面發(fā)生一定的變化[27]，隨著老化時間的延長和溫度的升高，種子的活力不斷下降，使膜系統(tǒng)受損[28].因此，膜透性的變化反映了各種逆境下對植物細胞的傷害程度，同時也反映了植物抗逆性的高低[23].本研究表明，紅砂種子電導(dǎo)率隨老化程度的加深而升高.主要因為老化處理是在高溫高濕的條件下進行，破壞膜的結(jié)構(gòu)、損壞膜的功能，并使其透性增大.王春蓮等[29]研究玉米雜交老化過程中發(fā)現(xiàn)，浸出液電導(dǎo)率隨老化程度的加深而升高.這與本試驗結(jié)果一致，進一步證明了老化對種子抗逆性的影響.植物在逆境下遭受衰老與活性氧積累誘發(fā)的膜脂過氧化作用密切相關(guān)，其中丙二醛(MDA)是膜質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物，MDA的增加會損傷生物膜[23].還可以加劇過氧化作用，而且能與蛋白質(zhì)結(jié)合使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致其催化功能喪失[30-31].本研究中隨著老化強度加深紅砂種子MDA含量總體較高且呈先上升后下降的趨勢，這說明種子抗氧化物的清除能力減弱.高茜[32]通過對紅砂種子在貯藏溫度條件下生理特性的研究中發(fā)現(xiàn)，溫度越低，種子貯藏期間有毒物質(zhì)積累越少，對種子膜系統(tǒng)破壞越小.這與本研究中的結(jié)果基本一致，由此可知是由于種子中膜脂不飽和脂肪酸的過氧化作用使膜損傷以及種子活力下降.

在清除自由基的系統(tǒng)中，保護酶處于一個十分重要的地位，他們之間的協(xié)同作用可消除自由基，保證種子不受傷害[33-37].本研究發(fā)現(xiàn)，隨著老化時間的延長，紅砂種子CAT、POD和SOD活性均呈先上升后下降的趨勢，但CAT活性、POD活性在種子老化達到30 ℃出現(xiàn)拐點而SOD活性是在40 ℃時出現(xiàn)拐點，表明種子活性好，具有更強的萌發(fā)能力和一定的滯后性.桓國江等[38]在對紅砂種子萌發(fā)指標的研究中發(fā)現(xiàn)，紅砂種子在20～30 ℃下萌發(fā)效果最好，這也從生理角度揭示了30～40 ℃是其最佳萌發(fā)溫度的機理.本研究中對照的POD活性則低于處理后種子的POD活性.這可能是紅砂種子在老化過程中，為了適應(yīng)抗逆環(huán)境而使超氧化物陰離子自由基的含量增加，加劇了對種子的毒害作用，提高了酶的活性.由試驗結(jié)果可以看出，30 ℃條件老化后，紅砂種子內(nèi)抗氧化酶活性較高.

可溶性蛋白質(zhì)與可溶性糖是種子內(nèi)不可或缺的營養(yǎng)，對種子發(fā)芽與胚的發(fā)育起著重要的作用，因此與種子的活力有著密切的關(guān)系.本研究中，隨著老化強度的加深，種子貯藏營養(yǎng)物質(zhì)可溶性糖、可溶性蛋白先升高后基本穩(wěn)定，然后再下降.馬向麗等[39]通過對納羅克非洲狗尾草種子的測定表明，貯藏營養(yǎng)物質(zhì)可溶性糖、可溶性蛋白基本穩(wěn)定上升，與本研究結(jié)果相似.說明高溫高濕能夠使紅砂種子在老化過程中對蛋白質(zhì)與糖類消耗大,使得種子新陳代謝保持在最高水平，種子壽命縮短.在正常環(huán)境條件下種子體內(nèi)脯氨酸的含量一般較低，但在逆境條件下，脯氨酸是植物在不良環(huán)境下產(chǎn)生的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一[23].在本研究中，隨著老化強度的增加，脯氨酸含量總體呈先下降后上升再下降的趨勢，可見抗老化性能在逐漸減弱.這與姚俠妹等[9]對桔梗種子的研究結(jié)果相符合.由于脯氨酸親水性極強，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過程.因此，脯氨酸的積累，對于保持種子內(nèi)的水分，保護膜結(jié)構(gòu)避免傷害具有重要意義.

4 結(jié)論

本研究以紅砂種子為材料,采用高溫(30～50 ℃)高濕(相對濕度95%)的方法對種子進行人工老化處理24～72 h，研究紅砂種子發(fā)芽指標和生理特性指標的變化規(guī)律.結(jié)果表明,隨著老化強度的加深，紅砂種子活力變化明顯，發(fā)芽率降低，內(nèi)溶外滲嚴重，質(zhì)膜受傷害程度高，保護酶活性降低，丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白增加，脯氨酸總體也呈先上升后下降的趨勢.通過發(fā)芽率和生理層面對老化的紅砂種子進行研究得知在逆境環(huán)境下，加速了紅砂種子老化.因此，老化時間24 h、溫度30～40 ℃時紅砂種子活力最佳.