鄧宇童 蔡玲玲 任雪雯 李雪 胡博 馮蕙裳 杭小涵 趙欣楠 于心薈 李元文

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種以濕疹樣皮疹、瘙癢、局部干燥等癥狀為特征的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病[1]。近年來，AD在中國(guó)的發(fā)病率增長(zhǎng)迅速。目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，新生的表皮神經(jīng)纖維與AD的發(fā)病關(guān)系密切[2-4]。表皮神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)受到神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)和信號(hào)素3A(semaphorin3A,Sema3A)雙向調(diào)控，同時(shí)還有其他相關(guān)因子共同參與。當(dāng)AD發(fā)病時(shí)皮膚屏障被破壞，表皮新生神經(jīng)纖維密度增加，而通過調(diào)控Sema3A/NGF及相關(guān)分子水平，可以減少AD病患皮損部位新生表皮神經(jīng)纖維的密度，減輕皮膚炎癥，改善AD臨床癥狀[5]。本團(tuán)隊(duì)通過前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用青石止癢軟膏治療濕疹[6-8]、銀屑病[9-10]、神經(jīng)性皮炎[11-14]及AD等炎癥性皮膚病療效顯著，相關(guān)作用機(jī)制研究有待完善。故本研究以不同濃度青石止癢軟膏干預(yù)2，4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorbenzene，DNCB)誘導(dǎo)的小鼠AD模型，觀察皮損癥狀評(píng)分、組織病理學(xué)改變、Sema3A/NGF及其相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的情況，從分子水平探討青石止癢軟膏治療AD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/C小鼠56只，8周齡，購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：110324201103138756；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCKX(京)2019-0010。于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、主要試劑及儀器

陽性對(duì)照試劑為丁酸氫化可的松(尤卓爾，天津藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20061033)；陰性對(duì)照試劑為青石止癢軟膏所用基質(zhì)軟膏，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院皮膚科外治室制備，將橄欖油、蜂蠟按照10∶1配置而成；不同濃度青石止癢軟膏由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院皮膚科外治室制備，將青黛20 g、煅爐甘石60 g、煅石膏30 g、苦參30 g、黃柏30 g加8倍量70%乙醇，加熱回流提取，離心過濾，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮為1g生藥/mL提取液濃度的浸膏，冰片10 g趁熱加入濃縮液中混合均勻，悶潤(rùn)30分鐘，過濾，蒸干后加入基質(zhì)軟膏，配制含藥量不同的青石止癢高濃度軟膏(0.36 g/g)、中濃度軟膏(0.18 g/g)、低濃度軟膏(0.09 g/g)。

Trizol(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：326411)；氯仿、異丙醇(南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180907、2020120)、DEPC(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：20210125)；cDNA第一鏈合成試劑盒、One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II(日本TaKaRa公司，批號(hào)：AJE1627A、AJE1687A)；rabbit Anti-GAPDH、羊抗兔IgG-HRP(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：20210121、20210115)；Rabbit Anti-Semaphorin 3A(美國(guó)abcam，批號(hào)：GR295523-1)；Rabbit Anti-PLPAK1(武漢三鷹，批號(hào)：00069245)；NGF、IL-31 ELISA試劑盒(美國(guó)Raybiotech，批號(hào)：409210572、521211755)；NT-4 ELISA試劑盒(美國(guó)RbD Systems，批號(hào)：0730210209)；H.E染色試劑盒、中性樹膠封片劑(北京中科萬邦生物科技有限公司，批號(hào)：RY-0002、FP-0001)；丙酮(北京化工廠，批號(hào)：20190801)；DNCB(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；硫化鈉(福晨化學(xué)，批號(hào)：20190827)。

ST16R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó) Thermo Sorvall)；Spectramac M3多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) MD)；XW-80A渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；熒光定量PCR循環(huán)儀、普通梯度PCR儀(美國(guó)ABI)；UV-2450紫外光度儀(日本 SHIMADZU)；電泳儀(美國(guó) Bio-rad)；THZ-312臺(tái)式恒溫振蕩器(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；G：BOXChemiXR5凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó) SYNGENE)；JT-12S脫水機(jī)、JB-P7包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)。

1.3 造模及分組

將56只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，全部予脫毛處理，脫毛方法為：用電推器及8%硫化鈉溶液對(duì)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)部位脫毛，于腹部去毛，面積約為1 cm×2 cm，背部去毛面積約2 cm×3 cm。脫毛后，以隨機(jī)數(shù)字表法將56只小鼠隨機(jī)分為空白組8只，實(shí)驗(yàn)組48只。結(jié)合參考文獻(xiàn)[15]及團(tuán)隊(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)[16]以DNCB丙酮溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行特應(yīng)性皮炎造模，造模方法略有調(diào)整，具體方法為：造模第一天，于腹部脫毛處涂7%的DNCB丙酮溶液致敏，3天后于同一位置進(jìn)行第二次致敏；造模第8天，于背部涂0.5%的DNCB丙酮溶液進(jìn)行激發(fā)，后每5天激發(fā)一次，連續(xù)激發(fā)6次。

造模成功后，再次以隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)組48只特應(yīng)性皮炎模型小鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、青石止癢高濃度組、青石止癢中濃度組、青石止癢低濃度組，每組8只。

1.4 干預(yù)方法

造模完成后，各組均予常規(guī)喂養(yǎng)?？瞻捉M、模型組不予任何干預(yù)措施；陽性對(duì)照組于背部皮損部位涂丁酸氫化可的松乳膏，每日2次；陰性對(duì)照組于背部皮損部位涂基質(zhì)軟膏每日2次；青石止癢高、中、低濃度組于背部皮損部位涂分組對(duì)應(yīng)濃度的青石止癢軟膏，每日2次。各組用藥參考指尖單位標(biāo)準(zhǔn)，每次用藥按照1指尖單位/2 cm2藥量外用，連續(xù)用藥7天。用藥期間若小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)則用4%硫化鈉溶液外涂補(bǔ)充脫毛。

1.5 皮損評(píng)分[17]

觀察記錄除空白組外各組小鼠皮損部位皮損評(píng)分，參考臨床特應(yīng)性皮炎積分(scoring atopic dermatitis,SCORAD)指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，在取材前，對(duì)皮損嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分：包括紅斑、鱗屑、水腫/丘疹、表皮剝脫，分為無(0分)、輕(1分)、中(2分)、重(3分)4個(gè)等級(jí)，各癥狀分級(jí)之間可記半級(jí)分?jǐn)?shù)即0.5分、1.5分、2.5分。特應(yīng)性皮炎總積分(表示小鼠AD嚴(yán)重程度)記為各項(xiàng)評(píng)分總和，區(qū)間為0～12分。

1.6 取材

藥物干預(yù)結(jié)束后1天，對(duì)小鼠予4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)腹腔注射進(jìn)行麻醉，取實(shí)驗(yàn)組背部造模部位皮膚及空白組同部位皮膚后予頸椎脫臼處死。將2 cm×1 cm大小皮膚組織于4%多聚甲醛中固定；將1 cm×1 cm大小皮膚組織3塊，分裝后于液氮速凍，置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 皮損病理切片觀察

取固定于4%多聚甲醛中的皮膚組織，進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、切片等操作后，予HE染色。用全自動(dòng)數(shù)字病理切片掃描儀對(duì)病理切片進(jìn)行掃描，以K-Viewer軟件觀察皮損部位組織病理學(xué)變化。

1.8 皮膚組織勻漿檢測(cè)

取凍存于-80℃冰箱的皮膚組織進(jìn)行相關(guān)分子檢測(cè)。

以實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)定量法檢測(cè)皮損中microRNA-145相對(duì)表達(dá)水平，從每組中隨機(jī)抽取4只小鼠的皮膚組織進(jìn)行檢測(cè)。采用Trizol試劑提取皮損組織總RNA，測(cè)定濃度后制備cDNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，預(yù)變性5分鐘；共40個(gè)PCR循環(huán)(95℃變性15秒；60℃退火20秒；72℃延伸40秒)。熒光定量PCR循環(huán)儀進(jìn)行定量，每個(gè)樣本基因做3個(gè)復(fù)孔；通過2-△△ct法計(jì)算microRNA-145相對(duì)表達(dá)量。microRNA-145引物序列：上游引物5′-CGCGATTCCTGGAAATACTG-3′,下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。U6序列：上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，94bp。

以蛋白免疫印跡法檢測(cè)Sema3A、P21活化激酶(p21-activated kinase,PAK)水平。對(duì)皮損組織蛋白提取、定量后，配置分離膠、濃縮膠每孔上樣適量(30 μg)蛋白，90V電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出NC膜并作好標(biāo)記，用TBST洗膜5分鐘×3次后以5%脫脂奶封閉，搖床振蕩2小時(shí)。封閉后再次以TBST洗膜5分鐘×3次后將膜放入含一抗(Semaphorin 3A，1∶1 000；PLPAK1，1∶1 000；GAPDH，1∶5 000)的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜。吸棄一抗，洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)2小時(shí)。ECL顯色后曝光、顯影。使用G：BOX chemiXR5成像。使用Gel-Pro32軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

以酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)白細(xì)胞介素31(interleukin-31，IL-31)、NGF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子4(neurotrophin-4,NT-4)含量。采用BCA試劑盒檢測(cè)皮損組織細(xì)胞裂解液蛋白濃度，按照說明書完成操作后立即在酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)。采用Sigmaplot 12.0軟件計(jì)算濃度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組AD小鼠皮損表現(xiàn)及評(píng)分比較

取材前觀察各組小鼠背部皮膚情況，空白組小鼠未見皮損；模型組、陰性對(duì)照組小鼠皮膚存在不同程度的紅斑、鱗屑、表皮剝脫、抓痕、結(jié)痂等皮損；陽性對(duì)照組及青石止癢各濃度組，上述皮損較模型組、陰性對(duì)照組明顯減少。皮損評(píng)分結(jié)果顯示，治療后模型組與陰性對(duì)照組SCORAD評(píng)分無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組、陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組及青石止癢各濃度組SCORAD評(píng)分降低，皮損癥狀改善(P<0.05)；陽性對(duì)照組與青石止癢中濃度組相比，二者皮損評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，青石止癢高、低濃度組皮損評(píng)分高于陽性對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組AD小鼠SCORAD評(píng)分結(jié)果比較

2.2 各組AD小鼠皮膚組織病理學(xué)變化比較

空白組：角質(zhì)層連續(xù)，角質(zhì)形成細(xì)胞排列整齊，連接緊密，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組：棘層、顆粒層增厚，可見角化過度及角化不全，真皮層有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局部水腫明顯，提示慢性炎癥；陰性對(duì)照組：與模型組表現(xiàn)基本一致；陽性對(duì)照組：角質(zhì)層較薄，偶可見角化過度，與模型組相比棘層變薄，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，角質(zhì)形成細(xì)胞排列整齊，無明顯水腫；青石止癢各濃度組：與模型組相比棘層變薄，真皮層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞間水腫較輕。見圖1。

2.3 各組AD小鼠皮膚組織microRNA-145表達(dá)水平比較

與空白組相比，治療后模型組、陰性對(duì)照組、青石止癢高、低濃度組的microRNA-145表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組相比，青石止癢高、中濃度組的microRNA-145表達(dá)水平升高(P<0.05)；與陽性對(duì)照組比較，青石止癢各濃度組microRNA-145表達(dá)水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組AD小鼠皮膚組織microRNA-145表達(dá)水平比較

2.4 各組AD小鼠皮膚組織Sema3A、PAK蛋白表達(dá)水平比較

與空白組相比，治療后模型組、陰性對(duì)照組、青石止癢高、低濃度組皮膚Sema3A蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，PAK蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組相比，陰性對(duì)照組在兩種蛋白表達(dá)水平上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組、陰性對(duì)照組相比較，陽性對(duì)照組、青石止癢中、低濃度組Sema3A蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，PAK蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與陽性對(duì)照組相比，青石止癢高濃度組PAK蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，陽性對(duì)照組與青石止癢中、低濃度組的Sema3A蛋白、PAK蛋白表達(dá)水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見圖2、表3。

注： A 空白組；B 模型組；C 陽性對(duì)照組；D 陰性對(duì)照組；E 青石止癢高濃度組；F 青石止癢中濃度組；G 青石止癢低濃度組。

注：A 空白組；B 模型組；C 青石止癢中濃度組；D 青石止癢高濃度組；E 青石止癢低濃度組；F 陰性對(duì)照組；G 陽性對(duì)照組。

表3 各組AD小鼠皮膚組織Sema3A、PAK蛋白表達(dá)比較

2.5 各組AD小鼠皮膚組織NGF、NT-4、IL-31含量比較

與空白組相比，治療后模型組、陰性對(duì)照組及青石止癢高濃度組皮膚NGF含量升高(P<0.05)，模型組NT-4含量升高(P<0.05)，模型組、陰性對(duì)照組IL-31含量升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對(duì)照組、青石止癢各濃度組NGF、NT-4、IL-31含量均降低(P<0.05)，陰性對(duì)照組NT-4、IL-31含量降低(P<0.05)；與陽性對(duì)照組相比、陰性對(duì)照組，青石止癢高濃度組NGF含量升高(P<0.05)，陰性對(duì)照組、青石止癢低濃度組IL-31含量升高(P<0.05)，青石止癢中濃度組NGF、NT-4、IL-31含量與陽性對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組AD小鼠皮膚組織NGF、NT-4、IL-31含量比較

3 討論

AD作為皮膚科臨床常見疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今未能明確。目前學(xué)界主要認(rèn)為AD的發(fā)病原因是環(huán)境因素作用于遺傳易感性個(gè)體從而導(dǎo)致一系列免疫失調(diào)所致[18]，這與中醫(yī)“兩虛相得”的認(rèn)識(shí)一致。青石止癢軟膏原名甘石青黛膏，源自已故名老中醫(yī)金起鳳教授經(jīng)驗(yàn)方，后經(jīng)李元文教授[19]根據(jù)幾十年的臨床應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化改良而得。方中重用爐甘石收濕止癢斂瘡為君；青黛瀉火解毒，涼血燥濕，與燥濕生肌的煅石膏相伍為臣；黃柏、苦參為佐以增強(qiáng)燥濕止癢之力；冰片解毒療瘡為使，諸藥合用共奏清肝瀉火，燥濕止癢之功。青石止癢軟膏現(xiàn)作為北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院院內(nèi)制劑被廣泛應(yīng)用于辨證為濕熱證或肝郁化火證的炎癥性皮膚病，療效顯著。其治療AD的分子機(jī)制還有待完善。

本研究顯示，DNCB誘導(dǎo)造模后，模型組小鼠出現(xiàn)紅斑、鱗屑、表皮剝脫等皮損，組織病理學(xué)可見真皮層有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局部水腫明顯棘層、顆粒層增厚，角化過度及角化不全的表現(xiàn)，提示造模成功。用藥7天后，青石止癢各濃度組以及陽性對(duì)照組在皮損評(píng)分與組織病理學(xué)表現(xiàn)上較模型組明顯改善，提示青石止癢軟膏對(duì)AD療效明確。

研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)內(nèi)分泌—免疫—皮膚系統(tǒng)下屬的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族所包含的NGF、腦源性神經(jīng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子3及NT-4等因子在促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)方面扮演重要角色，是神經(jīng)元和角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，具有抗凋亡、參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及調(diào)控皮膚炎癥的作用[20-21]。而同樣由角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)的Sema3A作為神經(jīng)排斥因子，則具有抑制神經(jīng)生長(zhǎng)的作用，與NGF等因子共同支配表皮神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)，起到雙向調(diào)節(jié)的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)皮膚屏障破壞后，表皮神經(jīng)正常生長(zhǎng)受影響，表現(xiàn)為表皮神經(jīng)的密度增加[22]。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)，在患有AD的人類[23-25]和小鼠皮膚活檢[26]中觀察到NGF高于正常表皮表達(dá)，其他因子如NT-4在AD患者中表達(dá)也有增加[27]，與之相對(duì)的Sema3A的表達(dá)則會(huì)減少[28]。應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子抑制劑[29]或Sema3A軟膏[30]可以有效干預(yù)AD的發(fā)展，其他干預(yù)手段也可以通過對(duì)Sema3A/NGF相關(guān)分子水平產(chǎn)生影響從而治療AD[31-32]。

本研究顯示，陽性對(duì)照組以及青石止癢中、低濃度組Sema3A表達(dá)水平高于模型組；陽性對(duì)照組、青石止癢各濃度組NGF、NT-4含量低于模型組。而與空白組比較，青石止癢高、低濃度組分子水平上仍存在差異，未恢復(fù)到正常水平，提示不同濃度藥物治療效果可能存在差異，考慮可能與藥膏濃度、透皮吸收度以及療程等因素相關(guān)，具體還需進(jìn)一步研究。

此外本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組microRNA-145表達(dá)降低，PAK表達(dá)增多，IL-31含量增加；經(jīng)7天用藥后，陽性對(duì)照組及青石止癢中濃度組microRNA-145表達(dá)上調(diào)，PAK表達(dá)減少，陽性對(duì)照組及青石止癢各濃度組IL-31含量減少，與空白組相比無顯著差異。microRNA-145是調(diào)控Sema3A蛋白基因表達(dá)的重要靶向micro RNA，當(dāng)microRNA-145上調(diào)時(shí)，mRNA以及蛋白質(zhì)水平上的Sema3A都會(huì)出現(xiàn)過度表達(dá)[33]。PAK是Rac1的效應(yīng)結(jié)合蛋白，有研究表明PAK對(duì)Sema3A及其誘導(dǎo)的神經(jīng)塌陷反應(yīng)有一定的抑制作用[34]，因此推測(cè)其可能與AD有潛在聯(lián)系。除此之外，還有許多因子可能影響到AD患者表皮神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)。有研究報(bào)道AD患者皮膚瘙癢部位的IL-31含量高于正常皮膚[35]，這可能與IL-31誘導(dǎo)神經(jīng)元的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致皮損部位神經(jīng)密度增加有關(guān)[36]。有研究也證實(shí)了抗IL-31可顯著抑制AD小鼠模型的瘙癢癥狀[37]。

綜上，青石止癢軟膏一方面可以改善AD皮損癥狀以及組織病理學(xué)變化，另一方面在分子層面，可能是通過降低NGF、NT-4的水平，并通過增強(qiáng)microRNA-145基因表達(dá)，從而提高Sema3A蛋白表達(dá)水平，同時(shí)抑制PAK蛋白表達(dá)，從而降低皮損部位新生表皮神經(jīng)纖維密度，對(duì)AD起到積極的治療作用。此外，青石止癢軟膏還可以通過降低皮損部位IL-31分子水平，進(jìn)一步減少新生表皮神經(jīng)纖維對(duì)皮損部位的影響。