不同蛋白酶對(duì)紅鰭笛鯛魚排酶解液風(fēng)味影響

宿小杰，王珊珊，崔青曼，馬玉潔，于瑩，周德慶*

（1.天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津300457；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071）

紅鰭笛鯛（Lutjanus erythrina），又名紅笛鯛魚、赤鰭笛鯛、紅雞魚、紅曹魚、紅魚，是我國南海重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一，個(gè)體近橢圓形，體長可達(dá)82 cm，屬上等食用魚[1]。其風(fēng)味醇厚鮮甜，適合煮湯、煎食，也適合加工成鹽漬制品或罐頭[2]。海捕紅鰭笛鯛從船載制冷設(shè)備進(jìn)入工廠加工時(shí)魚肉被剖下進(jìn)行下一步精加工，而剩余的加工副產(chǎn)物約占魚體總重的40%，主要包括魚鰭、魚尾、魚排（附著殘余魚肉的魚骨）等，常被作為廢棄物棄掉或以低廉的價(jià)格賣給魚粉加工廠，不但降低了紅鰭笛鯛本身的價(jià)值，使得大量的蛋白質(zhì)資源流失，而且造成了環(huán)境的污染[3]。

紅鰭笛鯛魚排具有較高的蛋白質(zhì)含量，紅鰭笛鯛本身濃郁的鮮味成分和豐富的口感來源于本身富有的呈味肽[4]。呈味肽的呈味特性與其氨基酸的組成密切相關(guān)，具有復(fù)雜而微妙的風(fēng)味，可以使口腔總體呈味協(xié)調(diào)[5]。對(duì)于多肽呈味特性的研究始于上世紀(jì)六十年代，最初的研究認(rèn)為氨基酸使得食物呈現(xiàn)豐富滋味，由氨基酸組成的多肽只有緩沖平衡滋味的作用。Kirimura等[6]于1969年發(fā)現(xiàn)L-Leu-L-Leu和γ-L-Glu-L-Glu這兩個(gè)二肽的呈味閾值遠(yuǎn)低于氨基酸L-Leu和L-Glu的閾值，表明特定結(jié)構(gòu)的肽可能比游離氨基酸具有更鮮的滋味呈現(xiàn)。張典等[7]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tande mass spectrometry，UPLC-MS/MS）和從頭測序法從牡蠣酶解液中分離鑒定出31種呈味肽并固相合成了其中4種，合成的牡蠣呈味肽在食鹽以及食鹽味精混合溶液中均具有明顯的鮮味增強(qiáng)效果。劉源等[8]對(duì)熱加工暗紋東方鲀肌肉中呈味肽進(jìn)行分離鑒定及呈味特性研究，分別得到新的呈味五肽（Cys-Ala-Leu-Thr-Pro）和六肽（Arg-Pro-Leu-Gly-Asn-Cys），與谷氨酸鈉和氯化鈉具有滋味協(xié)同作用，能夠增強(qiáng)鮮味強(qiáng)度。謝曉霞[9]從文蛤水提液中制備呈味肽，最終獲得一種九肽（Ser-Thr-Met-Leu-Leu-Glu-Ser-Glu-Arg），具有鮮味，略微咸味。在呈味肽的研究過程中，應(yīng)用蛋白酶水解技術(shù)，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)過程可控，不僅大大提高了紅鰭笛鯛魚排中活性物質(zhì)的利用，而且節(jié)約了反應(yīng)時(shí)間。目前酶解提升產(chǎn)品風(fēng)味多見于蝦蟹[10]、扇貝[11]、羅非魚[12]、鱈魚[13]的加工副產(chǎn)物中的應(yīng)用，而以紅鰭笛鯛魚排為原料的研究報(bào)道相對(duì)較少。本試驗(yàn)以紅鰭笛鯛魚排為原料，分別采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶4種酶制劑進(jìn)行水解，在最佳酶解條件下制備具有良好風(fēng)味的酶解液，進(jìn)而通過感官評(píng)價(jià)與電子舌試驗(yàn)確定最終的呈味特性，選出最佳蛋白酶，以期為后續(xù)研發(fā)富含紅鰭笛鯛魚排呈味肽的海鮮調(diào)味品提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅鰭笛鯛魚排：煙臺(tái)市蓬萊京魯漁業(yè)有限公司提供，海捕紅鰭笛鯛由工廠剖肉后，將魚排速凍置于隔熱泡沫箱內(nèi)，速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室（期間不超過4 h），于-40℃冷藏備用；中性蛋白酶（4.8×104U/g）、堿性蛋白酶（8.6×104U/g）：丹麥諾維信生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶（1.5×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶（1.5×104U/g）：北京索萊寶科技有限公司；茚三酮、D-果糖、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、氯化鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHSY-50N型水浴恒溫振蕩器：上海知楚儀器有限公司；JYL-CO12E型破壁機(jī)：九陽股份有限公司；UV-9000型紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；EL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；STARTER3C型pH計(jì)：奧豪斯儀器有限公司；HH-21-4型電熱恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；XT5118-OV50型電熱鼓風(fēng)干燥箱：杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司；LC-4012型低速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；iTongue電子舌：上海昂申智能科技有限公司；Sykam S-433D全自動(dòng)分析儀：東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司；MixMax漩渦振蕩器：合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

取紅鰭笛鯛魚排解凍后，洗凈，將魚排剪成2 cm×2 cm左右的小塊，經(jīng)126℃高溫高壓處理40 min后進(jìn)行勻漿。蒸餾水漂洗脫脂30 min[14]。

1.3.2 酶解液的制備

取紅鰭笛鯛魚排勻漿100 g置于500 mL三角錐形瓶中，加入純凈水100 mL，用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為蛋白酶的最佳pH值。按照3000U/g的加酶量加入各蛋白酶，在50℃條件下酶解4 h。酶解結(jié)束后沸水中10 min滅酶，冷卻后4 000 r/min離心10 min，收集上清液備用。

4種蛋白酶酶解條件見表1。

表1 4種蛋白酶酶解條件Table 1 Conditions for hydrolysis of 4 different proteases

1.3.3 氨基酸組成分析

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》方法進(jìn)行測定，使用全自動(dòng)分析儀對(duì)酶解液進(jìn)行氨基酸組成分析[15]。

1.3.4 水解度的測定

采用茚三酮比色法[16]測定水解度。水解度（degree of hydrolysis，DH）可以反映蛋白質(zhì)的水解程度。準(zhǔn)確稱量0.100 0 g干燥過的甘氨酸，定容至100 mL，取出2.00 mL定容至100 mL，得到20 μg/mL的溶液。取該溶液稀釋成2 μg/mL～20 μg/mL的溶液用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。取2 mL試液于具塞試管中，分別加入1 mL茚三酮顯色劑，混勻，同時(shí)做空白試驗(yàn)。沸水浴15 min后立即放入冷水中冷卻，加入5.00 mL 40%乙醇溶液，于漩渦振蕩器劇烈振蕩數(shù)分鐘至棕紅色褪去，25℃室溫下放置15 min，570 nm處測定吸光值。以甘氨酸摩爾數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.040 7x-0.012 1，R2=0.999 5。

將酶解液稀釋2 000倍，取2.00 mL稀釋液于試管中并加入1.00 mL茚三酮顯色劑，混勻，同時(shí)做空白試驗(yàn)。其余操作同上。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶解液中-NH2含量。水解度計(jì)算公式如下。

式中：DH為水解度，%；h為酶解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)，mmol/g；htot為每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)，mmol/g。

1.3.5 多肽含量的測定

三氯乙酸法[17-18]測定多肽含量。取酶解液10 mL，加入20%三氯乙酸10 mL，漩渦振蕩器混勻后靜置10 min，4 500 r/min離心10 min。檢測上清液中總氮含量用以計(jì)算酶解液中多肽含量。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

參考楊琬琳[19]感官評(píng)價(jià)方法對(duì)紅鰭笛鯛魚排酶解液的風(fēng)味進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)由6名感官評(píng)價(jià)員組成，均經(jīng)過專業(yè)的感官培訓(xùn)，評(píng)分采用5分制（1表示味道極弱，5表示味道極強(qiáng)），對(duì)酶解產(chǎn)物的風(fēng)味（包括鮮味、苦味、醇厚味、澀味、整體喜好度）進(jìn)行評(píng)價(jià)。每個(gè)樣品的每種滋味特征取評(píng)分的平均值作為感官評(píng)價(jià)結(jié)果。

1.3.7 電子舌測定

采用itongue電子舌系統(tǒng)，對(duì)酸、甜、苦、咸、鮮5種基本味覺具有專一響應(yīng)性。將酶解液與超純水按體積比1∶9進(jìn)行稀釋處理。其標(biāo)準(zhǔn)品為0.2、0.3、0.4 mg/mL的 NaCl（代表咸味）和 0.2、0.3、0.4 mg/mL的谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG，代表鮮味）[20]。檢測前儀器需自檢、活化預(yù)熱、校準(zhǔn)、診斷。設(shè)置檢測條件為每個(gè)樣品檢測定6次，檢測時(shí)間120 s，每個(gè)樣品檢測結(jié)束后以超純水進(jìn)行清洗。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用SPSS 22.0進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的方差分析和顯著性檢驗(yàn)，每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，采用SciDAVis1.26制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類對(duì)紅鰭笛鯛魚排水解度及多肽含量的影響

不同蛋白酶對(duì)水解度和多肽含量的影響見表2。

表2 不同蛋白酶對(duì)水解度和多肽含量的影響Table 2 Effects of different proteases on hydrolysis degree and polypeptide content

如表2所示，風(fēng)味蛋白酶的酶解產(chǎn)物水解度最高，為29.14%，其次是木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶，遠(yuǎn)高于中性蛋白酶17.03%。由此可見，在相同酶解條件下，酶解效果與酶的種類有較大的關(guān)系。蛋白質(zhì)水解度是反映酶解程度的一個(gè)指標(biāo)[21]，中性蛋白酶是一種內(nèi)切酶，作用于蛋白質(zhì)肽鏈的中間位點(diǎn)；而風(fēng)味蛋白酶兼具內(nèi)切酶和外切酶的特性[22]，既可以切開肽鏈內(nèi)部肽鍵又可以從肽鏈的末端切斷并釋放游離氨基酸，因此風(fēng)味蛋白酶的水解度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中性蛋白酶。這表明風(fēng)味蛋白酶的水解效率最高。結(jié)果與范秀萍等[23]研究結(jié)果相似，仇泓博等[24]也發(fā)現(xiàn)風(fēng)味蛋白酶有較好的水解效果。

通過多肽含量的比較，結(jié)果表明，風(fēng)味蛋白酶多肽含量最高為4.27 g/100 g，多肽含量可以反映蛋白質(zhì)水解程度，多肽含量的趨勢(shì)大致與水解度趨勢(shì)相似，說明風(fēng)味蛋白酶有較高的水解效率。整體呈味受多肽含量的影響[25]，多肽的呈味具有復(fù)雜而微妙的風(fēng)味，可以使口腔總體的呈味具有協(xié)調(diào)的口感。通過紅鰭笛鯛魚排酶解液中水解度和多肽含量的差異，說明風(fēng)味蛋白酶制備呈味肽效果較木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶更加優(yōu)異。

2.2 紅鰭笛鯛魚排酶解液氨基酸組成分析

紅鰭笛鯛魚排酶解液氨基酸組成分析見表3。

表3 紅鰭笛鯛魚排酶解液氨基酸組成分析Table 3 Analysis of amino acid composition in enzymatic hydrolysate of crimson snapper frame

續(xù)表3 紅鰭笛鯛魚排酶解液氨基酸組成分析Continue table 3 Analysis of amino acid composition in enzymatic hydrolysate of crimson snapper frame

天然蛋白質(zhì)中的氨基酸及其鹽大多具有甜味或苦味，少數(shù)幾種具有鮮味或酸味。氨基酸組成對(duì)于鑒別整體呈味具有重要作用[26]。Umayaparvathi等[27]發(fā)現(xiàn)牡蠣酶解產(chǎn)物富含半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸等鮮味氨基酸，從而使得牡蠣具有鮮甜的滋味；郭淋凱等[28]通過堿性蛋白酶水解章魚-鮑魚加工副產(chǎn)物制備氨基酸含量較高的海鮮風(fēng)味酶解液。由表3可知，4種酶解液中的氨基酸含量最高的是風(fēng)味蛋白酶酶解液，氨基酸含量8520mg/100g，其次是木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶，氨基酸含量分別為7 460 mg/100 g和7 140 mg/100 g。而中性蛋白酶的酶解液中氨基酸含量最低，為6720mg/100 g，說明中性蛋白酶水解能力較差。

紅鰭笛鯛魚排中呈味氨基酸總占比見表4。

表4 紅鰭笛鯛魚排中呈味氨基酸總占比Table 4 Total percentage of flavored amino acids in crimson snapper frame

由表4可知，4種蛋白酶酶解液的鮮甜味氨基酸均高于苦味氨基酸的含量，相關(guān)研究表明，鮮甜味氨基酸的存在，正是海產(chǎn)品濃郁鮮美味的主要來源，這些氨基酸含量越高，海產(chǎn)品的鮮美味道越高[29]。紅鰭笛鯛魚排4種酶解液中，一些苦味氨基酸含量雖然較高，例如精氨酸，但是Zhang等[30]在對(duì)暗紋東方鲀進(jìn)行鮮味評(píng)估時(shí)發(fā)現(xiàn)精氨酸與蔗糖、味精、NaCl、咖啡因和檸檬酸溶液等溶液具有協(xié)同作用，添加精氨酸可以提高蔗糖的感知力，并增加鮮味、咸味和苦味，同時(shí)降低酸味，有助于產(chǎn)生整體愉悅的味道，而不是苦味。Chen等[31]發(fā)現(xiàn)一些不具有呈味特性的氨基酸可以增加整體的鮮味和甜味，或者與其它物質(zhì)產(chǎn)生協(xié)同作用。因此，探究紅鰭笛鯛魚排不同酶解液中氨基酸組成和含量，對(duì)于研究酶解液呈味特性和應(yīng)用具有重要意義。

2.3 紅鰭笛鯛魚排酶解液感官評(píng)價(jià)結(jié)果

紅鰭笛鯛魚排酶解液感官評(píng)分見表5。

表5 紅鰭笛鯛魚排酶解液感官評(píng)分Table 5 Scores of sensory evaluation for crimson snapper frame hydrolysates

對(duì)4種酶解液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)4種酶解液都具有鮮味、苦味、醇厚味及澀味，基本無咸味或甜味，整體喜好度較高，說明酶解過程中蛋白酶對(duì)紅鰭笛鯛魚排中的蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)進(jìn)行作用并產(chǎn)生了呈味肽及呈味氨基酸，綜上蛋白酶具有一定的增味效果。從酶解液的鮮味評(píng)分來看，風(fēng)味蛋白酶＞中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶（P＜0.05）；從酶解液的苦味評(píng)分來看，木瓜蛋白酶＞堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶（P＜0.05）。這與蛋白酶的水解作用方式有關(guān)[32]，根據(jù)切割位點(diǎn)的不同，將蛋白酶分為內(nèi)切酶和外切酶。堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶屬內(nèi)切酶，通過作用于特定的切割位點(diǎn)將蛋白質(zhì)的肽鍵切斷之后，可能會(huì)暴露出位于蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的疏水基團(tuán)，疏水基團(tuán)往往呈現(xiàn)苦味，因而內(nèi)切酶作用下的酶解液呈味時(shí)具有較多的苦味。然而，風(fēng)味蛋白酶同時(shí)具有內(nèi)切酶和外切酶的特性，內(nèi)切酶暴露出疏水基團(tuán)后，外切酶從肽鏈末端切斷肽鍵，釋放一個(gè)氨基酸，不僅提高了蛋白質(zhì)的水解度，而且將苦味肽降解成氨基酸。綜上，在感官評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，風(fēng)味蛋白酶與中性蛋白酶呈現(xiàn)出較高的鮮味，具有類似烤魷魚、烤肉香味，且苦澀味較低，具有更高的整體喜好度，比較適用于制備海鮮調(diào)味品基料。

2.4 電子舌測定結(jié)果

紅鰭笛鯛魚排酶解液電子舌主成分分析見圖1。

圖1 紅鰭笛鯛魚排酶解液電子舌主成分分析Fig.1 Principal component analysis of electronic tongue of crimson snapper frame excretion hydrolysate

圖1顯示了不同蛋白酶酶解液的電子舌傳感器的主成分分析（principal component analysis，PCA）圖，圖中前二維主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)88.07%，高于75%，說明了PC1與PC2包含了PCA轉(zhuǎn)換中絕大部分的信息，提取的主成分能夠反映原來多指標(biāo)的信息，且電子舌能夠?qū)?種蛋白酶解液在滋味方面存在的顯著差異進(jìn)行完全區(qū)分[33]。不同樣品之間的距離可以通過判別指數(shù)表示，相同樣品散點(diǎn)越聚攏，判別指數(shù)越小，表明平行樣品之間差異性越??；不同的樣品之間互相沒有重疊，表明樣品之間具有差異性，判別指數(shù)越大說明樣品之間的差異性越大。以不同濃度梯度的NaCl和MSG作為判別指數(shù)中的參比溶液，根據(jù)不同濃度的NaCl和MSG來確定樣品的咸味和鮮味的滋味強(qiáng)度。由圖1可知，中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶解液與MSG之間判別指數(shù)最小，表明與MSG的呈味特性最為接近，從感官評(píng)價(jià)結(jié)果來看，風(fēng)味蛋白酶鮮味評(píng)分較高，結(jié)果與感官評(píng)價(jià)基本一致。易宇文等[34]以魚香調(diào)味汁為研究對(duì)象，分析了人工感官評(píng)價(jià)與電子舌感官之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，人工感官評(píng)價(jià)結(jié)果與電子舌傳感器之間具有良好的一致性。

3 結(jié)論

采用電子舌與感官評(píng)價(jià)相結(jié)合的方式對(duì)紅鰭笛鯛魚排酶解呈味肽進(jìn)行評(píng)價(jià)，并且對(duì)4種酶解液進(jìn)行氨基酸組分分析，同時(shí)測定其水解度與多肽含量。在水解度與多肽含量的測定試驗(yàn)中，風(fēng)味蛋白酶的水解度與多肽含量高于其它3種酶；由氨基酸組分分析結(jié)果可知，就鮮味組分占比，中性蛋白酶最高，其次是木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶；苦味組分占比，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶最高，其次是堿性蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶苦味氨基酸含量最低；感官評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，4種蛋白酶都具有一定的鮮味特性，就苦味特性而言，風(fēng)味蛋白酶的苦味遠(yuǎn)低于其它3種酶；通過電子舌主成分分析結(jié)果可知，中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶與MSG之間的判別指數(shù)最小，說明其呈味特性與MSG較接近。結(jié)果表明風(fēng)味蛋白酶是最適合紅鰭笛鯛魚排水解的蛋白酶。其鮮味濃郁，類似烤魷魚、烤肉香味，是感官評(píng)價(jià)最高的酶解液，為下一步制作海鮮調(diào)味品基料提供了一定的理論依據(jù)。