錢 雯,楊冬芝

(徐州醫(yī)科大學 藥學院,徐州 221004)

嗎啡是具有菲環(huán)結(jié)構(gòu)的生物堿,含有酚羥基和叔胺基基團,是兩性化合物。嗎啡與酸形成鹽類化合物,常見的有硫酸嗎啡和鹽酸嗎啡。硫酸嗎啡是一種強效止痛藥,可激動中樞神經(jīng)系統(tǒng)的阿片受體,選擇性地抑制興奮性神經(jīng)沖動傳遞,解除機體對疼痛的感受[1],廣泛應(yīng)用于緩解癌癥晚期病人的癌痛及手術(shù)陣痛和控制慢性疼痛[2-4]。硫酸嗎啡制劑主要有注射液、片劑和緩釋片。

嗎啡及其鹽類化合物在光照條件下易被空氣氧化,生成毒性較大的偽嗎啡[結(jié)構(gòu)見圖1(a)]和N-氧化嗎啡[結(jié)構(gòu)見圖1(b)][5-7]。除此之外,在從阿片中提取嗎啡的過程中,還會由于分離純化不完全而引入雜質(zhì)可待因[結(jié)構(gòu)見圖1(c)][8-9]。原料藥的純度和雜質(zhì)含量會影響制劑藥品的藥效,甚至引起不良反應(yīng),因此在用硫酸嗎啡原料制備硫酸嗎啡制劑時,必須嚴控偽嗎啡、N-氧化嗎啡和可待因的含量。

圖1 偽嗎啡、N-氧化嗎啡和可待因的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of 2,2-bimorphine,morphine N-oxide and codeine

目前,《中華人民共和國藥典》(2020年版)(簡稱Ch P 2020)二部中雖然收錄了硫酸嗎啡原料藥,但缺乏有關(guān)物質(zhì)檢測項。該藥典關(guān)于硫酸嗎啡緩釋片的有關(guān)物質(zhì)的檢測方法中,僅給出了硫酸嗎啡的保留時間(約11 min),缺少偽嗎啡、N-氧化嗎啡和可待因定性參數(shù)和校正因子的描述。美國藥典USP43和歐洲藥典EP9.0規(guī)定了嗎啡及嗎啡制劑的有關(guān)物質(zhì)的檢測方法(高效液相色譜法),但該檢測方法進樣時間較長(60 min),不利于樣品的大批量分析和日常質(zhì)量研究。近期的相關(guān)文獻在考察嗎啡及其制劑的質(zhì)量及穩(wěn)定性時僅考察了嗎啡含量的變化[10-14],并沒有關(guān)注偽嗎啡、N-氧化嗎啡和可待因。

本工作通過優(yōu)化色譜條件,建立了超高效液相色譜法(UHPLC)測定硫酸嗎啡原料藥中的偽嗎啡、N-氧化嗎啡和可待因含量的方法,以期為硫酸嗎啡的質(zhì)量控制提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

H-Class型超高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器(DAD)和Empower3色譜工作站;CPA225D型電子天平;FE28型pH 計。

混合標準溶液:取適量硫酸嗎啡對照品、100 mg·L－1N-氧化嗎啡標準溶液、偽嗎啡對照品和磷酸可待因?qū)φ掌?用30%(體積分數(shù),下同)甲醇溶液溶解并稀釋制成10.00 mg·L－1的混合標準溶液。

系統(tǒng)適用性溶液:取硫酸嗎啡原料藥約10 mg和100 mg·L－1N-氧化嗎啡標準溶液1 mL,用30%甲醇溶液溶解并定容至5 mL。

硫酸嗎啡對照品純度為87.3%;N-氧化嗎啡標準溶液的質(zhì)量濃度為100 mg·L－1;偽嗎啡對照品純度為91.5%;磷酸可待因?qū)φ掌芳兌葹?6.9%;甲醇、乙腈和庚烷磺酸鈉均為色譜純;其余試劑為分析純;試驗用水為超純水。

硫酸嗎啡原料藥的批號分別為20180304、20170401、20140707。

1.2 儀器工作條件

Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),柱溫25 ℃;流量0.2 mL·min－1;檢測波長230 nm;進樣量1μL。流動相A 為含2.02 g·L－1庚烷磺酸鈉的磷酸溶液(pH 2.5),B 為甲醇;梯度洗脫:0～15 min 時,A 由70%降至50%,保持2 min;17～18 min 時,A 由50%升至70%,保持7 min。

1.3 試驗方法

取硫酸嗎啡原料藥約20 mg,用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,得到供試品溶液,供UHPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相

ChP 2020中測定硫酸嗎啡緩釋片有關(guān)物質(zhì)含量的方法為等度高效液相色譜法,采用的流動相體系為甲醇-含庚烷磺酸鈉的乙酸溶液(pH 2.5)?；诖?試驗選擇甲醇-含庚烷磺酸鈉的磷酸溶液(pH 2.5)為流動相,用磷酸代替乙酸的原因為磷酸的截止波長更小,基線噪聲更小,且雜質(zhì)的測定下限更低[15]。

2.1.2 檢測波長

ChP 2020中測定硫酸嗎啡緩釋片有關(guān)物質(zhì)含量的方法選用的檢測波長為233 nm,但本試驗用DAD 在波長210～400 nm 內(nèi)掃描時發(fā)現(xiàn),硫酸嗎啡的最大吸收波長為285 nm,N-氧化嗎啡的最大吸收波長分別為210,285 nm,可待因的最大吸收波長分別為211,285 nm,偽嗎啡的最大吸收波長為230 nm。綜合考慮各物質(zhì)的響應(yīng)強度,試驗選擇的檢測波長為230 nm。

2.1.3 定性方法和梯度洗脫程序

參考ChP 2020中測定硫酸嗎啡緩釋片有關(guān)物質(zhì)含量的方法,比對供試品溶液和混合標準溶液的色譜峰,以保留時間(硫酸嗎啡、N-氧化嗎啡、偽嗎啡和可待因的保留時間分別為4.5,4.3,11.4,6.8 min)和紫外吸收特征峰對供試品溶液中N-氧化嗎啡、偽嗎啡和可待因進行定性。

ChP 2020采用的洗脫方法為等度洗脫,偽嗎啡的出峰時間約為嗎啡峰的4.5倍,且峰展寬現(xiàn)象嚴重,柱效低,降低了偽嗎啡的檢出靈敏度。經(jīng)過反復(fù)試驗,本方法選擇以梯度洗脫程序進行分離,可使偽嗎啡出峰時間提前,峰形變尖,靈敏度變高。

2.2 專屬性試驗

嗎啡(硫酸嗎啡在色譜體系中即為嗎啡)與N-氧化嗎啡峰的出峰時間比較接近,故按照儀器工作條件測定系統(tǒng)適用性溶液,以考察本方法對這兩種物質(zhì)的分離效果,色譜圖見圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of system suitability solution

由圖2可知,嗎啡與N-氧化嗎啡峰的分離度為1.8,大于1.5,說明二者可實現(xiàn)完全分離。

為了考察方法在不同降解條件下的適用性,取批號為20180304的硫酸嗎啡樣品10 mg各6份,分別在6組條件下進行降解試驗:①直接用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,作為不降解組;②加入0.1 mol·L－1鹽酸溶液1 mL,室溫放置2 h后,用0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液1 mL 中和,用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,作為酸降解組;③加入0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液1 mL,室溫放置2 h后,用0.1 mol·L－1鹽酸溶液1 mL中和,用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,作為堿降解組;④加入30%(質(zhì)量分數(shù))過氧化氫溶液1 mL,放置30 min,用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,作為氧化降解組;⑤先用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,再在60 ℃水浴中加熱2 h,作為高溫降解組;⑥先用30%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,再在(4 500±500)lx 下光照48 h,作為光照降解組。上述所得溶液按照儀器工作條件測定,結(jié)果見圖3。

圖3 樣品經(jīng)不同條件降解后的色譜圖Fig.3 Chromatograms of samples degraded under different conditions

由圖3可知,不降解和在不同降解條件下硫酸嗎啡原料藥均會生成偽嗎啡,生成含量按照從大到小的順序依次為氧化降解組、光照降解組、堿降解組、酸降解組、高溫降解組和不降解組;在氧化條件下,偽嗎啡還會生成降解雜質(zhì)N-氧化嗎啡(曲線d);生成的降解雜質(zhì)與主峰的分離效果均較好,說明本方法具有良好的專屬性。

2.3 色譜行為

按照儀器工作條件測定混合標準溶液,所得色譜圖見圖4。

圖4 混合標準溶液的色譜圖Fig.4 Chromatogram of the mixed standard solution

由圖4可知,N-氧化嗎啡、嗎啡、偽嗎啡和可待因色譜峰峰形良好,且可實現(xiàn)完全分離。

當N-氧化嗎啡、偽嗎啡和可待因?qū)φ掌坊驑藴嗜芤簾o法獲得時,可采用加校正因子的主成分自身對照法計算N-氧化嗎啡、偽嗎啡和可待因含量(乘以校正因子)。校正因子(f)為硫酸嗎啡和各雜質(zhì)的標準曲線斜率之比,N-氧化嗎啡、偽嗎啡和可待因相對于硫酸嗎啡的校正因子分別為1.03、0.24和0.93。

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

用30%甲醇溶液分別配制30.00 mg·L－1的硫酸嗎啡、N-氧化嗎啡、偽嗎啡和可待因標準溶液。分別取硫酸嗎啡、N-氧化嗎啡、偽嗎啡和可待因標準溶液各1,2,3,4,5,8,10 mL,用30%甲醇溶液定容至10 mL,制 得3.00,6.00,9.00,12.00,15.00,24.00,30.00 mg·L－1硫酸嗎啡和各雜質(zhì)標準溶液系列,按照儀器工作條件測定,4種目標物標準曲線的線性范圍均為3.00～30.00 mg·L－1,其他線性參數(shù)見表1。

分別以3 倍、10 倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 回收試驗

在硫酸嗎啡原料藥中加入含N-氧化嗎啡、偽嗎啡和可待因各30.00 mg·L－1的混合標準溶液1,3,5 mL,每種加標水平平行測定3次,計算得N-氧化嗎啡、偽嗎啡和可待因的回收率分別為99.1%,99.6%和98.3%。

2.6 精密度試驗

2.6.1 重復(fù)性

按照試驗方法重復(fù)測定10 mg·L－1混合標準溶液6次,結(jié)果顯示,硫酸嗎啡、N-氧化嗎啡、偽嗎啡和可待因測定值的相對標準偏差(RSD)分別為0.24%,0.59%,0.33%和0.43%。

按照試驗方法平行分析硫酸嗎啡原料藥6次,結(jié)果顯示,N-氧化嗎啡、偽嗎啡、可待因測定值的RSD 分別為1.2%,1.2%和2.1%。

2.6.2 穩(wěn)定性

將混合標準溶液在25 ℃分別放置0,2,7,10,24 h后進樣,按照儀器工作條件測定,結(jié)果顯示,N-氧化嗎啡、硫酸嗎啡、偽嗎啡和可待因測定值的RSD 分別為1.5%,0.64%,0.81%和1.1%,表明混合標準溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品分析

按照試驗方法分析3 批硫酸嗎啡原料藥(20180304、20170401、20140707),N-氧化嗎啡和可待因的檢出量均低于測定下限,偽嗎啡的檢出量分別 為0.08%,0.09%,0.09%。

本工作建立了硫酸嗎啡有關(guān)物質(zhì)的檢測方法,能夠定量分析硫酸嗎啡原料藥中的N-氧化嗎啡、偽嗎啡和可待因。方法準確、便捷、快速,可為硫酸嗎啡中有關(guān)物質(zhì)的測定提供參考。