陳釀玫瑰酵素理化特性及抗氧化活性

魏雪琴 ，黃珍珍，劉芳，程潔遠，龐杰

1.武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院（武夷山 354300）；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院博士后流動站（福州 350002）

2019年7 月起實施的QB/T 5324—2018《酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則》明確將酵素（Jiaosu）定義為是以動物、植物、菌類等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品；同步實施的QB/T 5323—2018《植物酵素》中規(guī)定，以可用于食品加工的植物為主要原料制得的可供人類食用的酵素稱為食用植物酵素（edible plant Jiaosu）。近年，食用植物酵素已在中國、日本及其他亞洲國家地區(qū)盛行[1]。以新鮮果蔬、菌菇、中草藥等單一或復(fù)合植物為原料，經(jīng)多種益生菌發(fā)酵而成的酵素含有豐富的維生素、氨基酸、多糖、多酚、酶、礦物質(zhì)和微生物次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分[2-3]，并具有抗氧化、抗菌消炎、調(diào)節(jié)腸道菌群、解酒、減肥、增強機體免疫能力等多種功能[4-8]。2019年，國家發(fā)展和改革委員會將“酵素生產(chǎn)工藝技術(shù)開發(fā)及工業(yè)化、規(guī)范化生產(chǎn)”列入《產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整指導(dǎo)目錄（2019年本）》鼓勵類，作為新興的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，酵素越來越受到產(chǎn)業(yè)界和學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注。

玫瑰（Rosa rugosaThunb.）是薔薇科薔薇屬直立落葉灌木，兼具觀賞、藥用、食用和飲用等價值[9]。據(jù)《本草綱目拾遺》記載：“玫瑰花活血、行血、健脾降火、理氣調(diào)經(jīng)、滋補養(yǎng)顏”?，F(xiàn)代研究表明，玫瑰花瓣富含多酚與黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎等功能[10-11]。目前，以玫瑰為原料開發(fā)的發(fā)酵產(chǎn)品主要有玫瑰酵素、玫瑰醬、玫瑰酒、玫瑰醋等，其中玫瑰酵素附加值高，市場潛力巨大。

傳統(tǒng)酵素生產(chǎn)偏向采用能有效保留原料活性物質(zhì)的自然發(fā)酵工藝，通過添加蜂蜜、紅糖或白糖等外源碳源提高酵素營養(yǎng)價值及功效，發(fā)酵周期一般為幾個月至2年不等[12-14]。據(jù)報道，松針酵素陳釀期間，各組分經(jīng)氧化還原、酯化、縮合、聚合等復(fù)雜生理生化反應(yīng)，其營養(yǎng)成分會發(fā)生增加與減少，其中發(fā)酵2年的松針酵素營養(yǎng)價值最高[15]；添加富含還原糖的蜂蜜制備的葡萄酵素，其酵母菌數(shù)量增長速度及最大細胞濃度顯著高于添加紅糖和白糖組[13]。目前以蜂蜜為碳源的陳釀玫瑰酵素研究鮮見報道[16]。以新鮮玫瑰花瓣為原料，通過添加蜂蜜進行2年自然發(fā)酵，獲得陳釀玫瑰酵素，測定其理化成分、酶活力及其體外抗氧化活性，并與按相同發(fā)酵工藝制備的洛神花酵素和相同陳釀期的市售玫瑰酵素進行比較分析，以期科學(xué)評價陳釀玫瑰酵素的理化品質(zhì)和抗氧化能力，并為高附加值玫瑰酵素產(chǎn)品研發(fā)及玫瑰酵素功能性評價研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁、沒食子酸標準樣品（色譜純，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；福林酚試劑，上海麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海藍季生物有限公司。總蛋白定量測試盒（BCA法）、過氧化氫酶（CAT）測試盒（可見光法）、α-淀粉酶（AMS）測試盒（碘-淀粉比色法）、總抗氧化能力（T-AOC）測試盒，自南京建成生物工程研究所。其余化學(xué)藥品均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。蜂蜜，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；HI 2221型pH計（意大利HANNA公司）；BSA224S型電子分析天平（德國賽多利斯集團）；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海慧泰儀器制造有限公司）；SB-25-12DT型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；GZY-P20-Y型超純水機（湖南科爾頓水務(wù)有限公司）；Neofuge 15R型高速冷凍離心機（香港力康生物醫(yī)療科技）；移液槍（德國Brand公司）；ABSON MixPlus型渦旋振蕩器（合肥艾本森科學(xué)儀器公司）。

1.3 方法

1.3.1 酵素的制備

將新鮮玫瑰花花瓣、蜂蜜和水按1∶3∶10的質(zhì)量比裝桶混合進行室溫發(fā)酵。經(jīng)第1個月定期排氣并攪拌后，密封，自然發(fā)酵2年，離心，室溫貯藏備用。按照相同工藝制備洛神花酵素。同時，選購市售玫瑰酵素和果蔬酵素進行平行對比試驗。市售酵素的具體信息如表1所示。

表1 市售酵素試樣信息

1.3.2 基本理化指標測定

pH：采用pH計直接測定。

總酸的測定：采用電位滴定法，參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，結(jié)果以g乳酸/kg表示。

粗多糖的測定：采用苯酚-硫酸法，參照SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定》，測定波長為490 nm，以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，μg/mL），以吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.003 8x-0.002 2，R2=0.999 7。酵素樣品測定參照標準曲線繪制方法測定吸光度，并代入回歸方程計算不同酵素試樣中的粗多糖含量，每組做3個重復(fù)。

總蛋白的測定：采用BCA法，取20 μL稀釋的酵素離心上清液，按照試劑盒說明書進行具體操作，測定波長為562 nm。

1.3.3 總酚的測定

采用Folin-Ciocalteu比色法[17]，分別準確吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL 12 μg/mL的沒食子酸標準溶液，加水補足至5.5 mL后，分別加入2.5 mL 10%（V/V）的入福林酚試劑以及2 mL 7.5 mg/mL的Na2CO3溶液，在45 ℃水浴中反應(yīng)15 min后，充分振蕩混勻，常溫避光靜置1 min后，在波長765 nm處測定吸光度。以沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，μg/mL），以吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.02x+0.000 2，R2=0.999 1。樣品測定：取5.5 mL稀釋的酵素離心上清液，按上述相同步驟操作，將測定的吸光度代入回歸方程計算不同酵素試樣中的總酚含量，每組做3個重復(fù)。

1.3.4 總黃酮含量測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法，分別準確吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL 0.15 mg/mL蘆丁標準溶液，用30%的乙醇補足至5.0 mL后，加入0.5 mL 5% NaNO2溶液，振蕩均勻，靜置6 min；再加入0.5 mL 10% Al(NO3)3溶液，振蕩均勻，靜置6 min；最后加入3.0 mL 4% NaOH溶液，振蕩混勻后，靜置15 min，在510 nm處測定吸光度。以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，mg/mL），以吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：y=6.623 8x+0.001 4，R2=0.999 2。樣品測定：取5.0 mL稀釋的酵素離心上清液，按上述相同步驟操作，將測定的吸光度分別代入回歸方程計算不同酵素試樣中的總黃酮質(zhì)量分數(shù)，每組做3個重復(fù)。

1.3.5 酶活力測定

超氧化歧化酶（SOD）：采用鄰苯三酚自氧化法，參照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》進行測定。

過氧化氫酶（CAT）活力測定：取100 μL稀釋的酵素離心上清液，按照CAT測試盒說明書進行具體操作，測定波長為405 nm，其中酶活力定義：1 mL試樣溶液每秒鐘分解1 μmol的過氧化氫的量為一個酶活力單位（U），酵素試樣中CAT活力以U/L表示。

α-淀粉酶（AMS）活力測定：取100 μL稀釋的酵素離心上清液，按照AMS測試盒說明書所采用的碘-淀粉比色法進行具體操作，在660 nm波長處測定吸光度，其中酶活力定義：100 mL試樣溶液中的AMS，在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉為一個酶活力單位（U），酵素試樣中AMS活力以U/L表示。

1.3.6 總抗氧化能力（T-AOC）活力測定

取100 μL離心后的酵素原液，按照T-AOC測定試劑盒說明書進行具體操作，測定波長為520 nm。在37℃時，每分鐘每毫升試樣溶液使反應(yīng)體系的吸光度每增加0.01，計為一個總抗氧化能力單位。酵素試樣中總抗氧化能力以U/mL表示。

1.3.7 DPPH自由基清除能力測定

取0.5 mL各稀釋梯度的酵素試樣溶液加至試管中，然后向每管加入2.5 mL 0.35 mg/mL的DPPH乙醇溶液，用渦旋混合器充分混勻，于37 ℃避光水浴30 min后在517 nm下測定吸光度。以乙醇做空白對照，蒸餾水調(diào)零。DPPH 自由基清除率按式（1）計算：

式中：A0為樣品液+乙醇的吸光度；A1為DPPH乙醇溶液+樣品液的吸光度；A2為DPPH乙醇溶液+乙醇的吸光度。

1.3.8 還原能力測定

釆用普魯士藍法進行測定，分別取1.0 mL不同體積分數(shù)的酵素溶液，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液，2.5 mL 0.01 mol/L鐵氰化鉀溶液，依次混勻后，于50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 0.1 mol/L三氯乙酸溶液，靜置10 min，取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸餾水及1 mL 0.001 mol/L三氯化鐵溶液，搖勻后在波長700 nm處測定吸光度。吸光度越高，還原力越強。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用PASW statistics 18.0軟件進行方差分析和Duncan’s多重比較差異顯著性檢驗，顯著性水平p＜0.05，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（Mean±SD）。采用Origin 9.6b軟件繪制圖表和數(shù)據(jù)擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本理化指標

表2示出陳釀玫瑰酵素與洛神花酵素、市售玫瑰酵素、市售果蔬酵素的基本理化指標。由表2可知，玫瑰酵素的pH、總酸和粗多糖濃度分別為3.40，17.02 g/kg和12.03 mg/mL，均符合QB/T 5323—2018《植物酵素》標準要求。酵素自然發(fā)酵過程屬于復(fù)雜的混菌發(fā)酵體系，發(fā)酵期間微生物代謝能將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)換為醇、酸等，使體系pH下降，總酸增加，粗多糖降低[15]。由表2可見，玫瑰酵素的總酸、粗多糖濃度顯著高于洛神花酵素、市售玫瑰酵素、市售果蔬酵素，說明玫瑰酵素與其他三種酵素在糖酸類物質(zhì)的積累與消耗方面的差異可能與原料品種及種類、發(fā)酵工藝、微生物菌群代謝作用不同有關(guān)。另外，玫瑰酵素的總蛋白質(zhì)量濃度為45.42 mg/mL，也顯著高于其他三種酵素，分別是洛神花酵素、市售玫瑰酵素和市售果蔬酵素蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的14，15和16倍?？梢姡灾脐愥劽倒褰退剌^其他三種酵素更富含多糖和蛋白質(zhì)。

表2 玫瑰酵素及其他酵素的基本理化特性比較

2.2 總酚和總黃酮含量

黃酮及多酚類化合物是植物中具有抗氧化的天然活性物質(zhì)，可作為抗氧化劑提高機體清除自由基能力，植物經(jīng)微生物產(chǎn)生的酶類及有機酸等的作用后，其總酚和總黃酮濃度會增加[18-20]。從圖1可知，玫瑰酵素的總酚和總黃酮濃度均顯著高于洛神花酵素和市售酵素，兩種活性成分含量排序均為玫瑰酵素＞洛神花酵素＞市售玫瑰酵素＞市售果蔬酵素。其中，玫瑰酵素的總酚為6.55 mg/mL，分別是洛神花酵素（1.41 mg/mL）、市售玫瑰酵素（1.33 mg/mL）、市售果蔬酵素（0.60 mg/mL）的4.6，4.9和10.9倍；玫瑰酵素總黃酮濃度為1.55 mg/mL，分別是洛神花酵素（0.36 mg/mL）、市售玫瑰酵素（0.27 mg/mL）、市售果蔬酵素（0.11 mg/mL）的4.3，5.7和14.1倍，說明陳釀玫瑰酵素較其他三種酵素更具清除體內(nèi)自由基的潛能。黃玲艷等[21]對玫瑰花和洛神花的總酚和總黃酮進行對比，結(jié)果表明，玫瑰的總酚濃度是洛神花的3.9倍，總黃酮濃度是洛神花的1.9倍?？梢?，陳釀酵素總酚、總黃酮濃度的差異與原料本身所含的總酚、總黃酮濃度直接相關(guān)，而玫瑰酵素與市售玫瑰酵素活性成分差異可能是發(fā)酵工藝不同導(dǎo)致。

圖1 玫瑰酵素及其他酵素的總酚和總黃酮含量

2.3 酶活力

表3示出玫瑰酵素及其他酵素的SOD酶、淀粉酶及過氧化氫酶活力對比。由表3可知，玫瑰酵素SOD酶活力為25.72 U/mL，符合QB/T 5323—2018《植物酵素》中對食用植物酵素SOD酶活性的指標要求。玫瑰酵素SOD酶活力與市售玫瑰酵素相近，但低于洛神花酵素及復(fù)合發(fā)酵型的市售果蔬酵素。與表3中其他文獻數(shù)據(jù)比較，玫瑰酵素的SOD酶活力高于采用9種水果加白砂糖自然發(fā)酵1個月獲得的水果酵素[22]以及采用100種植物加白糖、紅糖自然發(fā)酵18個月制備的植物綜合酵素[23]，而低于添加酵母菌和植物乳桿菌發(fā)酵6個月的菠蘿酵素[24]。據(jù)報道，植入酵母菌、乳酸菌等微生物菌的發(fā)酵方式的酵素SOD酶活力高于自然發(fā)酵[23]，并且不同碳源及不同發(fā)酵時期酵素微生物生長代謝及生物活性的調(diào)節(jié)作用有所差異，如以紅糖為碳源的葡萄酵素SOD酶活力高于添加蜂蜜、白糖組[13]；菠蘿、木瓜、芒果、火龍果等單一水果自然發(fā)酵約4個月形成的酵素SOD酶活性達到峰值，繼續(xù)發(fā)酵至18個月其平均SOD酶活力降低約1.43倍[23]?？梢?，玫瑰酵素SOD酶活力與其他酵素的差異除與發(fā)酵原料有關(guān)外，可能還與發(fā)酵方式、發(fā)酵時間相關(guān)。

表3 玫瑰酵素及其他酵素酶活性

淀粉酶屬于消化酶類，消化酶類可作為食品補充劑添加到功能食品中，以提高產(chǎn)品的助消化能力[25]。玫瑰酵素的淀粉酶活力為453.39 U/L，高于洛神花酵素、市售玫瑰酵素、市售果蔬酵素及菠蘿酵素，但較水果酵素低。過氧化氫酶是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，可促進H2O2分解，使細胞免受H2O2的毒害[26]。由表3可知，玫瑰酵素的過氧化氫酶活力為154.70 U/L，高于洛神花酵素、市售玫瑰酵素、市售果蔬酵素，其中洛神花酵素未檢測出過氧化氫酶活力。與SOD酶活力相比，表3中所有酵素的淀粉酶、過氧化氫酶活力均較低。馮彥君等[26]研究發(fā)現(xiàn)，麥苗酵素的過氧化氫酶活力較其發(fā)酵前的勻漿液活力提高98.71%，但過氧化氫酶活力低于SOD酶活力，這與此次試驗結(jié)果吻合。

2.4 抗氧化活性

圖2示出玫瑰酵素與其他酵素的總抗氧化能力對比。由圖2可知，玫瑰酵素的總抗氧化能力為135.67 U/mL，顯著高于洛神花酵素（44.96 U/mL）、市售玫瑰酵素（72.77 U/mL）和市售果蔬酵素（4.44 U/mL），其中玫瑰酵素的總抗氧化能力是市售果蔬酵素的30.6倍。

圖2 玫瑰酵素及其他酵素的總抗氧化能力

圖3進一步示出玫瑰酵素與市售果蔬酵素的還原能力和清除DPPH自由基能力對比。由圖3可知，以市售果蔬酵素為參照，玫瑰酵素在更低的濃度范圍內(nèi)顯示出更強的還原能力和更高的DPPH自由基清除能力。通常，物質(zhì)的還原能力可作為其潛在抗氧化能力的重要體現(xiàn)。釆用普魯士藍法測定還原能力，吸光度越高，還原力越強。由圖3（a）可知，玫瑰酵素具有一定還原性，且在較低濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大其吸光度明顯增強，濃度由0.3%增加到1.8%，吸光度提高83.7%；而市售果蔬酵素濃度由4%提高到15%后，其吸光度僅提高22.6%。從圖3（b）可見，不同濃度玫瑰酵素具有不同程度清除DPPH自由基的能力，清除能力與濃度呈正相關(guān)。經(jīng)擬合計算，玫瑰酵素50%自由基清除率對應(yīng)的濃度（IC50）約為0.32%，遠低于市售果蔬酵素的IC50值（30.63%），說明玫瑰酵素抗氧化性遠高于市售果蔬酵素。這與總抗氧化能力和還原能力的測定結(jié)果一致。據(jù)報道，不同酵素的抗氧化能力差異與原料和發(fā)酵液代謝產(chǎn)物等的不同有關(guān)[27]，自然發(fā)酵過程中主要以乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等益生菌的代謝為主[28]，不同的發(fā)酵菌種產(chǎn)生的抗氧化酶類及菌種自身所具有的抗氧化能力的差異，會導(dǎo)致不同酵素呈現(xiàn)出不同的抗氧化性能；植物經(jīng)微生物發(fā)酵后，其綜合抗氧化能力會顯著提高[20]，抗氧化能力的增加與多酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與代謝有關(guān)[29]，當發(fā)酵時間從360 d延長到720 d，酵素抗氧化性將趨于平衡[17]。綜上所述，玫瑰酵素較其他三種酵素具有更強的抗氧化能力，結(jié)合圖1及表2、表3結(jié)果，其原因可能是玫瑰酵素具有更高濃度的多糖、蛋白質(zhì)、總酚和總黃酮等活性物質(zhì)。

圖3 玫瑰酵素及市售酵素的DPPH自由基清除能力（a）和還原能力（b）

3 結(jié)論

對陳釀玫瑰酵素的基本理化指標、總酚和總黃酮含量、酶活力及抗氧化活性進行了分析。經(jīng)2年自然發(fā)酵獲得的玫瑰酵素綜合品質(zhì)良好，其中總酸、粗多糖、總蛋白、總酚和總黃酮濃度以及α-淀粉酶活力、過氧化氫酶活力、總抗氧化能力均顯著高于陳釀的洛神花酵素和市售酵素，還原能力和DPPH自由基清除能力高于市售果蔬酵素，SOD酶活力與市售玫瑰酵素相近。陳釀玫瑰酵素的其他活性成分和功能性評價仍需進一步深入研究。