腎陽(yáng)虛證陽(yáng)痿模型研究進(jìn)展

許家耀 郭江鑫 黃丹妮 覃秋韻 張紅參

【摘要】近年來(lái)關(guān)于腎陽(yáng)虛證陽(yáng)痿的病因、病理的研究基礎(chǔ)大多基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，篩選出符合中醫(yī)證候的動(dòng)物模型有利于深入研究腎陽(yáng)虛陽(yáng)痿本質(zhì)及治療方案。目前已知的動(dòng)物模型可分為中醫(yī)傳統(tǒng)病因模型和西醫(yī)病理模型，模型間各有優(yōu)劣，且驗(yàn)證動(dòng)物勃起障礙的檢測(cè)技術(shù)及評(píng)價(jià)方法尚未達(dá)成一致，因此歸納總結(jié)現(xiàn)有方法的優(yōu)劣對(duì)模型動(dòng)物的選擇具有一定的指導(dǎo)意義，使得實(shí)驗(yàn)成果更適用、惠及人類(lèi)。本文就各類(lèi)型腎陽(yáng)虛陽(yáng)痿動(dòng)物模型的構(gòu)建及驗(yàn)證作一綜述。

【關(guān)鍵詞】腎陽(yáng)虛證;陽(yáng)痿;動(dòng)物模型;研究進(jìn)展

基金項(xiàng)目：1.2020年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目：壯醫(yī)藥線鮮花葉透穴灸療法干預(yù)腎陽(yáng)虛型陽(yáng)痿小鼠的實(shí)驗(yàn)研究;2.2021年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目：壯醫(yī)鮮花葉透穴灸療法調(diào)控腎陽(yáng)虛型陽(yáng)痿大鼠S1P通路的分子表達(dá)機(jī)制;3.2021年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目：民族醫(yī)學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)孵化平臺(tái)。

目前腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型的研制涉及中醫(yī)病因?qū)W、病理、分子生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，筆者將對(duì)常用模型的證候生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行簡(jiǎn)單的敘述和討論，納入當(dāng)前一些造模的改進(jìn)方法，從病因和病理兩方面，以及腎陽(yáng)虛陽(yáng)痿模型的相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)目前所存在的問(wèn)題進(jìn)行闡述，以評(píng)價(jià)適宜中醫(yī)證型、實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的陽(yáng)痿模型，旨在為腎陽(yáng)虛證陽(yáng)痿的深入研究提供一定依據(jù)。

1.中醫(yī)傳統(tǒng)病因模型

1.1恐傷腎陽(yáng)痿模型

《素問(wèn)·舉痛論》曰：“恐則氣下，驚則氣亂”，恐為腎志，恐而精下，恐則精卻，恐懼過(guò)度可致腎精虧虛，氣機(jī)紊亂，導(dǎo)致腎藏精，主納氣功能失衡，進(jìn)而出現(xiàn)陽(yáng)痿、遺精等證候。沈氏首創(chuàng)“貓嚇鼠”“人嚇貓”及“鞭炮嚇狗”方法，研究發(fā)現(xiàn)驚恐可造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物睪丸、垂體、肝臟等部分腺體和臟器不同程度的損傷。但單一“貓嚇鼠”法隨實(shí)驗(yàn)延長(zhǎng)，貓會(huì)因長(zhǎng)時(shí)間捕獲失敗而趨于平靜，小鼠所受刺激也相應(yīng)減弱，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)效果，且每天需供1只老鼠喂貓，增加了實(shí)驗(yàn)成本。據(jù)此特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)盡量采取復(fù)合法造模。如采用心理應(yīng)激、束縛、尾懸掛、站臺(tái)、夾尾搏斗五種應(yīng)激模式依次安排7周內(nèi)，能夠較好地模擬外界環(huán)境，并得到了研究者們的普遍認(rèn)可。

1.2勞倦過(guò)度、房勞傷腎陽(yáng)痿模型

腎主生殖，房事過(guò)度，耗損腎精，日久則致陰缺陽(yáng)損，精氣不足，陽(yáng)痿不舉。閆氏將實(shí)驗(yàn)組雄鼠并置于30℃水中游至力竭后，每日每只雄鼠按1：6同籠于發(fā)情期雌鼠，迫使交配過(guò)度，連續(xù)42d。隨時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)了生殖機(jī)能低下為主要表現(xiàn)的腎陽(yáng)虛證，下丘腦—垂體—性腺軸（HPG軸）中GnRH、LH、FSH、T等下降顯著，且乳酸脫氫酶（LDH-x）活性明顯下降，同期研究表明下丘腦—垂體—腎上腺軸、甲狀腺軸損傷也符合公認(rèn)的腎陽(yáng)虛證病理改變。

1.3老年腎虛陽(yáng)痿模型

中醫(yī)古代醫(yī)家認(rèn)為腎臟精氣直接影響人的生殖能力，《素問(wèn)·上古天真論》：“丈夫，……七八，肝氣衰，筋不能動(dòng)，天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極?！毖悦髂凶?0歲以后，腎精虧虛或腎陽(yáng)匱乏，往往導(dǎo)致性功能異常，出現(xiàn)陽(yáng)痿。在傳統(tǒng)病因模型中，老齡陽(yáng)痿大鼠最接近人的發(fā)病狀態(tài)，且能降低因糖尿病、高血壓，AS等慢性病所致ED的干擾效果，因此研究者大多選用區(qū)間18-20月齡的老齡大鼠。

2.西醫(yī)病理模型

2.1藥物干預(yù)

2.1.1糖皮質(zhì)激素陽(yáng)痿模型

氫化可的松動(dòng)物模型是目前最常用的制造方法，原理在于氫化可的松使得垂體ATCH釋放減少，轉(zhuǎn)而抑制類(lèi)固醇激素的釋放，個(gè)體穩(wěn)態(tài)改變。林氏從行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了深入研究，氫化可的松造模結(jié)束后小鼠出現(xiàn)拱背、蜷曲、體重增長(zhǎng)減緩、畏寒肢冷、游泳存活率下降、交配能力減弱等“耗竭”現(xiàn)象;呂氏對(duì)SD大鼠按40mg/kg劑量連續(xù)21d肌注氫化可地松，模型組勃起率及勃起次數(shù)明顯下降，符合腎陽(yáng)虛征陽(yáng)痿證候，且模型組T、E2、T3、T4、ATCH的低水平表達(dá)，提示了下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）、甲狀腺（HPT）、性腺（HPG）軸不同程度的功能紊亂，靶腺軸激素的下調(diào)將影響陰莖血管收縮信號(hào)，進(jìn)而導(dǎo)致陽(yáng)痿。

2.1.2羥基脲陽(yáng)痿模型

羥基脲（Hu）可造成大鼠下丘腦-垂體-靶腺軸（腎上腺、甲狀腺、性腺）不同程度的功能紊亂，出現(xiàn)一系列陰損陽(yáng)虛癥狀。段氏配制羥基脲水溶液，375mg/kg·d劑量灌胃SD大鼠，連續(xù)17d，大鼠外在表現(xiàn)和行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與腎陽(yáng)虛相吻合，但腎上腺改變不明顯，睪丸減輕，T/E2下調(diào)顯著，因此可推斷羥基脲損傷性腺軸先是腎上腺軸，具有明顯的抑制作用，這可能與抑制睪丸細(xì)胞DNA合成，性激素水平降低密切相關(guān)，通過(guò)性腺軸對(duì)垂體的損害，進(jìn)而影響其他腺體功能，最終導(dǎo)致性功能低下。

2.1.3苯甲酸雌二醇陽(yáng)痿模型

Chen等對(duì)ICR小鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇（EB），劑量4mg/kg，15d后，小鼠出現(xiàn)一系列腎陽(yáng)虛體征（體重下降、肛溫降低、力量減弱、運(yùn)動(dòng)能力下降等），提示造模成功。經(jīng)治療后Chen發(fā)現(xiàn)除腎上腺外，精囊和睪丸OBI（臟器-體重指數(shù)）不能完全恢復(fù)正常水平，提示造模藥物對(duì)性腺軸較為敏感。蘇氏采用雄性SD大鼠腹腔注射EB（2mg/kg）連續(xù)10d，模型鼠GnRH、FSH、LH、T、E2改變顯著，當(dāng)藥量加至5mg/kg時(shí)，HE染色顯示生精小管罕見(jiàn)精子存活。

2.1.4氨基導(dǎo)眠能陽(yáng)痿模型

氨基導(dǎo)眠能（AG）為3β-脫氫酶及11β-羥化酶的阻滯劑，能抑制膽固醇向孕烯醇酮的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而阻滯腎上腺甾體激素的合成與降解代謝，通過(guò)AG灌胃Wistar大鼠10mg/只，持續(xù)7周，使得動(dòng)物腎上腺萎縮、減輕，雄激素，皮質(zhì)醇分泌減少，交配能力減弱，可構(gòu)建符合下丘腦-垂體-腎上腺、性腺軸衰退的腎陽(yáng)虛陽(yáng)痿模型。

2.1.5腺嘌呤陽(yáng)痿模型

作為使用率僅次于氫化可的松模型的造模方法，當(dāng)機(jī)體攝入大劑量腺嘌呤時(shí)，高水平的腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下會(huì)轉(zhuǎn)變成極難溶解的2，8-羥基腺嘌呤，堆積于腎小管與腎間質(zhì)部位，阻塞腎小管，出現(xiàn)“大白腎”現(xiàn)象，腺嘌呤代謝產(chǎn)物的毒性作用誘發(fā)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝障礙，能量代謝失衡使得HPA、HPT、HPG三軸失衡低下，進(jìn)而損傷腎臟和翠丸生殖細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞，模型動(dòng)物呈腎陽(yáng)虛陽(yáng)痿表現(xiàn)?；仡櫻芯堪l(fā)現(xiàn)，腺嘌呤難溶于水，給藥劑量難以統(tǒng)一，為保證模型穩(wěn)定性和成功率，造模周期往往長(zhǎng)達(dá)一月之久。隨著研究深入，賈氏加入阿拉伯膠作為助溶劑進(jìn)行改良，以50mg/（kg·d）劑量，灌胃12d后，大鼠出現(xiàn)“大白腎”現(xiàn)象，且損傷呈不可逆性改變，學(xué)者[16]們按50-100mg/（100g·d）劑量持續(xù)灌胃10-20d，可造成大鼠漸重性的生殖損傷，并發(fā)勃起障礙。

2.1.6雷公藤多甙陽(yáng)痿模型

中藥雷公藤具有抗炎、抗腫瘤及抗生育等藥理作用，其提取物雷公藤多甙片被廣泛應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)研究中，有學(xué)者連續(xù)30d按20mg/kg劑量，模型大鼠表現(xiàn)出蜷縮、精神萎靡、畏寒肢冷，生殖功能低下等腎陽(yáng)虛體征，IHC顯示生殖腺NOS表達(dá)減少，這將影響NO生成，細(xì)胞外Ca+內(nèi)流增加，陰莖血管收縮，血流減少，ED發(fā)生率大大增加。

2.1.7硫脲類(lèi)陽(yáng)痿模型

硫脲類(lèi)藥物（他巴唑、丙基硫氧嘧啶、甲基硫氧嘧啶）能有效抑制HPT軸，與丙基硫氧嘧啶、甲基硫氧嘧啶相比，他巴唑副作用最小，單日大劑量給藥不良反應(yīng)少，成模效果佳，穩(wěn)定性好，應(yīng)用廣泛，常用于構(gòu)建甲功低下型腎陽(yáng)虛模型。

2.2手術(shù)干預(yù)

2.2.1腎上腺去勢(shì)陽(yáng)痿模型

通過(guò)手術(shù)次全切或雙側(cè)全切腎上腺，隨著大鼠腎陽(yáng)虛證愈發(fā)明顯，ED風(fēng)險(xiǎn)增加顯著，其機(jī)制較為復(fù)雜。以雄激素為例，大鼠陰莖勃起具有雄激素依賴(lài)性，去勢(shì)法在抑制HPA軸的同時(shí)也切斷了HPG軸的反饋途徑，T下降幅度次全切低于全切且實(shí)驗(yàn)證明動(dòng)物陰莖NOS蛋白的表達(dá)明顯減少，NO/cGMP通路阻滯，對(duì)性刺激減敏，最終引發(fā)陽(yáng)痿。

2.2.2甲狀腺去勢(shì)陽(yáng)痿模型

經(jīng)手術(shù)切除甲狀腺的大鼠可表現(xiàn)畏寒、肢冷、性欲低下等腎陽(yáng)虛陽(yáng)痿體征，研究發(fā)現(xiàn)去勢(shì)模型普遍表現(xiàn)出勃起障礙，雖然HPT軸的變化會(huì)導(dǎo)致HPA軸發(fā)生偏差，但其影響機(jī)制目前尚不清楚。

2.2.3性腺去勢(shì)陽(yáng)痿模型

根據(jù)“腎藏精，主生殖”理論，生殖損傷作為腎陽(yáng)虛證的一個(gè)重要體征，人為去除大鼠雙側(cè)睪丸能夠模擬出性器官發(fā)育異常、精子質(zhì)量下降、勃起次數(shù)下降等生殖損傷。雖然體內(nèi)睪酮仍可由腎上腺分泌，但占比不大（5%），因此不建議藥物的反證試驗(yàn)。

3.腎陽(yáng)虛證陽(yáng)痿的評(píng)價(jià)方法

3.1腎陽(yáng)虛證

3.1.1癥狀

模型動(dòng)物可見(jiàn)體重下降、體溫降低、毛稀疏、大便稀溏、小便增多、反應(yīng)遲鈍、自主活動(dòng)減少、畏寒怕冷、游泳時(shí)間及耐凍能力明顯降低。

3.1.2生化指標(biāo)

血漿環(huán)磷酸腺苷含量相對(duì)降低，環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷含量相對(duì)升高;T3、T4降低，TSH含量升高，ACTH含量降低，血清皮質(zhì)醇濃度降低;T含量降低，E2含量降低等。

3.2 陽(yáng)痿

3.2.1 交配試驗(yàn)

作為現(xiàn)階段評(píng)價(jià)陽(yáng)痿的最常用試驗(yàn)之一，交配實(shí)驗(yàn)是將藥物誘導(dǎo)的發(fā)情期雌鼠與實(shí)驗(yàn)雄鼠放置同一籠子內(nèi)，保持環(huán)境安靜，光暗適中，借雄鼠爬跨、射精次數(shù)及射精潛伏期等指標(biāo)評(píng)價(jià)勃起功能。

3.2.2 阿撲嗎啡（APO）試驗(yàn)

阿撲嗎啡能夠激活多巴胺D1、D2受體，誘發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠產(chǎn)生陰莖勃起。鑒于其近100%的勃起成功率，學(xué)者們常選用80μg/kgAPO皮下注射于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頸部，觀察30min內(nèi)大鼠的勃起次數(shù)，進(jìn)而篩選陽(yáng)痿模型。

3.3.3 陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP）測(cè)定

通過(guò)手術(shù)暴露陰莖海綿體組織，穿刺針進(jìn)入左側(cè)海綿體竇，并連接壓力感受器;電刺激L5-S2脊髓節(jié)段誘發(fā)陰莖勃起，借助換能器測(cè)定陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP）。

4.討論

本文綜述了近20年相關(guān)陽(yáng)虛證陽(yáng)痿動(dòng)物模型的文獻(xiàn)，西醫(yī)病理模型居多，其中又以糖皮質(zhì)激素與腺嘌呤模型最為常見(jiàn)，而其他病理模型因針對(duì)性研究較少，缺乏成熟的理論支持，故其應(yīng)用價(jià)值尚待進(jìn)一步考證。

雖然藥物干預(yù)以其簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)被學(xué)者們大量引用。但也存在一些問(wèn)題：①單一性。藥物多數(shù)只能反應(yīng)臨床腎陽(yáng)虛的某一病理變化，如氫化可的松模型主要損傷腎上腺軸，羥基脲、苯甲酸雌二醇以及腺嘌呤主要損傷性腺軸，硫脲類(lèi)主要損傷甲狀腺軸。而腎陽(yáng)虛征涉及多個(gè)軸的紊亂，藥物的單一性使得動(dòng)物模型的構(gòu)建存在一定的局限性。②難溶性。類(lèi)似于羥基脲、腺嘌呤等不易溶于水的藥物，則不能保證動(dòng)物達(dá)成統(tǒng)一的模型效果，雖然可加入相關(guān)助溶劑，其助溶效果以及是否具備可行性往往需要進(jìn)一步驗(yàn)證說(shuō)明，這就導(dǎo)致大多建模劑量和給藥時(shí)間因研究者不同而出現(xiàn)差異。③副作用。羥基脲可引起動(dòng)物骨質(zhì)疏松等病理改變，腺嘌呤導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)不可逆的“大白腎”損傷，雷公藤制劑具有明顯的生殖蓄積毒性，這些藥物的副作用導(dǎo)致的個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不可忽視。④不規(guī)范。雷公藤制劑目前尚未統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)劑量與時(shí)相，造模周期長(zhǎng)且死亡率達(dá)40%以上，實(shí)驗(yàn)成本較高等諸多弊端使得該法可行性較低。硫脲類(lèi)目前只能模擬出甲狀腺軸的異常，對(duì)腎上腺、性腺軸影響不大。

手術(shù)去勢(shì)法中甲狀腺去勢(shì)可用于排除TH干預(yù)的特定陽(yáng)痿實(shí)驗(yàn)研究，但是，此法對(duì)操作要求較高，且死亡率較高，增加了實(shí)驗(yàn)成本，能否作為理想的腎陽(yáng)虛陽(yáng)痿模型還有待于進(jìn)一步考察。性腺去勢(shì)誘導(dǎo)陽(yáng)痿成功率最高，但研究表明睪丸切除術(shù)使得HPA軸對(duì)ATCH、CORH的反應(yīng)性上調(diào)，與一些學(xué)者的結(jié)論相悖[23]，針對(duì)性腺去勢(shì)陽(yáng)痿模型是否應(yīng)該納入腎陽(yáng)虛征范疇，有待于學(xué)者們進(jìn)一步討論研究。腎上腺去勢(shì)手術(shù)創(chuàng)傷大，工序繁瑣，術(shù)后恢復(fù)過(guò)長(zhǎng)（30天），該法應(yīng)用較少。這三種方法往往造成反饋平衡失調(diào)致動(dòng)物內(nèi)分泌水平與臨床腎陽(yáng)虛患者差異明顯，且靶腺缺如不利于藥物反證，總體而言采用率不如藥物干預(yù)。

傳統(tǒng)中醫(yī)模型更契合中醫(yī)病因病機(jī)，符合因果關(guān)系論，但因方法不同，各模型之間存在諸多問(wèn)題：①恐傷腎。成本高，過(guò)程繁瑣，量產(chǎn)不宜。②房勞傷腎。需要耗費(fèi)與實(shí)驗(yàn)雄鼠數(shù)倍的雌鼠協(xié)助建模，以保證同籠交配實(shí)驗(yàn)效果，而且小鼠的性活動(dòng)作為一種自主行為，難以控制，因此造模標(biāo)準(zhǔn)欠佳。③老年腎虛。造模時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1年之久，可操作性低，發(fā)情休息期與衰老期界限不明顯，故限制了該模型的應(yīng)用。

綜上所述，現(xiàn)有的造模法既有優(yōu)點(diǎn)，又有缺點(diǎn)，因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定更符合臨床證候的動(dòng)物模型至關(guān)重要。模型既要滿足中醫(yī)腎陽(yáng)虛的特色，還要滿足公認(rèn)的病理生理指標(biāo)，目前常用的判斷指標(biāo)有觀察動(dòng)物的形態(tài)表現(xiàn)、腎上腺、性腺和甲狀腺功能狀態(tài)、能量代謝等指標(biāo)，并且陽(yáng)痿作為腎陽(yáng)虛證的一個(gè)證候，如何進(jìn)行有效精準(zhǔn)的評(píng)價(jià)是研究順利開(kāi)展的前提。交配實(shí)驗(yàn)施行簡(jiǎn)便，但大鼠易受外周環(huán)境的影響，受驚而中斷交配，造成正常大鼠假陽(yáng)性結(jié)果。APO勃起實(shí)驗(yàn)雖然簡(jiǎn)易，但易受觀察者主觀影響，不同觀察者間可能造成結(jié)果差異。陰莖海綿體內(nèi)壓測(cè)定憑其標(biāo)準(zhǔn)化以及科學(xué)化可作為評(píng)價(jià)和篩選陽(yáng)痿模型的主要手段，已經(jīng)得到學(xué)術(shù)界的普遍認(rèn)可，但操作要求較高，所帶來(lái)的創(chuàng)傷隱患不利于藥物的療效驗(yàn)證。由此可見(jiàn)，篩選符合臨床指征的動(dòng)物絕非易事，如何構(gòu)建符合中醫(yī)病因、病性、病理概述，還要減少藥物反證影響因素的腎陽(yáng)虛陽(yáng)痿模型，仍需要廣大學(xué)者繼續(xù)探索，以便更好應(yīng)用于中醫(yī)藥研究的各個(gè)領(lǐng)域。

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