段學明

摘要：目的：針對在展開新型冠狀病毒核酸檢測時，樣本的混采對最終檢測結(jié)果造成的影響進行討論。方法：研究開展時間為2020年5月，將進行采集不超過24小時的核酸陰性拭子作為本次研究目標，采集樣本數(shù)量為10支。將10支拭子全部置于6ml病毒保存溶液中，進行充分混勻。混勻后以1∶2以及1∶10的比例稀釋。分別加入經(jīng)滅活操作的2019新冠病毒培養(yǎng)液中，來模擬10混1、5混1和單獨檢測。利用a試劑以及A-E 5種模板上樣量和檢測靈敏度均有差異的擴增試劑進行分別提取和擴增。結(jié)果：在模擬環(huán)境下，相同的混采樣本中，a提取模板中的單獨拭子檢測數(shù)據(jù)有明顯超前趨勢;在相同混采核酸模板中，A試劑的N基因檢測循環(huán)閾值相較于B試劑更提前。擴增體系中加入的10拭子核酸造成A試劑檢測閾值之后，B試劑則無任何影響。a試劑提取10混1的混采樣本后，C、D、E試劑擴增的檢測循環(huán)閾值相較于單獨檢測樣本更高。結(jié)論：混采過程中大量人基因組DNA會對提取和擴增效果進行干擾。在擴增樣本采集體積增強提取試劑時，在擴增試劑選擇上也要做出改善，選擇模板量上樣大的擴增劑可以在進行核酸檢測時提高靈敏性，避免漏檢。

關鍵詞：新型冠狀病毒;核酸采樣;核酸檢測

【中圖分類號】Q946.2???????????? 【文獻標識碼】A???????????? 【文章編號】2107-2306（2021）11--01

2019新型冠狀病毒肺炎始發(fā)于2019年12月的傳染性肺炎。其具有極強的傳染性，同時引起該病的病原體從未在人類流行病學中發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒。據(jù)數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，目前在大多數(shù)人群中該病毒的潛伏周期時長為1-14天，所以要對外出人員進行核酸檢測以及隔離措施，以便判斷其是否為新型冠狀病毒攜帶者。在進行核酸檢測過程中逐漸出現(xiàn)核酸檢測量大導致的檢測準確性以及檢測效率逐漸下降的現(xiàn)象。對此，我國針對這一現(xiàn)象出臺了新冠病毒核酸10混1混采技術規(guī)范，并在我國多地進行實施。本篇因研究對混采對核酸檢測結(jié)果造成的影響進行了評估，詳細內(nèi)容如下。

1資料與方法

1.1基礎資料

研究所使用的材料為滅活病毒培養(yǎng)液（經(jīng)65°持續(xù)熱滅活30min以上）、a核酸提取試劑以及A、B、C、D、E五種新冠病毒核酸檢測試劑。研究所使用儀器為數(shù)字PCR儀器、核酸提取儀器、擴增儀以及熒光定量PCR儀。

1.2方法

①對滅活病毒培養(yǎng)液進行定量檢測。②使用a提取5000拷貝數(shù)/ml的模擬混采樣本，利用A與B擴增提取產(chǎn)物。③對混采造成提取上的影響進行驗證：取6ml病毒保存液加入采集管中，將10支陰性咽拭子放入統(tǒng)一采集管中充分混勻，得到10混1樣本。再用VTM以1∶2和1∶10的比例將樣本進行稀釋，得到5混1樣本和單獨拭子樣本。將滅活病毒培養(yǎng)液進行稀釋后分別加至三份樣本中。使用a提取試劑進行樣本提取。同時利用A、B兩種核酸檢測試劑擴增提取產(chǎn)物。將不同時機提取的效率和混采對提取的影響進行數(shù)據(jù)比對。④對混采造成擴增上的影響進行驗證：將6mlVTM加入采集管中，將10支陰性拭子放入統(tǒng)一采集管并進行混勻。將滅活病毒培養(yǎng)液進行稀釋。利用a核酸提取試劑盒分別提取陰性拭子核酸以及病毒核酸，洗脫至1/2體積，得到拭子模板和病毒模板混合體。利用A、B兩種檢測試劑盒進行擴增。

1.3判定指標

比對在使用a試劑進行提取時，單獨拭子、10混1拭子以及5混1拭子的樣的循環(huán)檢測數(shù)據(jù)。

1.4統(tǒng)計學分析

試驗各指標均通過統(tǒng)計學軟件SPSS25.0檢驗，卡方比對計量資料（%）率;t值比對計數(shù)資料（均數(shù)±標準差）;如組間數(shù)據(jù)有差異（p<0.05）。

2結(jié)果

2.1將A、B試劑擴增模擬混采樣本循環(huán)檢測閾值進行數(shù)據(jù)比對

a試劑提取時，單獨拭子的檢測值相較于5混1余10混1比例來說明顯降低，數(shù)據(jù)組間呈現(xiàn)較明顯差距（P<0.05）。詳見表1。

3討論

新型冠狀病毒爆發(fā)相較既往出現(xiàn)過的疫情存在著潛伏期較長，且同時具有個體差異的特點。并且在傳播過程中通過不斷更換宿主，其結(jié)構可通過自身變化發(fā)生變異。故在防治過程中就出現(xiàn)了較大困難。根據(jù)傳染病學的防治原則，在傳播的阻斷過程中以“防大于治”為基礎方針。針對與患有新型冠狀病毒肺炎進行過密切接觸或與其進行過間接接觸的人員，對其進行隔離措施。但通過隔離無法立即得出其是否出現(xiàn)感染、是否為潛在攜帶者等結(jié)論。因此針對該問題，我國立即展開相應措施。新型冠狀病毒在對人體進行感染后，會先在其呼吸道中進行增殖，因此刻通過對人體呼吸道中的分泌物進行核酸檢測即可得出該患者是否為病毒攜帶者的結(jié)論。

在生物學角度中，所有碳基生物都有核酸這一物質(zhì)，是構成其生命組成的必要部分。在新型冠狀病毒引起的肺炎暴發(fā)后我國科學家立即對其核酸序列進行了解碼，并了解到其結(jié)構上存在的特異性。新型冠狀病毒檢測本質(zhì)是對病毒的RNA（核糖核酸）進行檢測的過程。除了通過檢查患者呼吸道分泌物這一途徑檢驗其是否為攜帶者以外，還可通過對其分辨、血液等標本進行檢驗。在進行新型冠狀病毒的核酸序列檢測時，通常應用熒光定量法進行檢驗，即聚合酶鏈式反應。檢驗過程中應用的PCR反應模板僅為單一脫氧核糖核酸（DNA）。因此應在進行反應前對新型冠狀病毒的核酸進行逆轉(zhuǎn)錄，使其與模板相同。在PCR反應體系中，存在著特意吸引物與相應探針。探針本質(zhì)為特異性寡核苷酸序列中的一段，其兩端分別標記了熒光報告基團以及淬滅熒光基團。在探針結(jié)構完好時，探針兩端上的基團會出現(xiàn)淬滅基團吸收報告基團的現(xiàn)象。當新型冠狀病毒反應體系存在靶序列時，反應探針與模板產(chǎn)生結(jié)合，DNA聚合酶會沿著末班對探針酶進行降解，探針兩端的基團分離，此時就會出現(xiàn)熒光效應。當DNA鏈進行擴增時熒光量也會隨之增加。因此的出結(jié)論，熒光定量法中，PCR檢測出的熒光達到的Ct數(shù)值與新型冠狀病毒的分子濃度存在負相管關系，即新冠狀病毒核酸的生物分子濃度越大，Ct值越小。在針對新型冠狀病毒進行檢驗的過程中，存在假陰性及假陽性的現(xiàn)象。這與病毒的增殖量、增殖速度、檢測試劑下限、試劑對病毒的檢測能力，敏感程度、采樣過程是否操作標準并符合規(guī)定等因素有密切聯(lián)系。

在進行核酸檢測時，采集樣本試劑、以及檢測材料都對檢測結(jié)果起到?jīng)Q定性作用。進行單人份核酸檢測時，可通過內(nèi)標基因檢測閾值來判斷檢測質(zhì)量。10混1采樣時，僅可以通過檢測閾值來進行判斷，無法對每一份樣本都進行檢測，因此更容易因采集樣本原因出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。

綜上所述，在進行核酸檢測時，其結(jié)果受到檢測試劑、檢測樣本等因素影響。試劑提取性更是混采時準確性的關鍵。在進行混采時，加樣量增大、提取效率高的提取試劑配合檢測靈敏度高的擴增試劑，可以在檢測時保證樣本檢出的準確性，極大程度降低漏檢幾率。漏檢率的降低在一定程度上對新型冠狀病毒的防治起到了意義，在避免出現(xiàn)陽性病例未檢出的情況的同時，一定程度上避免了潛在攜帶者由于通勤等原因造成的疫情暴發(fā)最終導致疫情難以控制等現(xiàn)象，間接減少了我國對疫情防控的壓力。在地方實驗室條件允許的情況下可以進行繼續(xù)應用。

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