副豬嗜血桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，王 艷，苗立中，李 峰

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis, HPS）屬于巴斯德桿菌科（Pasteurellaceae）嗜血桿菌屬家族成員，是定植于豬上呼吸道的一種共棲菌[1]，也是一種條件性致病菌，在豬只免疫力低下或受到應(yīng)激時(shí)會(huì)引起副豬嗜血桿菌?。ㄓ址Q為格拉澤氏病，Glasser's disease）。該病在全球范圍內(nèi)廣泛流行，常引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、胸膜炎和腦膜炎等。主要影響2周齡到4月齡的青年豬，死亡率較高，是當(dāng)前我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要細(xì)菌性疾病之一，常與病毒性疾病、免疫抑制性疾病發(fā)生混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前HPS有15個(gè)血清型，不同血清型菌株之間存在強(qiáng)毒力、中等毒力和無(wú)毒力等顯著差異，且各血清型之間交叉保護(hù)力弱，疫苗的免疫效果較差，從而加重了副豬嗜血桿菌病的流行[3]。另外，HPS常與其他細(xì)菌或病毒混合感染，給獸醫(yī)臨床診斷也帶來(lái)了困難。因此，迫切需要建立HPS的快速檢測(cè)技術(shù)。本文簡(jiǎn)要概述了副豬嗜血桿菌的最新實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展，以期為HPS的早期快速檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查和有效防控提供參考。

1 細(xì)菌分離與鑒定

HPS是一種多形態(tài)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴型、不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性短小桿菌。對(duì)HPS的分離培養(yǎng)和生化鑒定是HPS診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。然而該菌的分離培養(yǎng)較為困難，對(duì)病料、采集時(shí)間、培養(yǎng)基等都有較高的要求。一般應(yīng)選取臨床癥狀典型且未經(jīng)抗生素治療的病豬，無(wú)菌條件下采集病豬肺臟、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液、心包液和腦脊液等組織新鮮病料，接種于含1.5%NAD和5%血清的巧克力瓊脂培養(yǎng)基或TSA等培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)[4]，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，可以觀察到針尖大小、圓形、光滑濕潤(rùn)、灰白色半透明或無(wú)色透明、邊緣整齊的露珠樣小菌落。挑取單個(gè)菌落涂片后進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察可見(jiàn)革蘭氏陰性短小桿菌。葡萄球菌可產(chǎn)生V因子，需V因子的HPS可在其周圍生長(zhǎng)呈“衛(wèi)星現(xiàn)象”。挑取單個(gè)菌落水平劃線接種于不含NAD的綿羊鮮血平板上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察其在葡萄球菌周圍生長(zhǎng)情況，應(yīng)出現(xiàn)“衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象”且無(wú)溶血現(xiàn)象。對(duì)分離到的疑似菌株還必須進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，HPS可分解蔗糖和尿素，不分解乳糖、甘露醇和麥芽糖，對(duì)葡萄糖發(fā)酵不穩(wěn)定，醋酸鉛試驗(yàn)呈陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陽(yáng)性。尹秀鳳等（2004）[5]率先開(kāi)展了HPS的分離與鑒定。細(xì)菌分離鑒定特異性較強(qiáng)，但操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無(wú)法滿足臨床大量樣本快速檢測(cè)的要求。

2 血清學(xué)方法

2.1 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）

Takahashi等（2001）[6]用CF試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)以HPS血清2型和血清5型為抗原的二價(jià)疫苗免疫后的效果，在二次接種19 d后檢測(cè)陽(yáng)性抗體效價(jià)，證實(shí)該方法敏感、特異，但是沒(méi)有評(píng)價(jià)交叉反應(yīng)。CF的參與成分多、影響因素復(fù)雜，雖然HPS在疾病過(guò)后特異性抗體效價(jià)被識(shí)別，但是不同的血清型之間有廣泛的交叉反應(yīng)，無(wú)法區(qū)分待檢HPS血清型。

2.2 間接血凝試驗(yàn)（IHA）

魏子貢等（2006）[7]將HPS血清4型和血清5型分離菌株經(jīng)超聲波破碎處理后的產(chǎn)物致敏醛化綿羊紅細(xì)胞建立IHA方法。應(yīng)用該方法對(duì)免疫豬群的抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，免疫豬群兩周后抗體檢出率達(dá)89%。其敏感性為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）的16倍。石碧等（2007）[8]提取了HPS血清5型菌株的莢膜多糖（CPS），并以之為抗原建立了IHA方法，通過(guò)優(yōu)化CPS產(chǎn)生的最適體外培養(yǎng)條件，得到了高質(zhì)量的抗原，從而使抗體檢測(cè)的敏感性得到了大幅提高。徐引弟等（2011）[9]選用HPS的血清4型、5型和13型3種血清型為抗原建立了IHA方法。IHA雖有較高的敏感性，但特異性不太強(qiáng)，而且操作步驟繁瑣、穩(wěn)定性差，阻礙了其在HPS臨床檢測(cè)上的推廣應(yīng)用。

2.3 平板凝集試驗(yàn)（PAT）

高艷等（2015）[10]利用副豬嗜血桿菌陜西分離株制備平板凝集抗原，用其免疫健康家兔制備血清抗體，建立HPS的平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法，并用此方法對(duì)陜西部分地區(qū)豬場(chǎng)的豬進(jìn)行了HPS血清抗體檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷結(jié)果基本一致。PAT方法具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，常用于評(píng)估HPS疫苗免疫的抗體水平，但該法只能做定性檢測(cè)，且易受檢疫現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境因素影響而出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，因此僅適用于集約化豬場(chǎng)和散養(yǎng)豬HPS的現(xiàn)場(chǎng)檢疫或初步篩查。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA既可以檢測(cè)抗原，也可以檢測(cè)抗體，具有簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)大量樣品，適用于副豬嗜血桿菌病的血清抗體檢測(cè)和血清流行病學(xué)調(diào)查。建立該方法所選擇的包被抗原有滅活全菌體、莢膜多糖、超聲破碎抗原等。王艷等（2006）[11]選用甲醛滅活的全菌體作為包被抗原建立了檢測(cè)HPS抗體的間接ELISA方法，具有較好的試驗(yàn)效果。全菌體抗原制備簡(jiǎn)便，但存在成分復(fù)雜、抗原釋放不全等因素。采用全菌體抗原的陰性本底略微偏高，檢測(cè)結(jié)果不太穩(wěn)定并且經(jīng)常出現(xiàn)假陰性。石碧等（2007）[8]以HPS血清5型菌株的莢膜多糖作為抗原建立了間接ELISA檢測(cè)方法，敏感性是IHA的5～10倍。劉娜（2008）[12]分別以HPS全菌體抗原和超聲波破碎抗原作為包被抗原建立兩種間接ELISA方法，經(jīng)對(duì)四川省和重慶市的4個(gè)豬場(chǎng)的162份血清進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與IHA的符合率分別為98.15%和97.53%。鄭念廣等（2011）[13]將121 ℃高溫高壓處理HPS血清4型和血清5型耐熱蛋白混合作為包被抗原，建立了檢測(cè)HPS抗體的間接ELISA方法。馮小明等（2009）[14]、馬福利等（2015）[15]先后將HPS血清5型分離株菌體超聲裂解，取上清液作ELISA包被抗原，建立了HPS抗體間接ELISA方法，可用于副豬嗜血桿菌病的檢疫和流行病學(xué)調(diào)查。

鑒于全菌體抗原成分復(fù)雜，可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，同時(shí)存在散毒危害。超聲波破碎后的HPS菌體上清液抗原成分盡管沒(méi)有全菌體復(fù)雜，但并不單一。為消除無(wú)關(guān)抗原給間接ELISA方法的抗體檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)不準(zhǔn)確性，研究人員選用抗原成分單一且安全性較好的HPS蛋白作為包被抗原。故近年來(lái)，國(guó)內(nèi)有使用外膜蛋白（OmpP2、OmpP5、OmpP16）、寡肽通透酶蛋白（OppA）和HPS細(xì)胞致死膨脹毒素（CDT）等大腸桿菌表達(dá)的蛋白作為包被抗原建立的ELISA檢測(cè)方法。外膜蛋白OMP是HPS的主要毒力因子之一，是檢測(cè)HPS的候選抗原。李鵬等（2011）[16]、賈愛(ài)卿等（2011）[17]、李淼等（2011）[18]分別以HPS的重組OmpP2作為包被抗原建立間接ELISA方法，成功用于臨床HPS抗體的檢測(cè)。陳善真等（2011）[19]、臧瑩安等（2012）[20]分別利用表達(dá)純化的HPS的OmpP5作為包被抗原，建立了檢測(cè)HPS抗體的間接ELISA方法。宋帥等（2016）[21]以O(shè)mpP5的特異性單克隆抗體作為捕獲抗體、HPS的兔多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立了檢測(cè)HPS抗原的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，可對(duì)臨床樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。鄭新添等（2018）[22]以HPS外膜蛋白OmpP16為包被抗原建立了檢測(cè)HPS抗體的間接ELISA方法。車勇良等（2013）[23]利用HPS重組OppA建立的間接ELISA抗體檢測(cè)方法，具有良好的特異性和穩(wěn)定性。盡管HPS具有多種血清型，但是所有血清型均能合成CDT，該毒素包括3個(gè)亞基CdtA、CdtB和CdtC。劉雙紅等（2016）[24]以CdtB為包被抗原，石保秋（2019）[25]以CdtC為包被抗原，分別建立了檢測(cè)HPS抗體的間接ELISA方法，均獲得較好的臨床檢測(cè)效果。王雷（2011）[26]將OmpP5、CdtA、CdtB、CdtC 4種蛋白混合作為包被抗原，以此建立的間接ELISA方法與全菌體抗原包被的間接ELISA方法之間，抗體檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。應(yīng)用上述蛋白建立的ELISA方法均優(yōu)于全菌體抗原作為包被抗原建立的方法，然而胸膜肺炎放線桿菌有與外膜蛋白OmpP2同源的蛋白（42%～71%氨基酸一致性），大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、多殺性巴氏桿菌和耶爾森菌等都有與的OppA同源的蛋白（55%～57%氨基酸一致性），大腸桿菌有與HPS的CdtB結(jié)構(gòu)和功能相似的同源蛋白（44%氨基酸一致性）。其它適用于包被抗原的HPS蛋白也相繼被報(bào)道。朱曉明等（2015）[27]以錳依賴的超氧化物歧化酶（MSD）作為包被抗原，建立了HPS間接ELISA檢測(cè)方法，但該方法只能保證對(duì)HPS的4、5和12血清型進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。王正皓（2018）[28]以YfeA蛋白為包被抗原，劉俊琦（2020）[29]以Neu蛋白為包被抗原，劉曉露等（2021）[30]以重組表達(dá)的HPS轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白A（TbpA）為包被抗原，分別建立了檢測(cè)HPS抗體間接ELISA方法，其臨床應(yīng)用效果優(yōu)于全菌體抗原包被建立的間接ELISA抗體檢測(cè)方法。黏附素蛋白（Apd）為HPS所特有的一種位于細(xì)菌表面的蛋白，在HPS的15個(gè)血清型菌株和不能分型菌株中都含有該蛋白，而在其他相關(guān)豬的細(xì)菌性病原中沒(méi)有同源或類似蛋白。田楊等（2020）[31]建立了針對(duì)Apd蛋白的ELISA抗體檢測(cè)方法，用于HPS滅活疫苗免疫后的抗體檢測(cè)和HPS疾病的血清檢測(cè)。采用HPS具有高度保守性的主要結(jié)構(gòu)性功能蛋白用于建立間接ELISA抗體檢測(cè)方法，不僅成分單一，避免無(wú)關(guān)抗原干擾結(jié)果的穩(wěn)定性，而且安全性好，不存在散毒的危險(xiǎn)，可成為理想中的包被抗原。

2.5 免疫組化（IHC）

Amano等（1997）[32]利用IHC方法在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織中檢測(cè)到了HPS抗原。IHC方法能夠在HPS受感染組織中直觀地展現(xiàn)出細(xì)菌抗原的存在，但因該方法所使用的多克隆抗體會(huì)與其他細(xì)菌如豬胸膜肺炎放線桿菌等產(chǎn)生交叉反應(yīng)，而在臨床診斷HPS感染時(shí)存在一定的局限性。

3 分子生物學(xué)方法

3.1 PCR

PCR技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了培養(yǎng)困難、血清學(xué)檢測(cè)易發(fā)生交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于HPS病原體的檢測(cè)。林雪玲等（2006）[33]建立的PCR方法不僅可從初代分離培養(yǎng)物中對(duì)HPS進(jìn)行鑒定和感染確診，而且可以直接對(duì)病料進(jìn)行PCR檢測(cè)。米豐泉等（2005）[34]在已經(jīng)建立的豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）、豬多殺性巴氏桿菌（PM）、HPS的單項(xiàng)PCR方法的基礎(chǔ)上，成功地建立了APP、PM、HPS的復(fù)合PCR方法，對(duì)臨床上進(jìn)行這3種疾病的鑒別診斷和混合感染的檢測(cè)都具有重要意義。目前已經(jīng)建立的HPS分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要針對(duì)16S rRNA、infB、OmpP2、PILA、LIPO等基因，其中16S rRNA、infB是最常用的檢測(cè)靶標(biāo)基因。16S rRNA基因在細(xì)菌各種屬之間具有高度保守性，被廣泛用于細(xì)菌之間的種屬鑒定。周勇岐等（2007）[35]、張盼鋒等（2009）[36]、萬(wàn)世平等（2009）[37]、劉建奎等（2012）[38]、馬超鋒等（2017）[39]先后根據(jù)HPS的16S rRNA基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，建立了PCR檢測(cè)方法，可用于臨床快速檢測(cè)HPS。李鵬等（2010）[40]針對(duì)HPS的OmpP2基因設(shè)計(jì)引物建立PCR方法，敏感性達(dá)到了1 000個(gè)HPS。吳靜波等（2016）[41]根據(jù)HPS的P2蛋白基因和豬鼻支原體（Mhr）的P37蛋白基因分別設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，建立HPS和Mhr雙重PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到100 copies，實(shí)現(xiàn)了HPS和Mhr的同時(shí)、快速、準(zhǔn)確診斷，有利于疾病的后續(xù)治療和疫情的控制，為HPS和Mhr的準(zhǔn)確診斷和有效防控了提供有力的技術(shù)支持。梁?jiǎn)痰龋?018）[42]根據(jù)HPS的轉(zhuǎn)錄起始因子infB基因設(shè)計(jì)引物建立PCR方法，能檢測(cè)到的最低DNA濃度為18.1×10-6μg/mL。PILA和LIPO是HPS的外毒素基因。朱新貴等（2018）[43]根據(jù)HPS的16S rRNA、PILA、LIPO基因保守序列和的16S rRNA、KMT1基因保守序列，同時(shí)建立了雙重及多重PCR方法，可用于HPS和PM的臨床快速診斷。

3.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR技術(shù)比PCR具有更高的檢測(cè)特異性與敏感性，而且具有定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于動(dòng)物疫病檢測(cè)。于江等（2010）[44]、苗立中等（2012）[45]先后根據(jù)infB基因序列建立了檢測(cè)HPS的SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法，敏感性是常規(guī)PCR的100倍。羅寶正等（2011）[46]根據(jù)infB基因序列，建立了TaqMan探針熒光定量PCR方法，與細(xì)菌分離方法的檢測(cè)效果一致。李軍等（2011）[47]根據(jù)16S rRNA基因序列建立了快速定量檢測(cè)HPS的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)的最低限度是50 copies/μL。張林海（2012）[48]、崔沛等（2018）[49]先后根據(jù)HPS 16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan-MGB熒光探針，建立了HPS的熒光定量PCR檢測(cè)方法。靈敏度可達(dá)1.98×101copies/μL。李富祥等（2013）[50]根據(jù)HPS的16S rRNA基因建立了TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，其靈敏度為6.92×101copies/μL，可用于HPS感染的早期快速檢測(cè)、定量分析以及流行病學(xué)調(diào)查。姜睿姣等（2019）[51]根據(jù)HPS的OmpP2基因序列和PM的PlpE基因序列分別設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，建立了一種能同時(shí)檢測(cè)HPS和PM的雙重?zé)晒舛縋CR方法。熒光定量PCR方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好、耗時(shí)短，使得其在臨床應(yīng)用上能夠在較短的時(shí)間排查病原，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

3.3 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR是近十年來(lái)興起的第3代PCR技術(shù)，該方法采用直接計(jì)數(shù)目標(biāo)分子數(shù)而不依賴任何校準(zhǔn)物或外標(biāo)，通過(guò)計(jì)數(shù)單個(gè)分子從而實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)具有精準(zhǔn)、靈敏度超高和不易受PCR抑制物影響等優(yōu)點(diǎn)。數(shù)字PCR的建立為HPS檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了新的方法和借鑒。石磊等（2018）[52]根據(jù)HPS的OmpP2基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立了可對(duì)其準(zhǔn)確定量的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）檢測(cè)方法，并與熒光定量PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明ddPCR具有敏感性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，最低可檢測(cè)到2.647 copies/μL的陽(yáng)性質(zhì)粒，靈敏度和實(shí)際檢出率均高于熒光定量PCR，可用于HPS低含量樣品檢測(cè)和定量檢測(cè)。數(shù)字PCR技術(shù)也存在一些不足，如檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)，是熒光定量PCR的2～3倍；檢測(cè)樣本需要稀釋到一定濃度才可檢測(cè)；單個(gè)樣本檢測(cè)成本高于熒光定量PCR，所需儀器設(shè)備昂貴等。

3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)

LAMP技術(shù)是一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、高效、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，非常適合基層的臨床檢測(cè)和進(jìn)出口岸的通關(guān)檢測(cè)。朱杰儀等（2010）[53]、吳詩(shī)敏等（2010）[54]、侯魁等（2017）[55]、劉亞娟等（2018）[56]、李璐璐等（2020）[57]先后根據(jù)HPS的16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物，建立了LAMP方法，檢測(cè)靈敏度是常規(guī)PCR的100倍以上。魏曉媛（2013）[58]根據(jù)OmpP2基因建立了LAMP方法，其最低檢測(cè)DNA量為0.2 pg/μL。車勇良等（2013）[23]根據(jù)HPS肽聚糖相關(guān)脂蛋白（PalA）基因序列設(shè)計(jì)引物，在反應(yīng)后的體系中加入SYBR Green I，建立了可視化LAMP檢測(cè)方法。整個(gè)反應(yīng)只需要在55 ℃水浴1 h即可，反應(yīng)結(jié)束后只需向反應(yīng)液中加入熒光染料，通過(guò)肉眼就能辨別檢測(cè)結(jié)果。Zhang等（2012）[59]根據(jù)infB基因建立了HPS的LAMP方法，檢測(cè)限為10 CFU/mL。Gou等（2018）[60]根據(jù)HPS的wzs5基因建立的交叉引物擴(kuò)增核酸試紙條檢測(cè)方法，60 ℃恒溫反應(yīng)1 h，即可通過(guò)帶有垂直流可視化的反應(yīng)條帶，可對(duì)14 CFU/mL以上的HPS進(jìn)行檢測(cè)。劉博婷等（2018）[61]根據(jù)HPS的infB基因和豬鏈球菌2型（SS2）的Cps2j基因各設(shè)計(jì)1套LAMP引物，建立了HPS與SS2的雙重LAMP檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)兩種病原的同步快速檢測(cè)。李忍等（2021）[62]根據(jù)HPS血清4型脂多糖合成蛋白基因wcip4和血清13型糖脂轉(zhuǎn)移蛋白基因gltP序列設(shè)計(jì)引物，分別建立了快速鑒定HPS血清4型和血清13型的LAMP方法，基因組DNA檢測(cè)限分別為1 pg/μL和2.5 pg/μL。到目前為止，LAMP技術(shù)與PCR方法相比，成本低廉，不需要昂貴的儀器設(shè)備，是檢測(cè)HPS所需時(shí)間最短的一種檢測(cè)方法，但在實(shí)際操作中，由于其靈敏度高，以致開(kāi)蓋后容易造成氣溶膠污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。而且由于LAMP的結(jié)果主要通過(guò)肉眼對(duì)液體的濁度和熒光亮度進(jìn)行判定，存在一定的主觀性，不利于可疑樣品的精確判斷。

3.5 原位雜交（ISH）

Jung等（2004）[63]研發(fā)了ISH方法，應(yīng)用該方法檢測(cè)了HPS的基因組序列。ISH優(yōu)點(diǎn)高于IHC，能夠直接展示出HPS與組織損傷之間的關(guān)系，能避免特異性抗體有效性的問(wèn)題。然而，HPS的16S rRNA基因探針與豬胸膜肺炎放線桿菌極為相似，在檢測(cè)時(shí)可能有交叉反應(yīng)。而且ISH技術(shù)要求高，且需要特定的設(shè)備，價(jià)格昂貴，不適用于開(kāi)展大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查和快速診斷。

4 小結(jié)

隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，副豬嗜血桿菌病的流行越來(lái)越廣泛，已經(jīng)成為呼吸道病綜合征中的重要疾病，對(duì)豬的危害日趨嚴(yán)重。該病防控的關(guān)鍵在于及時(shí)確診并采取相應(yīng)的防治措施。根據(jù)該病的流行病學(xué)特點(diǎn)、主要臨床癥狀及解剖病變作出初步診斷后再結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，可對(duì)該病確診。另外，快速敏感的檢測(cè)技術(shù)不僅對(duì)于及時(shí)采取措施防控疫情蔓延等至關(guān)重要，還能及早發(fā)現(xiàn)新菌株、最終菌株的演化，找出最危險(xiǎn)的病原菌并開(kāi)發(fā)相關(guān)疫苗，在防控疫情時(shí)掌握主動(dòng)。上述HPS的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法多種多樣，技術(shù)在不斷的革新和完善，但是每種方法均具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和實(shí)用性，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適宜的方法。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，HPS的檢測(cè)會(huì)向著更加敏感、特異、快速、簡(jiǎn)便、高效的方向發(fā)展，并在綜合防控與凈化中發(fā)揮重要作用，從而達(dá)到根除疾病的目的。